Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà mentha arvensis l và bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm của tinh dầu thô bạc hà

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam nước nằm vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thời tiết nóng ẩm thuận lợi cho việc phát triển tài nguyên thực vật Cho đến có xấp xỉ 12.000 loài thực vật bậc cao thống kê, số nhiều lồi chứa tinh dầu khai thác để sản xuất tinh dầu dùng mỹ phẩm, dược phẩm phục vụ nhu cầu xuất Cây Bạc hà Mentha arvensis L lồi cho tinh dầu có giá trị kinh tế cao, trồng phổ biến vùng có nhiều phù sa Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nam thuộc miền Bắc Việt Nam đất tốt khí hậu có mùa lạnh với nhiệt độ không thấp, thuận lợi cho Bạc hà mọc quanh năm cho tinh dầu chất lượng tốt Ngoài trồng số tỉnh phía Nam Quảng Nam, Đà Nẵng Tiền Giang Về mặt y học, Bạc Hà xem vị thuốc sử dụng từ nhiều năm để điều trị nhiều bệnh phổ biến như: chữa cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi, đau họng, khản tiếng, kích thích tiêu hóa bệnh đường ruột, sát trùng giảm đau Theo Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam, Bạc Hà có tác dụng kháng khuẩn thí nghiệm in vitro chủng vi khuẩn tả Vibro Choreia Elto, Vibro Choreia Inaba,Vibro Choreia Ogawa Menthol thành phần tinh dầu bạc hà, sử dụng rộng rãi giới làm hương liệu tạo vị the mát nhiều loại thực phẩm, đồ uống mỹ phẩm Ngày nay, đa số sản phẩm kẹo cao su, kem đánh răng, kẹo ngậm,… có mùi Bạc hà thị trường phần lớn sử dụng nguyên liệu tổng hợp phương pháp hóa học sản xuất với số lượng lớn với giá thành thấp Tuy nhiên, chất lượng sống người ngày tăng nhu cầu việc sử dụng chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm bảo vệ sức khỏe môi trường tăng theo Vấn đề đặt để giảm giá thành tinh dầu chiết xuất từ trồng Phương pháp nuôi cấy in vitro, nhiều thập niên xem kỹ thuật hữu hiệu dùng để nhân nhanh giống trồng bệnh tuyển chọn nguồn gene thực vật quý Tuy nhiên phương pháp vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation) gặp số giới hạn, ví dụ giá thành SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cấy mơ chưa đáp ứng yêu cầu người trồng trọt chất lượng tỷ lệ sống cấy mô vườn ươm tương đối thấp, tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn giai đoạn in vitro không nhỏ nguyên nhân gây tổn thất kinh tế làm tăng giá thành giống nuôi cấy mơ gây khó khăn cho ngành nhân giống nước ta Vì thực tiễn mà đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh bạc hà Mentha arvensis L bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân lập từ bình ni cấy mơ bị nhiễm tinh dầu thơ Bạc hà” tiến hành nhằm mục đích góp phần tìm mơi trường thích hợp nhân giống Bạc hà Mentha arvensis L tạo suất cao ứng dụng vào thực tiễn sản xuất bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm tìm hướng giải vấn đề nhiễm vi sinh vật nuôi cấy in vitro, nguyên nhân gây tổn thất mặt kinh tế Mục đích nghiên cứu Đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh bạc hà Mentha arvensis L bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật phân lập từ bình ni cấy mơ bị nhiễm dịch chiết bạc hà” thực nhằm mục đích: - Nghiên cứu hoàn thiện phương pháp nhân giống in vitro bạc hà Mentha arvensis L - Tìm mơi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu cho phát triển bạc hà Mentha arvensis L in vitro - Bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm