Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà mentha arvensis l và bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm của tinh dầu thô bạc hà

Menthol là thành phần chính của tinh dầu bạc hà, được sử dụng rộng rãi trên thế giới làm hương liệu chính và tạo vị the mát trong nhiều loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm.. và bước đầu t

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là một nước nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thời tiết nóng ẩm thuận lợi cho việc phát triển tài nguyên thực vật Cho đến nay đã có xấp

xỉ 12.000 loài thực vật bậc cao đã được thống kê, trong số đó nhiều loài chứa tinh dầu

và đã được khai thác để sản xuất tinh dầu dùng trong mỹ phẩm, dược phẩm và phục vụ nhu cầu xuất khẩu

Cây Bạc hà Mentha arvensis L là một loài cho tinh dầu có giá trị kinh tế cao,

đã được trồng phổ biến ở các vùng có nhiều phù sa như Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nam thuộc miền Bắc Việt Nam vì đất tốt và khí hậu có một mùa lạnh với nhiệt độ không quá thấp, thuận lợi cho cây Bạc hà mọc quanh năm và cho tinh dầu chất lượng tốt Ngoài ra cũng được trồng tại một số tỉnh phía Nam như Quảng Nam, Đà Nẵng và Tiền Giang

Về mặt y học, Bạc Hà được xem như là một vị thuốc được sử dụng từ nhiều năm nay để điều trị rất nhiều bệnh phổ biến như: chữa cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi, đau họng, khản tiếng, kích thích tiêu hóa của các bệnh đường ruột, sát trùng giảm đau Theo Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam, Bạc Hà có tác dụng kháng khuẩn trong thí

nghiệm in vitro đối với các chủng vi khuẩn tả Vibro Choreia Elto, Vibro Choreia Inaba,Vibro Choreia Ogawa

Menthol là thành phần chính của tinh dầu bạc hà, được sử dụng rộng rãi trên thế giới làm hương liệu chính và tạo vị the mát trong nhiều loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm Ngày nay, đa số các sản phẩm như kẹo cao su, kem đánh răng, kẹo ngậm,… có mùi Bạc hà trên thị trường phần lớn là sử dụng nguyên liệu tổng hợp bằng phương pháp hóa học vì có thể sản xuất với số lượng lớn với giá thành thấp Tuy nhiên, chất lượng cuộc sống của con người ngày một tăng do đó nhu cầu về việc sử dụng các chất

có nguồn gốc tự nhiên nhằm bảo vệ sức khỏe và môi trường cũng tăng theo Vấn đề đặt ra là làm sao để giảm giá thành tinh dầu chiết xuất từ cây trồng Phương pháp nuôi

cấy in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ thuật hữu hiệu

nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyển chọn hoặc các nguồn gene thực vật quý hiếm Tuy nhiên phương pháp vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation) vẫn còn gặp một số giới hạn, ví dụ như giá thành cây

cấy mô chưa đáp ứng yêu cầu của người trồng trọt do chất lượng và tỷ lệ sống cây cấy

mô ở vườn ươm tương đối còn thấp, cũng như tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn trong giai

đoạn in vitro không nhỏ là một trong những nguyên nhân gây tổn thất về kinh tế và

làm tăng giá thành cây giống nuôi cấy mô gây khó khăn cho ngành nhân giống nước

ta

Vì những thực tiễn như vậy mà đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà Mentha arvensis L và bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm của tinh dầu thô Bạc hà” được tiến hành nhằm mục đích

góp phần tìm ra môi trường thích hợp trong nhân giống cây Bạc hà Mentha arvensis L

tạo năng suất cao ứng dụng vào thực tiễn sản xuất và bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm tìm ra hướng mới trong giải quyết vấn đề nhiễm vi sinh vật

trong nuôi cấy in vitro, một trong những nguyên nhân gây tổn thất về mặt kinh tế

2 Mục đích nghiên cứu

Đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà Mentha arvensis L và bước đầu thử

nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm của dịch chiết bạc hà” được thực hiện nhằm mục đích:

- Nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp nhân giống in vitro cây bạc hà

Mentha arvensis L

- Tìm ra môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự phát triển của cây

bạc hà Mentha arvensis L in vitro

- Bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm tìm ra hướng mới

trong giải quyết vấn đề nhiễm vi sinh vật trong nuôi cấy in vitro

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát môi trường nuôi cấy Bạc hà Mentha arvensis L

- Tìm ra môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự phát triển của cây bạc hà

Mentha arvensis L in vitro

- Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L

4 Phương pháp nghiên cứu

Các kết quả thu nhận được xử lý theo phương pháp phân tích phương sai ANOVA

Sử dụng phần mềm Statgraphic, phần mềm Microsoft Office Excel 2010® để tính toán và xử lý số liệu

5 Các kết quả đạt được của đề tài

Sau khi tiến hành thử nghiệm tôi thu được kết quả như sau:

 Môi trường MS có bổ sung 5% nước dừa là môi trường tốt nhất cho sự nhân

nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L

 Môi trường MS bổ sung 50g/l đường là tốt nhất cho sự nhân nhanh chồi Bạc hà

Mentha arvensis L trong điều kiện chiếu sáng

 Môi trường MS bổ sung 90g/l đường là tốt nhất cho sự nhân nhanh chồi Bạc hà

Mentha arvensis L trong điều kiện tối

 Thể tích tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L tách chiết 5ml cho khả năng kháng

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Vật liệu và phương pháp

Chương 3 Kết quả và thảo luận

Chương 4 Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Loài : Mentha arvensis L

Tên khác: Bạc hà Nam - Nhân đơn thảo

(Trung Quốc) - Mentha (Pháp) -

Peppermint (Anh)

1.1.2 Nguồn gốc Bạc hà Á

Trên thế giới, Bạc Hà Á được trồng chủ yếu ở Nhật Bản, Brazil, Triều Tiên, Ấn

Độ, Thái Lan, Paraguay, vùng Viễn Đông, Trung Á, Tây và Bắc Siber

Theo Planchon (1882), ở Nhật Bản người ta trồng Bạc hà Á từ rất lâu đời, sau

đó đưa trồng ở Mãn Châu (Đông Bắc Trung Quốc)

Theo Perot (1888), mặc dù người ta đã di thực được Bạc hà châu Âu vào Nhật Bản nhưng về mặt công nghiệp người ta vẫn ưa trồng Bạc hà địa phương Mentha arvensis Linn

Ở Ấn Độ đầu tiên người ta trồng Bạc hà châu Âu vào năm 1881 ở các bang

Madras và Maysia Bạc hà Á Mentha arvensis L được đưa vào trồng tỏ ra có hương thơm hơn Bạc hà Châu Âu Mentha piperita L Hiện nay, toàn bộ Bạc hà được đưa vào trồng trên phạm vi công nghiệp ở Ấn Độ là Bạc hà Á (Mentha arvensis L.)

Những năm cuối thập kỷ 70, Bạc Hà được phát triển nhiều nhất

1.1.3 Phân bố sinh thái ở Việt Nam

Ở Việt Nam cây Bạc hà được đưa vào trồng từ tháng 9/1974 là giống BH974, tháng 9/1975 là giống BH975 Hai loại BH974 và BH975 được xác định là loài

M.arvensis

Cây Bạc hà được trồng nhiều ở các huyện Nghĩa Trai (Hưng Yên), Đại Yên (Hà Nội) Ngoài ra Bạc hà mọc hoang nhiều ở Sa Pa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba

Vì (Hà Nội), Bắc Cạn, Sơn La Cây Bạc hà được di thực về đồng bằng để trồng nhưng không phát triển được Đã có nhiều tỉnh trồng để khai thác tinh dầu như ngoại thành

Hà Nội, Nam Hà, Thái Bình, Quảng Ninh, Đà Nẵng, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Long An

Nhờ đó, từ 1977 nước ta đã tự túc được mỗi năm 50 tấn tinh dầu và 10 tấn hoạt chất menthol chiết xuất từ tinh dầu (Đỗ Tất Lợi, 1987)

Cây Bạc hà Á có hàm lượng menthol cao tới 80 – 90% nên sau khi chiết lấy bớt menthol ra, tinh dầu còn lại vẫn được sử dụng như tinh dầu cây Bạc hà Châu Âu (Sukhmal, 2002)