tìm hướng giải vấn đề nhiễm vi sinh vật nuôi cấy in vitro Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát môi trường ni cấy Bạc hà Mentha arvensis L - Tìm môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu cho phát triển bạc hà Mentha arvensis L in vitro - Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L Phương pháp nghiên cứu Các kết thu nhận xử lý theo phương pháp phân tích phương sai ANOVA Sử dụng phần mềm Statgraphic, phần mềm Microsoft Office Excel 2010® để tính tốn xử lý số liệu SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các kết đạt đề tài Sau tiến hành thử nghiệm thu kết sau:  Mơi trường MS có bổ sung 5% nước dừa môi trường tốt cho nhân nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L  Môi trường MS bổ sung 50g/l đường tốt cho nhân nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện chiếu sáng  Môi trường MS bổ sung 90g/l đường tốt cho nhân nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối  Thể tích tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L tách chiết 5ml cho khả kháng vi khuẩn tôt  Thể tích tinh dầu Bạc hà thương phẩm thể tích 0,5ml; 1ml; 2ml cho khả kháng vi khuẩn tôt Kết cấu Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm chương Chương Tổng quan tài liệu Chương Vật liệu phương pháp Chương Kết thảo luận Chương Kết luận kiến nghị SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tổng quan Bạc hà Châu Á 1.1.1 Giới thiệu Bạc Hà Châu Á Giới : Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Lamioles Họ : Lamiaceae (Hoa môi) Chi : Mentha Loài : Mentha arvensis L Tên khác: Bạc hà Nam - Nhân đơn thảo (Trung Quốc) - Mentha (Pháp) - Hình 1.1 Bạc hà Á Peppermint (Anh) 1.1.2 Nguồn gốc Bạc hà Á Trên giới, Bạc Hà Á trồng chủ yếu Nhật Bản, Brazil, Triều Tiên, Ấn Độ, Thái Lan, Paraguay, vùng Viễn Đông, Trung Á, Tây Bắc Siber Theo Planchon (1882), Nhật Bản người ta trồng Bạc hà Á từ lâu đời, sau đưa trồng Mãn Châu (Đơng Bắc Trung Quốc) Theo Perot (1888), người ta di thực Bạc hà châu Âu vào Nhật Bản mặt công nghiệp người ta ưa trồng Bạc hà địa phương Mentha arvensis Linn Ở Ấn Độ người ta trồng Bạc hà châu Âu vào năm 1881 bang Madras Maysia Bạc hà Á Mentha arvensis L đưa vào trồng tỏ có hương thơm Bạc hà Châu Âu Mentha piperita L Hiện nay, toàn Bạc hà đưa vào trồng phạm vi công nghiệp Ấn Độ Bạc hà Á (Mentha arvensis L.) Những năm cuối thập kỷ 70, Bạc Hà phát triển nhiều 1.1.3 Phân bố sinh thái Việt Nam Ở Việt Nam Bạc hà đưa vào trồng từ tháng 9/1974 giống BH974, tháng 9/1975 giống BH975 Hai loại BH974 BH975 xác định loài M.arvensis Cây Bạc hà trồng nhiều huyện Nghĩa Trai (Hưng Yên), Đại Yên (Hà Nội) Ngoài Bạc hà mọc hoang nhiều Sa Pa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vì (Hà Nội), Bắc Cạn, Sơn La Cây Bạc hà di thực đồng để trồng khơng phát triển Đã có nhiều tỉnh trồng để khai thác tinh dầu ngoại thành Hà Nội, Nam Hà, Thái Bình, Quảng Ninh, Đà Nẵng, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Long An Nhờ đó, từ 1977 nước ta tự túc năm 50 tinh dầu 10 hoạt chất menthol chiết xuất từ tinh dầu (Đỗ Tất Lợi, 1987) Cây Bạc hà Á có hàm lượng menthol cao tới 80 – 90% nên sau chiết lấy bớt menthol ra, tinh dầu lại sử dụng tinh dầu Bạc hà Châu Âu (Sukhmal, 2002) Theo Nguyễn Năng Vịnh (1966), Bạc hà loài đặc biệt ưa ẩm ưa ánh sáng, mọc hoang dại tập trung thành đám nhỏ gần bờ suối hay thung lũng Đất nơi Bạc hà mọc thường có màu nâu