Theo Nguyễn Năng Vịnh (1966), Bạc hà là loài cây đặc biệt ưa ẩm và ưa ánh sáng, mọc hoang dại và tập trung thành những đám nhỏ gần bờ suối hay trong thung lũng Đất nơi Bạc hà mọc thường có màu nâu đen, tơi xốp và giàu chất mùn Cây ra hoa hằng năm, nhưng hình thức tái sinh chủ yếu vẫn bằng cách mọc chồi, đẻ nhánh bò lan trên mặt đất

Cây Bạc hà thường được trồng bằng cách dâm cành, trước tiên trồng ở nơi đất

có nhiều mùn, sau đến chỗ đất cát Ở miền Nam Bạc hà có thể trồng được quanh năm Miền Bắc có 2 vụ: trồng vào tháng 2 – 3 thu hoạch tháng 6 – 7, trồng tháng 8 – 9 thu hoạch tháng 2 – 3 Gần đây ta đã nhập một loại Bạc hà Nhật Bản cũng thuộc loài

Mentha arvensis L Có sản lượng tinh dầu và menthol khá cao Các vùng sản xuất hiện

nay chủ yếu là loại Bạc hà này

1.1.4 Đặc điểm hình thái Bạc hà Á

Cây Bạc hà là cây cỏ, sống lâu năm, cao 10 – 60

cm, thân vuông, mọc đứng hay hơi bò, có khi

phân nhánh, trên thân và lá có nhiều lông Lá mọc

đối, chéo chữ thập, cuống dài, rộng 2 – 3cm, mép

có răng cưa, mặt trên và mặt dưới đều có lông che

chở và lông bài tiết Hoa mọc vòng ở kẽ lá, màu

tím hay hồng nhạt, có khi màu trắng Mùa hoa

tháng 7 – 10, tất cả thân, cây, lá, hoa đều có mùi

thơm (Savithri Bhat, 2000)

Hình 1.2 Hình thái Bạc hà Á

Rễ Bạc hà: Cấu tạo từ thân ngầm dưới đất Phân bố lớp đất từ 30 – 40 cm phân nhánh như rễ phụ Từ các đốt ngầm mọc thân khí sinh Thân ngầm không chứa tinh dầu Khi bộ phận khí sinh tàn lụi, thân ngầm vẫn sống qua đông, đến xuân tiếp tục phát triển thành bộ rễ và cho cây Bạc hà mới Khi cây và rễ phát triển xong thân ngầm

cũ héo và chết Thân ngầm không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt, thời gian tạm ngừng sinh trưởng vào khoảng tháng 11 Thân ngầm là đối tượng nhân giống và vị trí giữa cho tỷ

lệ sống cao nhất

Thân Bạc hà: thuộc dạng thân thảo, thân chính và lá tạo thành hình chóp Tán càng lớn, sản lượng càng cao Thân chính cao 0,6 – 1,2m Rỗng ruột khi già Trên thân

có đốt, mỗi đốt mọc hai mầm đối xứng nhau và các rễ bất định Giữa hai đốt là lóng,

độ dài ngắn của lóng phụ thuộc vào các giống và điều kiện trồng trọt Thân chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỷ lệ tinh dầu

Lá Bạc hà: lá đơn mọc đối chéo chữ thập Cuống lá ngắn, hình trứng, màu xanh thẫm có thể đỏ tím, xẻ răng cưa không đều, dài 4 – 8cm, rộng 2 – 4cm Hai mặt lá là các túi tinh dầu, mặt trên số lượng nhiều hơn mặt dưới, cấu tạo một túi dầu gồm 9 tế bào, 1 tế bào đáy 8 tế bào còn lại xếp tròn trên đáy tạo thành một khoang trống Khi túi chứa tinh dầu có màng phủ căng, dễ bị vỡ dưới tác động cơ giới Tế bào tiết tinh dầu tăng từ đầu lá đến cuống lá và từ mép lá vào giữa lá Hai mặt đều có lông, lông che chở và lông tiết tinh dầu Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất có nhiệm vụ quang hợp, hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu Quá trình tổng hợp và tích lũy tinh dầu trong lá tiến hành đồng thời cùng với quá trình tổng hợp chất hữu cơ, ở trong

lá non quá trình này diễn ra mạnh hơn Số lượng lớn nhất các loại lá này quyết định hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất ở cuối thời kỳ làm nụ của cây trồng Lá là nguyên liệu chính để cất tinh dầu 2,4 – 2,7% tỷ lệ tinh dầu

Hoa, quả và hạt Bạc hà: hoa mọc vòng ở kẽ lá, cánh hoa hình môi, môi trên lõm, môi dưới tách là 3, màu tím, hồng nhạt, có khi màu trắng Cụm hoa bồng hình chóp Trên hoa có cuống ngắn, 5 đài cánh hợp thành hình chuông, có 4 nhị (2 dài, 2 ngắn), bầu chia thành 4 ô, mỗi ô có một noãn Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ, có 4 – 6% tỷ lệ tinh dầu Ít khi thấy quả và hạt của Bạc hà, quả hình bế có 4 ngăn, hạt hình bầu dục màu nâu vàng rất bé

1.1.5 Giới thiệu về tinh dầu Bạc hà

1.1.5.1 Bản chất của tinh dầu

Tinh dầu là những hỗn hợp khác nhau của những chất bốc hơi nguồn thực vật

(rất ít khi nguồn động vật), các chất này thường có mùi thơm và thành phần hóa học,

cấu tạo, tính chất, điểm chảy, điểm sôi, độ tan trong nước hay trong các dung môi rất

khác nhau, phần lớn không tan, chính xác là ít hay rất ít tan trong nước Các hợp phần

của tinh dầu hòa tan lẫn nhau Nếu một lượng tinh dầu nào đó là một khối đồng nhất

(một pha) bắt đầu sôi ở một nhiệt độ phụ thuộc thành phần và tỷ lệ các hợp phần

1.1.5.2 Nhu cầu về tinh dầu hương liệu

Theo số liệu thống kê, năm 2003 Việt Nam xuất khẩu được 852.000 USD tinh

dầu – hương liệu và 2.875.000 USD mỹ phẩm chế biến tổng hợp từ tinh dầu – hương

liệu các loại nhưng đã nhập khẩu trở lại với giá trị tương ứng là 1.750.000 và

152.386.000 USD

Nhu cầu về tinh dầu và hương liệu – mỹ phẩm trên thế giới tăng nhanh do nhu

cầu người dân ngày càng có xu hướng quay trở về dùng những hợp chất tự nhiên trong

hương liệu – mỹ phẩm, thực phẩm Trung Quốc và Ấn Độ là 2 quốc gia có sản lượng

và xuất khẩu tinh dầu – hương liệu lớn nhất thế giới nhưng hiện nay cũng phải nhập

thêm tinh dầu vì đã xây dựng những nhà máy sản xuất đơn hương và mỹ phẩm lớn để

đáp ứng yêu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu

Hương liệu sử dụng cho mỹ phẩm và thực phẩm hàm chứa trong tinh dầu các loại như:

bạc hà, hương nhu, bạch đàn, húng quế, hoắc hương, quế, hồi, sả các loại, Ngoài ra, còn có những loại hiếm hoi như xá xí, hương lau, tràm trà, trầm hương Đây

là nguồn nguyên liệu cơ bản để tổng hợp ra nhiều hợp chất tự nhiên quan trọng cho

công nghiệp hương liệu – mỹ phẩm Các hãng dược phẩm trên thế giới ngày càng có

nhu cầu nhiều loại tinh dầu chứa các chất chưa được tổng hợp nhân tạo như citronellal,

geraniol, citral, Các nghiên cứu cho thấy, những nguyên liệu này đều đang có trong

các loại cây cỏ thực vật phong phú của Việt Nam Cả nước có đến 300 loài cây tinh

dầu đã được thu thập, trong đó có đến 50 loài cây đã được trồng mang tính sản xuất

hàng hóa (Nguồn: VnExpress, 12/2004)

1.1.5.3 Các hợp phần của tinh dầu

Phần lớn các hợp phần của tinh dầu có mùi thơm, một số có tính chất sinh lý đặc

biệt Giá trị của các hợp phần về từng mặt rất khác nhau, ví dụ có hợp phần là chất quyết định hương vị chủ yếu của tinh dầu, có hợp phần không đưa lại hương vị chủ yếu nhưng lại rất cần thiết để cố định (giữ) mùi thơm hay cần thiết cho sự hòa hợp mùi, làm tinh dầu có mùi rất tinh tế, nhiều khi các nước hoa pha chế bằng cách trộn các hợp chất thơm thiên nhiên tổng hợp không sao đạt được, có hợp phần có rất ít mùi hay không có mùi, thậm chí có hợp phần lại có mùi làm hại hương vị chung cần loại