đen, tơi xốp giàu chất mùn Cây hoa năm, hình thức tái sinh chủ yếu cách mọc chồi, đẻ nhánh bò lan mặt đất Cây Bạc hà thường trồng cách dâm cành, trước tiên trồng nơi đất có nhiều mùn, sau đến chỗ đất cát Ở miền Nam Bạc hà trồng quanh năm Miền Bắc có vụ: trồng vào tháng – thu hoạch tháng – 7, trồng tháng – thu hoạch tháng – Gần ta nhập loại Bạc hà Nhật Bản thuộc loài Mentha arvensis L Có sản lượng tinh dầu menthol cao Các vùng sản xuất chủ yếu loại Bạc hà 1.1.4 Đặc điểm hình thái Bạc hà Á Cây Bạc hà cỏ, sống lâu năm, cao 10 – 60 cm, thân vuông, mọc đứng hay bò, có phân nhánh, thân có nhiều lơng Lá mọc đối, chéo chữ thập, cuống dài, rộng – 3cm, mép có cưa, mặt mặt có lơng che chở lơng tiết Hoa mọc vòng kẽ lá, màu tím hay hồng nhạt, có màu trắng Mùa hoa tháng – 10, tất thân, cây, lá, hoa có mùi thơm (Savithri Bhat, 2000) SVTH: Nguyễn Thị Thìn Hình 1.2 Hình thái Bạc hà Á ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Rễ Bạc hà: Cấu tạo từ thân ngầm đất Phân bố lớp đất từ 30 – 40 cm phân nhánh rễ phụ Từ đốt ngầm mọc thân khí sinh Thân ngầm khơng chứa tinh dầu Khi phận khí sinh tàn lụi, thân ngầm sống qua đông, đến xuân tiếp tục phát triển thành rễ cho Bạc hà Khi rễ phát triển xong thân ngầm cũ héo chết Thân ngầm khơng có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt, thời gian tạm ngừng sinh trưởng vào khoảng tháng 11 Thân ngầm đối tượng nhân giống vị trí cho tỷ lệ sống cao Thân Bạc hà: thuộc dạng thân thảo, thân tạo thành hình chóp Tán lớn, sản lượng cao Thân cao 0,6 – 1,2m Rỗng ruột già Trên thân có đốt, đốt mọc hai mầm đối xứng rễ bất định Giữa hai đốt lóng, độ dài ngắn lóng phụ thuộc vào giống điều kiện trồng trọt Thân chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỷ lệ tinh dầu Lá Bạc hà: đơn mọc đối chéo chữ thập Cuống ngắn, hình trứng, màu xanh thẫm đỏ tím, xẻ cưa khơng đều, dài – 8cm, rộng – 4cm Hai mặt túi tinh dầu, mặt số lượng nhiều mặt dưới, cấu tạo túi dầu gồm tế bào, tế bào đáy tế bào lại xếp tròn đáy tạo thành khoang trống Khi túi chứa tinh dầu có màng phủ căng, dễ bị vỡ tác động giới Tế bào tiết tinh dầu tăng từ đầu đến cuống từ mép vào Hai mặt có lơng, lơng che chở lơng tiết tinh dầu Lá quan dinh dưỡng quan trọng có nhiệm vụ quang hợp, hơ hấp, nước mang tinh dầu Q trình tổng hợp tích lũy tinh dầu tiến hành đồng thời với trình tổng hợp chất hữu cơ, non trình diễn mạnh Số lượng lớn loại định hàm lượng tinh dầu đạt cao cuối thời kỳ làm nụ trồng Lá nguyên liệu để cất tinh dầu 2,4 – 2,7% tỷ lệ tinh dầu Hoa, hạt Bạc hà: hoa mọc vòng kẽ lá, cánh hoa hình mơi, mơi lõm, mơi tách 3, màu tím, hồng nhạt, có màu trắng Cụm hoa bồng hình chóp Trên hoa có cuống ngắn, đài cánh hợp thành hình chng, có nhị (2 dài, ngắn), bầu chia thành ơ, có nỗn Mặt ngồi đài hoa có lơng bao phủ, có – 6% tỷ lệ tinh dầu Ít thấy hạt Bạc hà, hình bế có ngăn, hạt hình bầu dục màu nâu vàng bé SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.5 Giới thiệu tinh dầu Bạc hà 1.1.5.1 Bản chất tinh dầu Tinh dầu hỗn hợp khác chất bốc nguồn thực vật (rất nguồn động vật), chất thường có mùi thơm thành phần hóa học, cấu tạo, tính chất, điểm chảy, điểm sôi, độ tan nước hay dung môi khác nhau, phần lớn khơng tan, xác hay tan nước Các hợp phần tinh dầu hòa tan lẫn Nếu lượng tinh dầu khối đồng (một pha) bắt đầu sôi nhiệt độ phụ thuộc thành phần tỷ lệ hợp phần 1.1.5.2 Nhu cầu tinh dầu hương liệu Theo số liệu thống kê, năm 2003 Việt Nam xuất 852.000 USD tinh dầu – hương liệu 2.875.000 USD mỹ phẩm chế biến tổng hợp từ tinh dầu – hương liệu loại nhập trở lại với giá trị tương ứng 1.750.000 152.386.000 USD Nhu cầu tinh dầu hương liệu – mỹ phẩm giới tăng nhanh nhu cầu người dân ngày có xu hướng quay trở dùng hợp chất tự nhiên hương liệu – mỹ phẩm, thực phẩm Trung Quốc Ấn Độ quốc gia có sản lượng xuất tinh dầu – hương liệu lớn giới phải nhập thêm tinh dầu xây dựng nhà máy sản xuất đơn hương mỹ phẩm lớn để đáp ứng yêu cầu sử dụng nước xuất Hương liệu sử dụng cho mỹ phẩm thực phẩm hàm chứa tinh dầu loại như: bạc hà, hương nhu, bạch đàn, húng quế, hoắc hương, quế, hồi, sả loại, Ngồi ra, có loại hoi xá xí, hương lau, tràm trà, trầm hương Đây nguồn nguyên liệu để tổng hợp nhiều hợp chất tự nhiên quan trọng cho công nghiệp hương liệu – mỹ phẩm Các hãng dược phẩm giới ngày có nhu cầu nhiều loại tinh dầu chứa chất chưa tổng hợp nhân tạo citronellal, geraniol, citral, Các nghiên cứu cho thấy, nguyên liệu có loại cỏ thực vật phong phú Việt Nam Cả nước có đến 300 lồi tinh dầu thu thập, có đến 50 lồi trồng mang tính sản xuất hàng hóa (Nguồn: VnExpress, 12/2004) 1.1.5.3 Các hợp phần tinh dầu Phần lớn hợp phần tinh dầu có mùi thơm, số có tính chất sinh lý đặc SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP biệt Giá trị hợp phần mặt khác nhau, ví dụ có hợp phần chất định hương vị chủ yếu tinh dầu, có hợp phần khơng đưa lại hương vị chủ yếu lại cần thiết để cố định (giữ) mùi thơm hay cần thiết cho hòa hợp mùi, làm tinh dầu có mùi tinh tế, nhiều nước hoa pha chế cách trộn hợp chất thơm thiên nhiên tổng hợp khơng đạt được, có hợp phần có mùi hay khơng có mùi, chí có hợp phần lại có mùi làm hại hương vị chung cần loại Về mặt hóa học hợp phần chủ yếu thuộc loại hợp chất sau: hydrocarbon (loại hợp phần giá trị nhất, nhiều người ta tìm cách loại ra), rượu este (loại hợp chất phổ biến tinh dầu nguồn mùi thơm quan trọng), phenol ether phenol (hai loại hợp phần quan trọng số tinh dầu, nguồn thơm quan trọng chúng hợp chất dùng số tổng hợp mỹ phẩm), aldehyde ceton (hai loại hợp phần có nhiều tinh dầu có vai trò quan trọng bậc mùi thơm), ngồi có loại hợp chất khác acid tự do, hợp chất nitrogen,… Trong tinh dầu có nhiều hợp phần khác nhau, nhiều hợp phần có hàm lượng nhỏ Mỗi loại tinh dầu có từ vài đến 10 – 20 hợp phần đáng kể mặt hàm lượng hay mặt giá trị sử dụng Trong mẫu khác loại tinh dầu (cùng tên) có nguồn gốc khác nhau, thành phần hàm lượng hợp phần không thiết giống 1.1.5.4 Tinh dầu vật liệu thực vật Tinh dầu chất nguồn thực vật khác tạo thành trình sinh trưởng tích tụ lại hay số phận (như hoa, lá, vỏ, rễ, thân,…), phân bố khơng đồng Tinh dầu tự bên ngồi (vì có nhanh chóng bay hết, khơng tích tụ lại được) mà thường nằm khoảng trống bên tế bào hay túi, hạch tinh dầu, ngăn cách với bên ngồi màng (còn gọi tế bào có tinh dầu hay túi tinh dầu) Những túi tinh dầu ngồi mặt hay nằm bên mơ thực vật Nếu túi nằm ngồi mặt mơ mà màng mỏng manh (như lóng tinh dầu hay hoa có số trường hợp) màng dễ vỡ người ta dễ ngửi thấy mùi tinh dầu Nhưng thường cần tác động để làm vỡ túi không tinh dầu bị giữ lại túi không khuếch tán SVTH: Nguyễn Thị Thìn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.3 Ảnh hưởng đường saccharose lên khả nhân nhanh Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối, sử dụng phương pháp cắt đốt cấy không phân cực sau 12 tuần nuôi cấy NT Số chồi (cây)/mẫu Số (cây/mẫu) Trọng