đi

Về mặt hóa học các hợp phần chủ yếu thuộc các loại hợp chất sau: các hydrocarbon (loại hợp phần ít giá trị nhất, nhiều khi người ta tìm cách loại ra), các rượu este (loại hợp chất rất phổ biến của các tinh dầu và là nguồn mùi thơm quan trọng), các phenol và ether của phenol (hai loại hợp phần quan trọng của một số tinh dầu, nguồn thơm quan trọng của chúng và là những hợp chất được dùng trong một số tổng hợp các mỹ phẩm), các aldehyde và các ceton (hai loại hợp phần cũng có nhiều trong tinh dầu và có vai trò quan trọng bậc nhất trong mùi thơm), ngoài ra còn có loại hợp chất khác như các acid tự do, các hợp chất nitrogen,… Trong mỗi tinh dầu có rất nhiều hợp phần khác nhau, nhưng nhiều hợp phần có hàm lượng rất nhỏ Mỗi loại tinh dầu có từ vài đến 10 – 20 hợp phần đáng kể về mặt hàm lượng hay về mặt giá trị sử dụng Trong các mẫu khác nhau của cùng một loại tinh dầu (cùng tên) nhưng có nguồn gốc khác nhau, thành phần và hàm lượng các hợp phần cũng không nhất thiết giống nhau

1.1.5.4 Tinh dầu trong vật liệu thực vật

Tinh dầu cũng như các chất nguồn thực vật khác được tạo thành trong quá trình sinh trưởng của cây và tích tụ lại trong một hay một số bộ phận của cây (như hoa, lá,

vỏ, rễ, thân,…), phân bố không đồng đều Tinh dầu rất ít khi tự do ở bên ngoài (vì nếu

có nó sẽ nhanh chóng bay hơi hết, không tích tụ lại được) mà thường nằm ở các khoảng trống bên trong tế bào hay ở các túi, các hạch tinh dầu, ngăn cách với bên ngoài bằng một màng (còn gọi là tế bào có tinh dầu hay túi tinh dầu) Những túi tinh dầu có thể ở ngoài mặt hay nằm bên trong mô thực vật Nếu túi nằm ngoài mặt mô mà màng mỏng manh (như các lóng tinh dầu trên lá hay hoa có trong một số trường hợp) thì màng này rất dễ vỡ ra và người ta dễ ngửi thấy mùi tinh dầu Nhưng thường thì cần một tác động để làm vỡ túi nếu không tinh dầu bị giữ lại trong túi không khuếch tán ra

được Trong túi, tinh dầu lẫn với nước, túi lại nằm trong mô thực vật có nước, đều này

ảnh hưởng đến việc chưng cất tinh dầu

1.1.5.5 Thành phần hóa học của tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L

Là một chất lỏng có màu vàng nhạt, mùi Bạc hà, nóng bỏng và có vị tê; thu được bằng cách chưng cất lôi cuốn hơi nước lá Bạc hà Thành phần, tính chất của tinh dầu Bạc hà tùy thuộc vào giống, đất đai, khí hậu Hiện nay loại tinh dầu Bạc hà tốt nhất là của Nhật Bản

Tinh dầu Bạc hà là hỗn hợp phức tạp của rất nhiều chất hóa học khác nhau như: Hydratecarbon, Alcolphenol, Aldehyde, Ceton, … tùy từng chủng loại Bạc hà mà thành phần chính của tinh dầu có thể là:

- Menthola thuộc nhóm Alcol: Bạc hà Âu 40 – 50% Menthola trong tinh dầu, Bạc hà Á 70 - 90% Menthola trong tinh dầu

- Linalola, Cacvon, Pulegon ở các giống Bạc hà khác như ở Bạc hà xanh, ba hợp chất này thay thế cho Menthola

- Flavonoid ở Bạc hà cay

Ngoài thành phần chính là Menthola, tinh dầu còn chứa ceton, Mentol (6 - 18%), Aldehyde acetic, Aldehyde isovalerianic, rượu amilic, acid acetic, mentofuran… Trong một số trường hợp tinh dầu còn chứa cả dimetila sulfur được tạo thành trong quá trình chưng cất từ lá và làm cho tinh dầu có mùi khó chịu

Tinh dầu có chất lượng cao là kết quả của sự kết hợp hài hòa giữa các thành phần Menthola, Menthol, Metilacetate và chia các thành phần của tinh dầu ra 4 nhóm chính:

- Hợp chất không terpen: có phân tử thấp, chiếm 2% trong tinh dầu, chủ yếu là amilic (amilic và isoamilic) Chúng quyết định mùi thơm đặc trưng của tinh dầu Ngoài ra còn có acetaldehyde, isovalerandehyde, femilacetaldehyde

- Hydratecarbon terpen: 4% trong tinh dầu gồm xineola (2%), dipenten, limonen, beta-pinem, camfen, beta-micxen, aximen, gamatecpimen và para-ximola

- Hợp chất terpen có chứa oxy: 85% trong tinh dầu, chủ yếu là menthola, monthle, mentilacetate, mentofuran và một lượng nhỏ neomentola, hydrate xabinen và các terpenceton (piperiton và oxylacton terpen)

- Hợp chất secquiterpen: 3% trong tinh dầu chủ yếu là hydratcarbon, cariofilen đồng dạng

Ngoài ra còn có acid béo tự do, fenola và các chất trùng hợp khác Lượng chất này tùy thuộc vào phương pháp chưng cất và bảo quản tinh dầu

1.1.6 Sự sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà

Bạc hà có 4 giai đoạn sinh trưởng và phát triển

và sau đó không kích thích được mầm phát triển Vì vậy xác định thời vụ trồng và vấn

đề quan trọng, giúp Bạc Hà mới trồng có đủ độ ẩm để phát triển

1.1.6.2 Thời kỳ phân cành

Sự phân cành diễn ra theo trình tự sau: tại đốt gốc thân chính, đuôi lá có mầm mọc lên và dần lên ngọn Các cành gần ngọn ra muộn và có độ dài càng ngắn dần Do đó cây có dạng hình nón

Thời gian này tốc độ sinh trưởng và khối lượng chất xanh của cây tăng mạnh Đây là thời kỳ quyết định năng suất của Bạc hà Cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dưỡng, ánh sáng, nước để cây phát triển hết mức về thân, cành, lá tạo năng suất cao

1.1.6.3 Thời kỳ làm nụ

Kéo dài 10 – 15 ngày, tốc độ ra lá của cây ở giai đoạn này chậm lại rồi dừng hẳn Tuy nhiên cây vẫn tiếp tục tăng nhanh về kích thước của thân lá và trọng lượng cũng như tỷ lệ tinh dầu

Giai đoạn này yêu cầu về đạm của cây giảm nhưng lại cần nhiều lân Thời điểm này khối lượng chất xanh và tích lũy tinh dầu của cây tiếp tục tăng lên do đó các điều kiện ngoại cảnh nhất là độ ẩm, ánh sáng cây cần là cao nhất trong các thời kỳ

1.1.6.4 Thời kỳ hoa nở

Hoa Bạc hà nở kiểu vô hạn Hoa cành chính nở trước, sau đó theo thứ tự cành nào ra trước thì nở trước, hoa nở từ gốc lên ngọn Đây là thời kỳ Bạc hà đạt khối lượng chất xanh và tinh dầu cao nhất (280kg hữu cơ/ ha/ ngày)

Khi hoa nở 50% là lúc hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất, Bạc hà ngừng sinh trưởng Đây là thời điểm thu hoạch Nếu thu hoạch muộn (100% hoa đã nở), lá đã rụng nhiều thì làm giảm năng suất và hàm lượng tinh dầu

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng

Bạc hà là cây phân bố, thích nghi rộng Có năng suất cao từ vùng mây mù ẩm ướt của nước anh đến vùng cận nhiệt đới nhiều ánh sáng như ở bungari, grime và karasnoda (Liên Xô cũ) Nói chung Bạc hà là cây dễ thuần hóa, thích nghi với điều kiện khác nhau

Các điều kiện sinh thái cụ thể cho cây Bạc hà là:

+ Nếu nhiệt độ trung bình ngày là 18 – 19 oC thì cây cần 80 – 90 ngày sinh trưởng + Nếu nhiệt độ thấp hơn 15 – 16 oC thì thời gian sinh trưởng kéo dài 90 – 100 ngày Nếu nhiệt độ thấp hơn nữa tức là thời gian sinh trưởng dài hơn, cây sẽ gặp mùa thu ngày ngắn nên không thể ra hoa dẫn đến chất lượng, hàm lượng tinh dầu giảm

- Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân bố của các giống Bạc hà Ví dụ Bạc hà Âu đen và trắng có yêu cầu về chế độ nhiệt khác nhau (chủng Bạc hà trắng đòi hỏi nhiệt độ cao hơn chủng Bạc hà đen) Do vậy khả năng phân bố của Bạc hà tùy vào từng loại là khác nhau

- Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ tinh dầu và hàm lượng mentol trong tinh dầu Nếu nhiệt độ cao từ 28 – 30oC sẽ làm tăng tỷ lệ tinh dầu và hàm lượng mentol trong tinh dầu Tuy nhiên, nhiệt độ cao trên 30oC và gió nhiều sẽ làm giảm tỷ lệ tinh dầu do quá trình biến thành nhựa bay hơi của tinh dầu, đồng thời giảm chất lượng tinh dầu, giảm hàm lượng Menthola Ngoài ra sự thay đổi đột ngột chế độ nhiệt làm cây mẫn cảm hơn với bệnh gỉ sắt

1.1.7.2 Độ ẩm

Độ ẩm trong đất thích hợp nhất là 80% Cây có bộ rễ ăn nông và kém phát triển Sức hút và giữ nước kém, mẫn cảm với hạn hán Nếu hạn liên tục cây sẽ bị chết Ngược lại nếu độ ẩm cao trong suốt thời kỳ sinh trưởng thì năng xuất chất xanh đạt cực đại nhưng hàm lượng tinh dầu lại giảm Do đó, trước thu hoạch 7 – 10 ngày giảm độ ẩm đất xuống dưới 50% có tác dụng làm giảm chất xanh, tăng tỷ lệ tinh dầu

Thời kỳ từ mọc đến phân cành cây Bạc hà rất cần nước Do đó cần bảo đảm độ ẩm cho cây trong giai đoạn này Khi có độ ẩm cao cần bón phân đầy đủ mới đạt hiệu quả kinh tế (độ ẩm cao không làm giảm chất lượng tinh dầu)

Thời kỳ khủng hoảng về độ ẩm xuất hiện khi cây bắt đầu ra nụ đến hết thời gian sinh trưởng

Ảnh hưởng của độ ẩm không khí tương tự như độ ẩm đất

Trong điều kiện ngày dài (14 – 16 giờ chiếu sáng) cây chuyển từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực và nở hoa sớm

Trong điều kiện thời gian chiếu sáng 8 – 10 giờ trong ngày làm cây không thể chuyển giai đoạn được Cành gốc chuyển thành thân ngầm, năng xuất chất xanh giảm,

tỷ lệ thân ngầm tăng

Những nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây cho biết nếu giảm thời gian chiếu sáng xuống 10 giờ và giảm cường độ chiếu sáng, đều dẫn đến cây sinh trưởng phát triển không bình thường, năng xuất chất xanh giảm rõ rệt Ngày đủ dài, nhiệt độ cao, trời râm sẽ làm tăng kích thước của lá dẫn đến

tỷ lệ tinh dầu tăng nhưng tỷ lệ giữa lá và chất xanh giảm do có hiện tượng rụng lá Thời gian chiếu sáng giảm quá nhiều khiến 50% số lá bị rụng trước khi nở hoa

Khi trồng Bạc hà cần lưu ý chế độ ánh sáng hợp lý cho cây Mật độ vừa phải, không nên trồng xen cây cạnh tranh ánh sáng để đạt được năng xuất chất xanh và tinh dầu cao

1.1.7.4 Dinh dưỡng

Cây Bạc hà cần khối lượng lớn các chất dinh dưỡng ở dạng dễ tiêu bởi bộ phận thứ sinh tăng nhanh trong thời gian sinh trưởng tương đối ngắn và bộ rễ phân bố nông Vai trò của các nguyên tố dinh dưỡng:

- Nitrogen (N): các kết quả nghiên cứu cho thấy N có tác dụng lớn nhất là tăng khối lượng chất xanh, trên cơ sở ấy làm tăng năng xuất tinh dầu Mặt khác bón N sẽ kéo dài thêm thời gian sinh trưởng làm tăng chiều cao cây, tăng số cành và số lá do đó tăng năng xuất chất xanh Dạng đạm ammonium nitrate làm cây phát triển tốt hơn đạm ở dạng nitrate

- Lân (P): giúp cây sinh trưởng tốt, hệ thống rễ phát triển, tăng khả năng phân cành, xúc tiến quá trình làm nụ, nở hoa Tiến hành quá trình trao đổi chất và năng lượng, xúc tiến các hoạt động sinh lý đặc biệt là quang hợp và hô hấp là cơ sở cho việc tăng năng xuất, chất lượng tinh dầu và mentol

- Potossium (K): có vai trò sinh lý cực kỳ quan trọng Nó làm tăng hoạt động sống diễn

ra trong tế bào, điều chỉnh quá trình trao đổi nước, đồng hóa CO2, tăng khả năng chống chịu của cây, điều chỉnh các chất hữu cơ tích lũy về các cơ quan làm tăng năng suất chất xanh Tuy nhiên hiệu quả của K kém hơn của N và P Sự có mặt của nguyên tố K làm giảm đáng kể tỷ lệ tinh dầu Vì K có trong cây bạc hà đã thúc đẩy quá trình oxy hóa khử, giảm lượng tích trử tinh dầu Do đó phải lưu ý bón cân đối NPK, tránh bón thừa K đặc biệt ở giai đoạn cuối

Nhu cầu dinh dưỡng của Bạc hà qua từng thời kỳ sinh trưởng là không giống nhau Khi mới mọc cây chứa N và K nhiều nhất, P ít nhất trong thời kỳ cuối N và K đều giảm mặc dù trong các thời kỳ này khối lượng hai chất đó cây hấp thụ tăng lên, khối lượng chất xanh cũng tăng nhiều hơn Vì thế yêu cầu về dinh dưỡng cho cây Bạc hà trong suốt quá trình sinh trưởng hầu như không đổi

Ngoài ra nguyên tố vi lượng cũng rất quan trọng với cây Bạc hà Nó hoạt hóa hệ thống enzyme, thay đổi đặc tính lý hóa và tính chống chịu của cây

1.1.7.5 Đất

Bạc hà ưa đất tơi xốp, thoát nước, thành phần cơ giới nhẹ, giàu mùn Thích hợp nhất

là đất phù sa ven sông, đất đen, đất than bùn, đất có tầng canh tác dày

Nếu trồng trên đất không có cấu tượng, đất sét, đất cát thì hàm lượng tinh dầu thấp

và chất lượng kém, nghèo mentola và các este

Bạc hà sinh trưởng tốt ở pH = 5 – 7 Chủng Bạc hà đen sống ở pH = 5 Chủng Bạc hà trắng yêu cầu pH = 7

Chú ý làm đất kỹ, bón phân đầy đủ, nhất là đạm lân và tưới tiêu hợp lý

1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây Bạc hà trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây Bạc hà trên thế giới

Cây Bạc hà được con người biết đến và sử dụng từ rất lâu đời Bạc hà được xem

là thảo dược xưa nhất thế giới, với những bằng chứng khảo cổ cho thấy nó đã được sử dụng làm thuốc khoảng 10.000 năm về trước Người La Mã, Do Thái, Ai Cập, Trung Quốc, Nhật Bản là những dân tộc đầu tiên biết sử dụng cây Bạc hà

Bạc hà có nguồn gốc từ tây châu Âu và Xibia Từ nước Anh qua vùng Bắc Âu đến vùng thấp của châu Âu thuộc Liên Xô (cũ) Nước Anh trồng Bạc hà từ năm 1840, tuy nhiên hiện nay cây Bạc hà trồng ở Anh với diện tích không đáng kể

Ở Mỹ, người ta trồng Bạc hà tập trung ở bang Washington, Oregon và Wisconsin Tinh dầu Bạc hà sản xuất tại Mỹ là một trong những loại tốt nhất thế giới