lượng tươi (g) Chiều cao (cm) Số (Lá/cây) Chiều dài (cm) Đường kính (cm) Số rễ (rễ/cây) Chiều dài rễ (cm) Đặc điểm sinh trưởng 4,22a 2,67a 0,5722a 6,61b 21,11a 0,46cd 0,34c 6,33a 2,51d 5,11b 3,56b 0,8018c 6,37b 31,33c 0,44cd 0,34c 7,11a 1,93b 3,89a 3,56b 0,7110b 6,42b 23,56ab 0,34b 0,24b 11,33b 2,21bcd 6,00c 5,78c 0,8217c 6,56b 36,33d 0,48d 0,40d 10,33b 1,33a 3,67a 4,00b 0,7059b 6,39b 26,56b 0,24a 0,14a 11,22b 2,29cd 5,00b 3,44b 0,7846c 5,39a 38,56d 0,42c 0,32c 10,67b 2,02bc Chồi ít, cao, khơng đồng đều, thân mập, trắng nõn, nhỏ, rễ Chồi nhiều, cao, khơng đồng đều, thân mập, trắng nõn, nhiều, nhỏ, rễ Chồi ít, cao, khơng đồng đều, thân nhỏ, trắng nõn, ít, rễ nhiều Chồi nhiều, cao đồng đều, thân nhỏ, trắng nõn, nhiều, nhỏ, rễ nhiều Chồi ít, cao khơng đồng đều, thân nhỏ, trắng nõn, ít, nhỏ, rễ nhiều Chồi nhiều, thấp, đồng đều, thân mập, trắng nõn, nhiều, nhỏ, rễ nhiều C0 C1 C2 C3 C4 C5 Ghi chú:(*) Trong nghiệm cột, số liệu giá trị trung bình kí tự a, b khơng có khác biệt mặt thống kê.Các mẫu tự khác (a,b,…) sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 SVTH: Nguyễn Thị Thìn 68 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng đường saccharose lên khả nhân nhanh Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối sau 12 tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ 30; 50; 70; 90; 110; 130 mg/l Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng đường saccharose lên phát sinh Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối 12 tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ 30; 50; 70; 90; 110; 130 mg/l SVTH: Nguyễn Thị Thìn 69 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.5 Ảnh hưởng đường saccharose lên khả nhân nhanh Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối sau 12 tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ 30; 50; 70; 90; 110; 130 mg/l SVTH: Nguyễn Thị Thìn 70 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6 Ảnh hưởng đường saccharose lên khả nhân nhanh Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối sau 12 tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ 30; 50; 70; 90; 110; 130 mg/l SVTH: Nguyễn Thị Thìn 71 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét thảo luận: Nhìn chung, qua số liệu thể bảng 3.3; đồ thị 3.3; hình 3.5; hình 3.6 ta thấy đường có ảnh hưởng rõ rệt lên mẫu cấy chồi Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối Cụ thể nghiệm thức sau: Ở nghiệm thức C0 bổ sung 30g/l đường saccharose vào mơi trường ni cấy mẫu cấy cho kết phát sinh chồi thấp 4,22 chồi/mẫu, kích thước khơng đồng thể chiều cao chồi 6,61 cm Ở nghiệm thức C1 tăng nồng độ đường lên 50g/l đường saccharose vào môi trường nuôi cấy cho thấy số lượng chồi tăng bắt đầu có tăng lên rõ rệt 5,11 chồi/mẫu, kích thước khơng có khác biệt nhiều so với nghiệm thức C0 Tiếp tục tăng nồng độ đường 70 g/l nghiệm thức D2 số lượng chồi giảm 3,89 chồi/mẫu giảm kích thước chồi khơng có khác biệt so với nghiệm thức C0 Tuy nhiên, lúc số rễ tăng cao 11,33 rễ/mẫu so với nghiệm thức lại Nghiệm thức C3, tiếp tục tăng nồng độ đường 90 g/l cho thấy số lượng chồi đạt kết lớn so với nghiệm thức lại 6,00 chồi/mẫu, kích thước chồi khơng có khác biệt Ở nghiệm thức C4, bổ sung nồng độ đường 110 g/l cho thấy số lượng chồi giảm mạnh, kích thước chồi khơng có thay đổi so với nghiệm thức C0 Nghiệm thức C5, tăng nồng độ đường lên tới 130 g/l cho thấy mẫu cấy khơng có khác biệt