Nhật Bản trồng Bạc hà cuối thế kỷ 19 Sản xuất Bạc hà của Nhật chỉ tập trung ở Khondo Sang thế kỷ 20, việc trồng Bạc hà lan mạnh sang các vùng mới (Uzen, Xinao, Amato, Hirosima,…) sự phát triển mạnh mẽ cây Bạc hà trong thời kỳ này đã đưa Nhật Bản lên vị trí hàng đầu thế giới về sản xuất tinh dầu Năm 1914, 50% tinh dầu Bạc hà của thế giới được sản xuất ra tại Nhật Bản và vùng sản xuất hiện nay là đảo Hokaido Tinh dầu Bạc hà của Nhật Bản mặc dù giàu Menthola, nhưng chất lượng không cao, có mùi hắc, vị đắng, vì vậy thường dùng để lấy Menthola Trung Quốc trồng Bạc hà tập trung ở một số tỉnh phía nam

Khoảng 50 năm trở lại đây, nhu cầu tinh dầu trên thế giới bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố Nhu cầu về nguyên liệu cho gia vị và nước hoa tăng lên một cách tự nhiên theo đà tăng của dân số thế giới, đặc biệt là nguyên liệu tạo hương vị thực phẩm

Ở đây còn phải kể đến sự thay đổi thị hiếu ở phương tây Vấn đề an toàn thực phẩm

(không chứa chất gây hại trước mắt và lâu dài) đã làm cho người tiêu dùng có xu hướng sử dụng những thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Trong thời gian này thói quen về ăn uống cũng đã thay đổi Một mặt, sự giao lưu quốc tế gia tăng dẫn đến hiện tượng sử dụng nhiều thức ăn nước ngoài, sử dụng ngày càng nhiều rau thơm và gia vị Mặt khác, ngày càng có nhiều loại thức ăn nhanh hoặc thực phẩm chuẩn bị sẵn được ướp với tinh dầu

Ở một số nước, sự khuyến khích trồng cây tinh dầu được coi là chính sách kinh

tế của chính phủ Ở Pháp, sự phát triển trong việc trồng cây tinh dầu được kết hợp chặt chẽ trong những nhóm trang trại Kết quả là trong 20 năm gần đây, người ta đã tích lũy được nhiều thông tin mới về nền nông nghiệp trên cây tinh dầu ở vùng khí hậu ôn đới

1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Bạc hà ở Việt Nam

Bạc hà Á ở Việt Nam có 2 nguồn gốc:

 Bạc hà bản địa:

Mọc hoang ở các tỉnh Sơn La, Lào Cai, Lai Châu Cây có thể cao đến 1,50m Thân màu xanh, xanh lục hoặc tím Loại này được đưa về đồng bằng trồng cho năng suất cây xanh cao, nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng methol trong tinh dầu thấp nên không có giá trị kinh tế Ngoài ra, còn phát hiện các chủng mọc hoang khác ở một số vùng khác nhau, phổ biến nhất là chủng giàu piperiton oxyd và pulegon

Hiện nay ở vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên) có trồng một loại Bạc hà hoa màu trắng hồng, mọc vòng quanh kẽ lá Thành phần menthol trong tinh dầu loài Bạc hà này rất thấp (3,6 - 8,2%), trong khi đó tỷ lệ pulegon lại khá cao (33,0 – 56,5%) Loại này được bán trong vùng để sử dụng làm thuốc

Ở Việt Nam, từ năm 2004, giống Bạc hà SK33 đã thay thế giống VN 74 - 76 Trồng tập trung ở Hưng Yên, Hà Nam, Thái Bình, Hải Phòng

Hiện tại mặc dù số lượng cây có tinh dầu phong phú nhưng Việt Nam chỉ mới sử dụng và tìm hiểu được một số cây có khả năng khai thác được như: Hồi, Sả, Màng tang, Húng quế, Bạc hà, Cam, Chanh

Các hoạt động sản xuất tinh dầu ở nước ta còn rời rạc, lẻ tẻ chủ yếu là khai thác thô, chưng cất thủ công, trình độ kỹ thuật còn thấp, các xí nghiệp còn trong tình trạng khó khăn chưa giải quyết tốt mối quan hệ giữa sản xuất và thu mua, giữa nhà sản xuất

và người sử dụng Trong thời gian qua Việt Nam tràn ngập hương liệu nhập từ nước ngoài chủ yếu là hương liệu tổng hợp

Dù còn gặp nhiều vấn đề khó khăn nhưng vẫn có các ngành cơ sở tham gia nghiên cứu và ứng dụng những tiến bộ khoa học vào sản xuất như trung tâm nghiên cứu các hợp chất tự nhiên (Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh), viện công nghệ thực phẩm, bộ y tế và ngành dược

Tuy nhiên những kết quả này chưa đáp ứng được các yêu cầu trong nước

1.3 Nhân giống Bạc hà Mentha arvensis L

1 3.1 Phương pháp nhân giống Bạc hà truyền thống

1 3.1.1 Nhân giống bằng thân ngầm hoặc thân cây trên mặt đất

Là cách thường được sử dụng nhất, có thể để nguyên hoặc cắt khúc khoảng 8 – 10cm Trồng theo luống cao nơi gần nguồn nước Thường xuyên bón phân, tưới nước

và làm cỏ

1.3.1.2 Nhân giống bằng hạt

Ít được sử dụng hơn vì ít khi thấy được hạt của cây Bạc hà vì hạt rất nhỏ Khả năng nảy mầm thấp, thời gian thu hoạch kéo dài dẫn đến hiệu quả kinh tế kém

1.3.2 Nhân giống cây Bạc hà bằng phương pháp nuôi cấy mô

Là phương pháp duy nhất hiện nay được sử dụng trong các trung tâm cung cấp giống cây phục vụ trong thí nghiệm Các cây Bạc hà con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ quý mới được lai tạo và được xem là những giống có giá trị về mặt tinh dầu So với phương pháp tách chiết thông thường tốc độ phát triển chỉ vài cây một năm và không sạch bệnh, phương pháp nhân giống thông qua nuôi cấy mô

sẽ sản xuất một lượng lớn cây con sạch bệnh, giữ được giống có năng suất tinh dầu

cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiên cứu mà trong đó nguồn mẫu phải tuyệt đối sạch bệnh, chủ động về nguồn giống

- Tinh dầu thu được phải có mùi thơm như nguyên liệu

- Qui trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu

- Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất

Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu:

- Dễ bay hơi

- Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100oC

- Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ

Tinh dầu thu được ở phương pháp ép có mùi thơm dễ chịu hơn phương pháp cất kéo hơi nước, song nhược điểm của phương pháp này là tinh dầu không được chiết

kiệt, thường bị vẩn đục vì còn lẫn các chất nhày, các mô và tạp chất khác, do đó thường phải tinh chế lại

1.4.2 Phương pháp tẩm trích

1.4.2.1 Phương pháp tẩm trích bằng dung môi dễ bay hơi

Phương pháp này có nhiều ưu điểm vì tiến hành ở nhiệt độ phòng nên thành phần hóa học của tinh dầu ít bị thay đổi

Phương pháp này không những được áp dụng để ly trích cô kết từ hoa mà còn dùng để tận trích khi các phương pháp khác không ly trích hết hoặc dùng để ly trích các loại nhựa dầu gia vị

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan của tinh dầu có trong các mô cây vào các dung môi hữu cơ

Yếu tố quan trọng nhất cho sự thành công của phương pháp này là phẩm chất và đặc tính của dung môi sử dụng Do đó, dung môi dùng trong tẩm trích cần phải đạt được những yêu cầu sau:

- Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trong nguyên liệu

- Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu

- Không có tác dụng hóa học với tinh dầu

- Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần

- Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị, không tạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém

- Nhiệt độ sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch ly trích để thu hồi dung môi, nhiệt

độ sôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu

Ngoài ra cũng cần có thêm những yếu tố phụ như giá thấp, dễ tìm, …

thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện trên Người ta sử dụng cả dung môi không tan trong nước như: diethyl ether, ether dầu hỏa, hexan, chloroform, benzen,… lẫn dung môi tan trong nước như: ethanol, aceton, methanol,… trong một số trường hợp cụ thể, người ta dùng một hỗn hợp dung môi