nhiều, phát sinh chồi, kích thước chồi khơng thay đổi Qua cho thấy, Bạc hà Mentha arvensis L chịu tác động hàm lượng đường cao Tuy nhiên, sau tuần nuôi cấy Bạc hà Mentha arvensis L thấy tất nghiệm thức bắt đầu xuất việc chết chồi từ chồi phát sinh trước Điều chứng tỏ ánh sáng có vai trò lớn Bạc hà Mentha arvensis L Từ kết thu được, thấy môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L điều kiện tối môi trường MS có bổ SVTH: Nguyễn Thị Thìn 72 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP sung 90g/l đường saccharose Bên cạnh đó, sau nhân nhanh chồi tuần nên chuyển mẫu cấy ánh sáng nhằm cung cấp đầy đủ ánh sáng cho phát triển Sau hoàn tất tất thí nghiệm chúng tơi tiến hành cấy chuyền Bạc hà Mentha arvensis L môi trường tốt mơi trường MS có bổ sung 5% nước dừa Sau tuần nuôi cấy thu kết hình 3.9 dùng làm nguồn nguyên liệu cho việc thu nhận sinh khối để tách chiết tinh dầu Bạc hà Hình 3.9 Cấy chuyền Bạc hà mơi trường MS có bổ sung 5% nước dừa 3.4 Thí nghiệm Khảo sát tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn) tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L tinh dầu thương phẩm a Kết chưng cất tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L nuôi cấy in vitro hiển thị bảng 3.4 SVTH: Nguyễn Thị Thìn 73 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.4 Kết chưng cất tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L nuôi cấy in vitro Khối lượng Bạc hà in vitro (g) Nước cất sử dụng (ml) 104 104 Dung Lượng tinh dịch Bạc dầu Bạc hà hà sau sau chưng lọc (ml) cất (ml) 175 62 Hiệu suất thu nhận (%) Đặc điểm tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L Đặc điểm tinh dầu thương phẩm 35 Màu trắng, sánh nhẹ,có hương thơm đặc trưng tinh dầu Bạc hà Màu trắng, sánh đậm, hương thơm đặc trưng tinh dầu Bạc hà Hình 3.10 Tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L Hình 3.11 Tinh dầu Bạc hà pháp thương phẩm SVTH: Nguyễn Thị Thìn 74 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP b Kết phân lập vi khuẩn từ bình ni cấy mẫu Bạc hà bị nhiễm vi sinh vật Sau 24h nuôi cấy môi trường NA nhiệt độ 37oC chúng tơi thu khuẩn lạc vi khuẩn có đặc điểm sau: khuẩn lạc tròn, đều, lồi, màu trắng sữa Hình 3.12 Vi khuẩn phân lập từ bình ni cấy Bạc hà Mentha arvensis L bị nhiễm sau 24h nuôi cấy môi trường NA 3.4.1 Kết khảo sát tính kháng vi khuẩn tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L tinh dầu Bạc hà thương phẩm Một nghiên cứu công bố họp Hội vi sinh vật học (Edinburg, Irland) cho biết tinh dầu trở thành nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc kháng sinh để chống lại loại vi khuẩn có khả kháng thuốc mạnh Tám loại tinh dầu thực vật thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn nhóm nghiên cứu phát tinh dầu bạc hà có tính kháng khuẩn tốt Do đó, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật (kháng khuẩn) tinh dầu bạc hà Mentha arvensis L tách chiết từ in vitro tinh dầu thương phẩm Sau 24h, thu nhận kết hình 3.13 hình 3.14, hình 3.15 3.4.4.1 Kết khảo sát tính kháng vi khuẩn tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L tách chiết Hình 3.13 Vi khuẩn mơi trường NA khơng bổ sung tinh dầu SVTH: Nguyễn Thị Thìn 75 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.14 Ảnh hưởng tinh dầu Bạc hà mentha arvensis L lên vi khuẩn phân lập từ nuôi cấy mô Bạc hà in vitro Nhận xét thảo luận: Qua hình 3.13; hình 3.14 thấy: Ở nghiệm thức D0, nghiệm