1.4.2.2 Phương pháp tẩm trích bằng dung môi không bay hơi

Trước khi phương pháp tẩm trích tinh dầu bằng dung môi dễ bay hơi ra đời, đây

là phương pháp xưa nhất để ly trích tinh dầu từ các loài hoa mà phương pháp ướp

nguội không đạt được hiệu quả Phương pháp này phù hợp với các loài hoa mà khi hái rời khỏi cây không tiếp tục tạo thêm tinh dầu

Phương pháp này dựa vào tính chất tinh dầu có thể hòa tan trong chất béo động vật, thực vật Ngày xưa, người ta đã dùng mỡ động vật (heo, bò, cừu,…) hoặc dầu thực vật (olive, hạnh nhân,…) làm dung môi ly trích tinh dầu Đầu tiên, ngâm hoa tươi vào trong dung môi đang đun chảy lỏng trong một khoảng thời gian nhất định, tùy theo các loại hoa, làm nhiều lần cho đến khi dung môi bão hòa tinh dầu Dầu hoặc mỡ bão hòa tinh dầu này được gọi là “sáp hoa” có thể sử dụng thẳng trong kỹ nghệ mỹ phẩm hoặc

ly trích lại với ethanol để điều chế “tinh dầu tuyệt đối”

Ưu điểm của phương pháp là tinh dầu chứa ít tạp chất, hiệu xuất ly trích cao Tuy nhiên các chất béo thường rất khó bảo quản, dễ bị oxy hóa nên ảnh hưởng đến mùi của tinh dầu Phương pháp này còn thủ công, giá thành cao nên hiện nay rất ít được áp dụng

1.4.3 Phương pháp hấp thụ

1.4.3.1 Phương pháp ướp

Có một số hoa (nhài, Tuberose) sau khi đã hái còn tiếp tục tạo ra tinh dầu một thời gian nữa nhưng tinh dầu các hoa đó rất dễ bay hơi nên không thể chờ cho quá trình tạo tinh dầu hoàn thành mới lấy Còn nếu cất ngay bằng hơi nước hay nếu trích ly ngay bằng các phương pháp khác thì cánh hoa bị chết, không tiếp tục tạo ra tinh dầu nữa Để trích ly người ta dùng chất nào hấp thu ngay tinh dầu sẵn có và hấp phụ dần tinh dầu được tạo ra Chất ấy là mỡ động vật (có thành phần phù hợp theo kinh nghiệm) Mỡ thực vật không dùng được vì nó gồm các hợp chất không no dễ bị hỏng

Mỡ khoáng vật hấp phụ kém, lại để mùi trong tinh dầu Người ta đặt những cánh hoa dưới những lớp mỡ và để một thời gian 24 giờ cho hoa tiếp tục tạo tinh dầu và mỡ hấp phụ hết tinh dầu đó Sau 24 giờ người ta thay các cánh hoa mới và phải thu hơi mỡ có hấp phụ tinh dầu dính vào các cánh hoa thải ra, cứ thế nhiều ngày (hơn 1 – 2 tháng) để

mỡ tích tụ được nhiều tinh dầu Mỡ lấy ra có thể dùng ngay trong công nghệ mỹ phẩm hoặc có thể dùng rượu để hòa tan tinh dầu và tiếp tục xử lý thêm Phương pháp này tốt,

nó giữ được nguyên mùi của tinh dầu nhưng phức tạp và đắt tiền, nên chỉ dùng cho các hoa cho tinh dầu có giá trị cao (như hoa hồng, các hoa tiếp tục tạo tinh dầu sau khi hái)

1.4.3.2 Phương pháp hấp thụ động học

Khi thổi không khí vào giữa các lớp hoa, tinh dầu trong hoa sẽ bốc hơi bay theo không khí Nếu không khí này được dẫn ngang qua một cột chứa than hoạt tính thì hơi tinh dầu sẽ bị than hấp thụ Thường xác hoa sau đó được tẩm trích tiếp tục bằng dung môi hữu cơ để lấy thêm những cấu phần khó bay hơi Hiện nay đây là phương pháp tương đối hoàn thiện, cho hiệu suất cao, thành phẩm có độ tinh khiết cao, tuy nhiên có nhiều công đoạn phức tạp, nhiều thông số phải tính đến trong quá trình sản xuất

1.4.4 Phương pháp chưng cất hơi nước

Phương pháp chưng cất hơi nước dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao

1.4.4.1 Phương pháp chưng cất bằng nước

Cho nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc đun bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chất nạp quá mịn lắng chặt xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu ở mặt tiếp xúc với đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong suốt thời gian chưng cất

Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần

có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này Vì thế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác

1.4.4.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước

Nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ nước sao cho nước không chạm đến vỉ Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp hoặc dùng hơi nước từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi Ta có thể coi phương pháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơi nước ở áp suất thường Như vậy chất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước quá

nhiệt

Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nên phải sắp xếp thế nào cho chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt Muốn vậy thì chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá

Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi qua một vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên Như vậy phần lớn chất nạp sẽ không được tiếp xúc với hơi nước Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nóng bên dưới gây hư hỏng thất thoát Do đó việc chuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh nghiệm tạo kích thước chất nạp cho từng loại nguyên liệu

Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợp chưng cất bằng hơi nước Tuy nhiên tốc độ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ, người

ta thấy nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng vẫn còn kém hơn phương pháp chưng cất bằng hơi nước

So với phương pháp chưng cất bằng nước, ưu điểm của nó là ít tạo ra sản phẩm phân hủy Do đó dù với thiết bị loại nào đi nữa thì ta phải đảm bảo là chỉ có phần đáy nồi được phép đốt nóng và giữ cho phần vỉ chứa chất nạp không tiếp xúc với nước sôi Phương pháp này cũng tốn ít nhiên liệu, tuy nhiên nó không thể áp dụng cho những nguyên liệu dễ bị vón cục

Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp suất thường nên những cấu phần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi hoàn toàn và như thế sẽ tốn rất nhiều thời gian Về kỹ thuật, khi xong một lần chưng cất, nước ở bên dưới vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi lạ

1.4.4.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước

Hơi nước tạo ra từ nồi hơi thường có áp suất cao hơn không khí được đưa thẳng vào bình chưng cất Trong kỹ nghệ ngày nay, phương pháp này thường dùng để chưng cất tinh dầu từ các nguyên liệu thực vật

Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh

dầu không bị phân hủy

Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế như

đã trình bày đối với hai phương pháp chưng cất trên cộng thêm 2 yếu tố nữa là yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng nó có thể phân hủy những cấu phần có nhiệt độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra Do đó trong thực hành nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt Còn trong trường hợp hơi nước quá ẩm sẽ đưa đến hiện tượng ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt Trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi Trong công nghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất phải đi ngang qua bộ phận tách nước

Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng nên tốt nhất

là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc Không có một quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau

Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộc vào đặc tính cả tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất Thông thường các loại tinh dầu có tỷ trọng lớn hơn nước, khi chưng cất hơi nước trong thiết bị áp suất cao cho hiệu suất ly trích cao trong thời gian chưng cất ngắn

1.5 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.5.1 Khái niệm

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật, bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ

1.5.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó

Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau Tuy nhiên tất

cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào khác nhau

Quá trình phân hóa tế bào có biểu thị tuy nhiên khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình tuyệt hóa, ức chế các gene Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lai bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo chương trình đã được

mã hóa cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác tế bào nằm trong khối mô của cơ thể luôn bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát triển hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy

tách rời nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toán của tế bào thực vật

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.5.3.1 Sơ lược về các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và vai trò của chúng

Có 5 nhóm chất điều hoà sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisis và ethylene

a Auxin

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Chất auxin sinh ra được hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non

Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin – oxydase, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với nơi tổng hợp chúng Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở các mức điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, những chất giống được sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng được nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn được dùng để giâm cành, để làm sáng quả và làm chậm sự thu hoạch quả

Một đặc trưng của auxin là tạo sự phân chia tế bào Trong tự nhiên auxin giúp sự vươn lóng chiều dài thân, lóng, ngọn, và sự tạo rễ Trong nuôi cấy mô, auxin được dùng cho sự phân chia tế bào và phân hoá rễ, ức chế sự thành lập chồi bên Các auxin thường dùng nhất trong nuôi cấy mô là 2,4-D, NAA, IBA, và IAA ở nồng độ 0,1 – 5,0 mg/l NAA và IBA thường dùng để cho ra rễ và dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi 2,4-D rất hữu hiệu trong tạo mô sẹo

b Cytokinin

Cytokinin được khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro Người ta đã biết

sự thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi Vào năm 1956, Skoog đã cô lập được một chất rất hoạt động người ta đặt tên là kinetine, do DNA biến chất

Cytokinin là các chất adenine naphtylacetamide acid (NAD) Cytokinin tự nhiên

và các chất tổng hợp, các cytokinin thông dụng nhất là kinetin, BAP

Tính chất sinh lý của cytokinin:

- Tác động hiệu quả rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhưng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin, cytokinin là chất bổ sung, auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid deoxyrebonucleic

- Có vai trò rất rõ trong việc tạo tế bào cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non Trái lại chúng là chất đối kháng với

sự tạo rễ

- Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động enzyme ly giải

- Hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi non: Các chồi nách được xử lý cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng

- Cytokinin có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa

c Gibberellin

Là một nhóm trong các chất điều hoà sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau Acid gibberellic thường được dùng trong môi trường nuôi cấy tế bào có mật độ thấp Khi GA3 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì thường chúng có vai trò như các auxin tự nhiên GA3 nồng độ cao có thể cảm ứng sự tăng trưởng của tế bào

mô sẹo không phân hoá và có thể kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo khi phối hợp với auxin và cytokinin nồng độ thấp

d Acid abscisis (ABA)

Đây là một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi ABA có thể ổn định với nhiệt độ nhưng lại rất nhạy cảm với ánh sáng Sự chuyển hoá từ dạng đồng phân 2-trans (chất có hoạt tính sinh học rất thấp) thường xảy ra dưới tác động của ánh sáng

e Ethylene

Mặc dù đã từ lâu người ta thấy rằng ethylene có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng

và phát triển của cây, nhưng gần đây nó mới được xem là hormone thực vật Đã có rất nhiều nghiên cứu về thời gian ảnh hưởng của ethylene Theo báo cáo của một số tác giả (Huxter và cộng sự, 1981; Smulder và cộng sự, 1990), đây là hướng đi rất quan trọng cho thấy hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên sự phát triển của các pha Các mô hay trái non không phản ứng với ethylene, nhưng các mô trưởng thành phản ứng với acethylene trong sự lão suy và sự chín

Hiện nay nguời ta đã phát hiện ra tác dụng của ethylene ở 4 điểm sau:

- Ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con úa vàng

Mẫu cấy thích hợp cho nhân giống vô tính in vitro phải có tỉ lệ mô phân sinh hiện diện cao hay có nhiều tế bào biểu hiện tính toàn năng Tiêu chuẩn xác định mẫu cấy là thời vụ và giai đoạn tăng trưởng của cây mẹ

1.5.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong sự phát triển nuôi cấy mô Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Có nhiều môi trường nuôi cấy được xây dựng và sử dụng cho đến nay mà chỉ cần cải thiện chút ít đó

là môi trường MS (Murashige và Skooge 1962), môi trường White, môi trường Gamborg

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino acid

- Nguồn carbon: một số các loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô,

- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh

trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro Các nhà khoa học sử dụng các môi

trường nuôi cấy rất khác nhau Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống,…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng,…)

a Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic Tương tự, Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzyme

Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau, ví

dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5 Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P, ) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ Nitrogen, sulphur, phosphorus là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các acid nucleic và nhiều chất hữu cơ khác Calcium và acid boric được tìm

thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là calcium có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học

Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme (là các factor): Magnesium, kẽm, sắt, và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzyme

co-Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzyme Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng

Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate và potassium Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng nitrate và amonium (2 – 20 mmol/l) là tốt hơn cả Trong trường hợp chỉ dùng amonium, thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acid), tricarboxylic acid hoặc một

số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của amonium vượt quá 8 mmol/l trong môi trường được giảm bớt Khi các ion nitrate và amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1 – 3 mmol/l

b Các nguyên tố đa lượng

- Nguồn carbon (C)

Đường saccharose là nguồn carbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp Nồng độ thích hợp phổ biến là 2 – 3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước) Khi khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân một phần, thuận lợi hơn cho cây hấp thụ Trong một số trường hợp, ví dụ nuôi cấy mô cây

một lá mầm, đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng,

mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy

và cho hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơn Sucrose, trong khi khử trùng môi trường, bị biến đổi thành glucose và fructose Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng

và sau đó là fructose Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt

Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon

Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào

và tái sinh các chồi xanh

- Nitrogen (N):

Thành phần chính của hầu hết các môi trường là nitrogen vô cơ dưới dạng nitrat (NO3-) hoặc amonium (NH4+) Các muối được dùng phổ biến là potasium nitrate (KNO3), amonium nitrate (NH4NO3) và calcium nitrate (Ca(NO3)2.4H2O) Những hợp chất này cung cấp nitrogen vô cơ cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như aminonium và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid Tỷ lệ amonium và nitrate thay đổi tùy theo loài và trạng thái phát triển của mô

Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc

NH4NO3 Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 Trong một

số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu

Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ Nitrate có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng

- Phosphorus (P):

Phosphorus là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia cấu trúc của màng

Trong môi trường nuôi cấy, phosphorus được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium Ion photphate hóa trị 1 và 2 có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy theo pH Ion H2PO4- chiếm ưu thế ở pH nhỏ hơn 7, đây là đặc tính của hầu hết môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng là ion dễ được thực vật hấp thụ nhất phosphorus thường được cung cấp dưới dạng phosphate hòa tan hạn chế

Nồng độ phosphate hòa tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của

mô, có thể do calcium và một số nguyên tố vi lượng bị kết tủa trong môi trường hoặc

bị giảm hấp thu vào trong mô Nồng độ ion photphate cho vào môi trường cao nhất là 18,9 mM, trung bình là 1,7 mM, hầu hết các môi trường chứa phosphate khoảng 1,3

sulphur như amino acid, protein và enzyme Sulphur ở dạng chưa khử được kết hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid

- Potassium (K):

K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu

cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và

áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy

mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước

K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl 6H2O, KH2PO4.

Trong thực vật, K+ là một cation có tính linh động cao, ở cả mức độ tế bào cũng như trong quá trình vận chuyển qua các khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc mạch libe Trong tất cả các nguyên tố, potassium là nguyên tố có mặt với nồng độ cao nhất,

ở tế bào chất từ 100 – 200 mM, ở lục lạp từ 20 – 200 mM

Muối potassium có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tính thấm của tế bào Đối với sự giãn tế bào cũng như các quá trình khác được điều chỉnh nhờ sức trương của tế bào, K+ có vai trò như một ion trung hoà các ion vô cơ và hữu cơ hoà tan trong dung dịch, đồng thời duy trì pH trong khoảng 7 – 8 là pH thích hợp cho hoạt động của hầu hết các enzyme

- Calcium (Ca):

Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây nhưng cách thức không giống như K+ và Mg+ vì Ca2+ không phải là ion linh động Calcium

có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc

và hoạt động sinh lys của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào Sự hoạt động của nhiều enzyme khác của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì calcium là đồng yếu

tố với những enzyme phân giải ATP

Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin

Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào Số lượng lớn Ca2+gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào

- Magnesium (Mg):

Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme vận chuyển phosphate Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K+ vì vậy có vai trò như một cation có thể trung hòa các cation và các acid hữu cơ Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ không thay đổi nhiều trung bình là 6,8 mM MgSO4

là nguồn bổ sung ion Mg+ duy nhất cho mô cấy

Mg2+ là một ion rất linh động có khả năng hình thành phức với các nhóm chức năng khác nhau

c Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn,…)

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng Đó là các ion: iron (Fe), mangnesium (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo) Fe dường như thích hợp hơn khi được cung cấp dưới dạng chelate Fe, và Zn được dùng bình thường trong các môi trường nuôi cấy Các dạng muối tatrate và citrate Fe khó hòa tan và thường hay kết tủa trong môi trường Vấn đề này có thể khắc phục bằng cách dùng EDTA - chelate Fe thay cho citrate Fe, đặc biệt đối với quá trình tạo phôi Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng Một số môi trường nuôi cấy được làm giàu bằng cobalt (Co), iodine (I)

và sodium (Na), nhưng các yêu cầu nghiêm ngặt về các nguyên tố này cho sinh trưởng của tế bào đã không được thiết lập Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với