thức không bổ sung thể tích tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L số lượng khuẩn lạc mọc dày, nhỏ Ở nghiệm thức D1, D2; D3; D4 bổ sung 0,5; 1; 2; 3; 4ml tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L cho thấy tinh dầu có tính kháng vi khuẩn biểu số khuẩn lạc giảm rõ rệt Ở nghiệm thức D5 tăng thể tích tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L lên 5ml cho thấy tinh dầu Bạc hà Mentha anvensis khơng có số lượng khuẩn lạc mọc mơi trường thạch Từ kết thí nghiệm cho thấy tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L kháng vi khuẩn phân lập từ bình ni cấy mơ bị nhiễm vi sinh vật Điều SVTH: Nguyễn Thị Thìn 76 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu công bố họp Hội vi sinh vật học (Edinburg, Irland) 3.4.4.2 Kết khảo sát tính kháng vi khuẩn tinh dầu Bạc hà thương phẩm Hình 3.15.Ảnh hưởng tinh dầu Bạc hà thương phẩm lên vi khuẩn phân lập từ nuôi cấy mô Bạc hà in vitro Nhận xét thảo luận: Qua hình 3.13; hình 3.8 chúng tơi thấy: Ở nghiệm thức D0, nghiệm thức khơng bổ sung thể tích tinh dầu số lượng khuẩn lạc mọc dày, nhỏ Ở nghiệm thức E1; E2; E3 bổ sung thể tích tinh dầu Bạc hà Mentha anvensis L thương phẩm từ 0,5; 1; ml cho thấy khơng có số lượng khuẩn lạc đĩa petri Điều cho thấy tinh dầu Bạc hà thương phẩm khả kháng vi khuẩn phân lập từ nuôi cấy in vitro Bạc hà bị nhiễm Từ kết thí nghiệm cho thấy tinh dầu thương phẩm có tác dụng tích cực việc kháng vi khuẩn phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm vi sinh vật Điều hồn tồn phù hợp với nghiên cứu cơng bố họp Hội vi sinh vật học (Edinburg, Irland) SVTH: Nguyễn Thị Thìn 77 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ SVTH: Nguyễn Thị Thìn 78 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4.1.Kết luận Từ kết thực nghiệm cho thấy: Nước dừa có tác dụng tích cực Bạc hà Mentha arvensis L kích thích tạo chồi kéo dài lóng thân Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa lên phát sinh chồi Bạc hà Mentha arvensis L cho thấy nồng độ nước dừa 5% tốt cho nhân nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L (nghiệm thức A1) Khi cấy chồi Bạc hà mơi trường có bổ sung nồng độ đường khác điều kiện chiếu sáng kết cho thấy: Ở nghiệm thức bổ sung nồng độ đường 50g/l cho hiệu nhân nhanh chồi Bạc hà tốt (nghiệm thức B1) Trong điều kiện tối việc bổ sung nồng độ đường saccharose 70 g/l vào môi trường nhân giống Bạc hà Mentha arvensis L tốt ( nghiệm thức C3) Bước đầu khảo sát tính kháng vi sinh vật tinh dầu Bạc hà cho thấy: Tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L với nồng độ 5ml kháng vi khuẩn phân lập từ bình ni cấy mơ Bạc hà bị nhiễm vi sinh vật tốt (Nghiệm thức D6) Khi khảo sát tính kháng vi khuẩn tinh dầu Bạc hà thương phẩm nhận thấy: Ở thể tích 0,5; 1; ml tinh dầu thương phẩm cho khả kháng vi khuẩn phân lập từ bình ni cấy mơ Bạc hà bị nhiễm vi sinh vật tốt (nghiệm thức E1; E2; E3) 4.2.Kiến nghị Do điều kiện sở vật chất thời gian có hạn nên chúng tơi chưa tiến hành nghiên cứu chuyên sâu Vì vậy, xin đưa số kiến nghị sau: - Nghiên cứu hoàn thiện phương pháp nhân giống Bạc hà Mertha arvensis L - Nghiên cứu phương pháp tách chiết tinh dầu Bạc hà cho hàm lượng methol tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L cao - Nghiên cứu tạo sẹo Bạc hà Mertha arvensis L SVTH: Nguyễn Thị Thìn 79 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Nghiên cứu điều kiện thích hợp để chuyển Bạc