Cu và Co là 0,1 μmol/l, Fe và Mo là 1 μmol/l, I là 5 μmol/l, Zn là 5 – 30 μmol/l, Mn là

20 – 90 μmol/l và B là 2 – 5100 μmol/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm

Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi trường ở nồng độ < 0,5 mM Nhu cầu của cây đối với nguyên tố vi lượng là rất thấp Do vậy những nguyên tố này cũng

có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng Hầu hết các nguyên tố vi lượng sử dụng ở lượng nmol Tầm quan trọng của một số nguyên tố vi lượng trong thành phần môi trường còn chưa được hiểu một cách rõ ràng Co, Al, Ni có thể có lợi đối với thực vật nhưng cũng có thể là không cần thiết Trong thực tế, hầu hết các nguyên tố vi lượng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là quan trọng, còn vai trò các anion có thể

là không cần thiết Ion SO42- dư thừa trong môi trường và chủ yếu phát sinh từ các muối MgSO4, K2SO4

d Các vitamin

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin

cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn

sự phát triển của chúng Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myoinositol Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Thiamin thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10 mg/l Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó cũng được chứng minh kích thích cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật Người ta cho rằng myo-inositol được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol

có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50 – 5000 mg/l

Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin

E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp

e Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy

- Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác:

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sang cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ

Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, lasparagine và adenine Casein hydrolysate nói chung được sử dụng với nồng độ 0,05 – 0,1% Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưởng của tế bào Một ví dụ về amino acid trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự tăng trưởng của tế bào là glysine 2 mg/l, glutamine đến 8 mM, asparagine 100 mg/l, L-arginine và cysteine 10 mg/l và L-tyrosine 100 mg/l Tyrosine cũng được sử dụng để kích thích sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy tế bào nhưng chỉ nên sử dụng trong môi trường có agar Cung cấp adenine sulfate vào môi trường nuôi cấy có thể kích sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy và kích thích mạnh sự tạo chồi

Các mô được nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết cho các quá trình trao đổi chất khác nhau Mặc dù thế, việc bổ sung các amino acid vào môi trường vẫn cần thiết để kích thích sinh trưởng tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế bào Không giống như các N vô cơ, các amino acid được các tế bào thực vật hấp thụ nhanh hơn Casein hydrolysate (0,05 – 0,1%), L-glutamine (8 mmol/l), L-asparagine (100 mmol/l), L-glycine (2 mmol/l), larginine và L-cystein (10 mmol/l) là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy Tyrosine (100 mmol/l) chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường Các amino acid được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của tế bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn Bổ sung vào môi trường adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng tạo chồi

- Than hoạt tính:

Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác

dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hoặc làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng thực vật có trong môi trường NAA, kinetine, IAA, BAP, liên kết với than hoạt tính Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 – 3% (w/v)

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, cà rốt, dây thường xuân và cà chua Ngược lại, nó gây ức chế ở

thuốc lá, đậu tương và các loài thuộc chi Camellia Nói chung than hoạt tính được rửa

với acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở nồng độ 0,5 – 3% vào môi trường nuôi cấy Than hoạt tính cũng giúp làm giảm độc tố bằng cách hấp phụ các hợp chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì

- Nước dừa:

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek

và cộng sự (Van Overbeek và cộng sự, 1941; 1942) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa thường được lấy

từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn

Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v)

- Agar:

Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết

vì thiếu oxy Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại bằng agar; một loại tinh bột được chế từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1%

f Yêu cầu pH

Theo Dương Công Kiên (2002), pH của môi trường thường được điều chỉnh từ 5,5 – 6 pH dưới 5,5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại cứng quá (Murashige, 1973) Môi trường có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự phát triển của mô Môi trường trước và sau khi hấp vô trùng có pH thay đổi một ít, nếu pH bắt đầu ở khoảng 5,0 – 7,0, sau khi hấp sẽ giảm 0,3 –0,5 đơn vị Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0,1N và nhỏ từng giọt vào môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo Luôn nhớ phải điều chỉnh pH trước khi thêm agar

1.5.3.4 Điều kiện nuôi cấy

- Ánh sáng:

Mẫu cấy trên môi trường chứa nguồn năng lượng có sẵn là đường, được tiên liệu

là ít tùy thuộc vào quang tổng hợp Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng

đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo hình cây in vitro Ánh sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy được ảnh hưởng nhiều đến cây nuôi cấy in vitro Ở hầu hết các

cây trồng nuôi cấy, xử lý ánh sáng 660 nm thì kích thích chồi phát triển, trong khi ánh sáng 740 nm thì lại kích thích rễ phát triển

- Nhiệt độ:

Nhiệt độ ảnh hưởng khá rõ ràng đến sự tạo hình của cây nuôi cấy Mỗi loại cây có một nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành nhưng hầu hết các loại cây trong nuôi cấy in vitro thích hợp ở nhiệt độ 18 – 25oC

1.5.4 Một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.5.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Sau khi vô trùng mẫu và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chiều hay nhiều chồi Sau đó chồi phát triển vương thân, ra lá và rễ trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát triển bình thường Đây là một chu

trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường được thực

hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính (in vitro) thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

1.5.4.2 Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện sự cân bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong thực vật thay đổi, cụ thể trong tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy riêng

lẻ trên môi trường giàu auxin, thì mô sẹo được hình thành Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào, mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2002)

1.5.5 Quy trình nhân giống vô tính

Gồm 5 giai đoạn

1.5.5.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ

Cây mẹ được chọn phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây được trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng

Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ

1.5.5.2 Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu

Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu

Trước tiên mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút đến 2 giờ sau đó rửa mẫu bằng xà bông bột sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm trên mẫu Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn gây nhiễm trên bề mặt mẫu

Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, chlorur thuỷ ngân Khi thêm tween 20 vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước

và mô thực vật, như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn

Sau đó phải rửa lại bằng nước cất vô trùng vài lần trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu

Mẫu cấy của một vài loài thực vật có thể hoá nâu hoặc đen, khi bị hoá nâu thì sự tăng trưởng của mẫu sẽ bị ức chế và nếu để lâu ngày sẽ chết Hiện tượng này xảy ra

khi trong mẫu có chứa một lượng lớn tanin hoặc các hợp chất Hydroxyphenol, và hoạt động của enzyme oxydase có nhân đồng (Cu) Hiện tượng này có thể khắc phục bằng cách:

- Loại bỏ các hợp chất phenol do mẫu tiết ra trong môi trường nuôi cấy

- Bổ sung các chất khử phenol vào môi trường nuôi cấy

- Ngăn chặn hoạt động của enzyme phenolase

- Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng cách lắc mẫu trong môitrường lỏng có thành phần tương tự như môi trường đặc

- Giảm diện tích vết cắt trên mẫu

Trong đó phương pháp được sử dụng nhiều nhất là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra Lượng thường dùng là 0,5 – 5 g/l

1.5.5.3 Giai đoạn 3: Giai đoạn tăng sinh mô

Mục đích của giai đoạn này là tăng sinh nhanh mô

- Tạo phôi soma:

Các phôi soma là những tổ chức đơn giản được tạo ra từ tế bào soma nhưng sự phát sinh hình thái lại tương tự như phôi hữu tính

- Tăng cường sự phát triển của chồi bên:

Chồi bên và chồi ngọn có thể được cảm ứng phát triển invitro bằng cách làm tăng

sự phát triển của các chồi đang hiện hữu Chồi bên sẽ được hình thành trên chồi ban đầu Một chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay một cụm chồi tuỳ thuộc vào loài thực vật và môi trường nuôi cấy

- Sự phát triển chồi bất định:

Chồi bất định được thành lập từ các bộ phận của cây mà không phải là chồi hoặc nách lá Chồi bất định có thể có nguồn gốc từ thân lá, lá, củ, rễ cũng có thể có nguồn gốc từ mô sẹo và mô sẹo được coi như thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con

1.5.5.4 Giai đoạn 4: Sự tạo rễ

Để có các cây con hoàn chỉnh, các chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ có thành phần chất kích thích sinh trưởng khác với môi trường tạo chồi

1.5.5.5 Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm

Cây con được lấy ra khỏi môi truờng và rửa sạch agar bám vào rễ, được trồng vào bầu đất hoặc líp ương Trong 10 – 15 ngày đầu cây con nên được duy trì ở ẩm độ cao