hà Mentha arvensis L vườn ươm - Nghiên cứu khảo sát tính kháng nấm tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L đồng thời phân lập, đinh danh vi sinh vật thường nhiễm nuôi cấy mô bạc hà Mertha arvensis L SVTH: Nguyễn Thị Thìn 80 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu tiếng việt [1] Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh [2] Dương Tấn Nhựt (2007), Cơng nghệ sinh học thực vật (tập 1), nhà xuất nông nghiệp - Tp.Hồ Chí Minh [3] Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi rễ, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh [4] Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, , Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh 2.Tài liệu tiếng anh [1] investigation of the potential antibiofilm activities of plant extracts arlapudi p abraham1., jagarlapudi sreenivas1, tirupati c venkateswarulu1., mikkili indira1 dulla john babu, tella diwakar2, kodali v prabhakar1 [2] Absalon S et al Basal body positioning is controlled by flagellum formation in Trypanosoma brucei PLoS ONE 2007 [3] Frederic coulon et al, Hydrocarbon biodegradation in coastal mudflats: the central role of dynamic tidal biofilms dominated by aerobic hydrocarbonoclastic bacteria and diatoms Appl Environ Microbiol 2012 [4] Costerton JW Stewart PS, Greenberg EP Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections Science [5 ] Donlan RM Microbial life on surfaces Emerg Infect Dis 2002 [6] Dimopoulus G Falagas ME Gram-negative bacilli – resistance issues Touch Briefing 2007 [7] In vitro direct regeneration in mint from different explants on half strength MS medium, Sadia Sarwar1, Muhammad Zia1*, Riaz-ur-Rehman1, Zarrin Fatima1, Riaz Ahmad Sial2 and Muhammad Fayyaz Chaudhary1 1Plant Cell and Tissue Culture Lab, Department of Biotechnology, Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan SVTH: Nguyễn Thị Thìn 81 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 45320 2Agriculture Biotechnology Research Institute, AARI Faisalabad, Pakistan, 2009 Tài liệu internet [1].http://vienduoclieu.org.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1220 %Amentha-arvensis&catid=125%3Acay-thuc&Itemid=178&lang=vi [2].http://duoclieudonghan.com.vn/Nhom-phat-tan-phong-han/Bac-Ha_226_46.html [3] http://www.duoclieuthiennhien.com/b/809-bac-ha.html [4].http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-tach-chiet-va-tim-hieu-tinh-chat-cua-chatkhang-sinh-co-nguon-goc-tu-mot-so-chung-xa-khuan-phan-lap-tai-thai-3088/ [5].http://tai-lieu.com/tai-lieu/khoa-luan-buoc-dau-khao-sat-mat-do-vi-khuan-co-dinhdam-va-ham-luong-tinh-dau-cua-re-co-vetiver-vetiverria-zizanioides-6737/ [6] http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BA%A1c_h%C3%A0_%C3%82u SVTH: Nguyễn Thị Thìn 82 ... thực tiễn mà đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh bạc hà Mentha arvensis L bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân l p từ bình ni cấy mơ bị nhiễm tinh dầu thơ Bạc hà tiến hành nhằm mục đích... nguyên nhân gây tổn thất mặt kinh tế Mục đích nghiên cứu Đề tài Nghiên cứu nhân nhanh bạc hà Mentha arvensis L bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật phân l p từ bình ni cấy mơ bị nhiễm. .. chủng loại Bạc hà mà thành phần tinh dầu l : - Menthola thuộc nhóm Alcol: Bạc hà Âu 40 – 50% Menthola tinh dầu, Bạc hà Á 70 - 90% Menthola tinh dầu - Linalola, Cacvon, Pulegon giống Bạc hà khác Bạc