XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.) VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOLVÀ MENTHONE

ii TÓM TẮT Loài Bạc hà Châu Á có hàm lượng tinh dầu và menthol khá cao, nhưng do trồng chủ yếu bằng thân ngầm nên hệ số nhân không cao, tốn thời gian và cây có thể bị thoái hoá sau nhiề

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BẠC

HÀ (Mentha arvensis L.) VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG

TINH DẦU, MENTHOLVÀ MENTHONE

 

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : BÙI THỊ HỒNG GẤM Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 07/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BẠC

HÀ (Mentha arvensis L.) VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG

TINH DẦU, MENTHOLVÀ MENTHONE

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRẦN THỊ LỆ MINH BÙI THỊ HỒNG GẤM

CN TRẦN LỆ TRÚC HÀ

Tháng 07/2010

i

LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn:

™ Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

™ TS Trần Thị Lệ Minh đã hết lòng giúp đỡ và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

™ CN Trần Lệ Trúc Hà đã hết lòng giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn trong quá trình tôi làm khóa luận

™ KS Trịnh Thị Phi Ly cùng các anh chị phụ trách phòng sắc ký, Trung tâm phân tích Thí nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

™ CN Nguyễn Sĩ Tuấn đã đóng góp những ý kiến quý giá trong quá trình tôi quá trình thực hiện khóa luận

™ Các bạn bè thân yêu của lớp DH06SH đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời làm đề tài Chân thành cám ơn!

Sinh viên thực hiện Bùi Thị Hồng Gấm

ii

TÓM TẮT

Loài Bạc hà Châu Á có hàm lượng tinh dầu và menthol khá cao, nhưng do trồng chủ yếu bằng thân ngầm nên hệ số nhân không cao, tốn thời gian và cây có thể

bị thoái hoá sau nhiều vụ trồng Để khắc phục hạn chế trên và góp phần nghiên cứu

phương pháp nhằm gia tăng hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong cây

Bạc hà Châu Á nay chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) và khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và

menthone”

Nội dung chính của đề tài là tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh thông qua phương pháp nuôi cấy mô sẹo, khảo sát sự sinh trưởng phát triển của cây Bạc hà in vitro và phân tích hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong cây Bạc hà nhân giống bằng phương pháp in vitro

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đạt được một số kết quả sau: Thí nghiệm

khử trùng mẫu đốt thân Bạc hà (Mentha arvensis L.) đạt kết quả tối ưu với nghiệm

thức sử dụng: Tỷ lệ Javel: nước là 1:2 (v/v) và thời gian xử lý là 10 phút (55,6% mẫu có khả năng tái sinh) Nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l NAA kết hợp với

0,25mg/L BA đã kích thích tạo callus từ mẫu lá Môi trường MS bổ sung BA (2,0 mg/L) cho hiệu quả nhất lên quá trình nhân chồi Môi trường MS bổ sung NAA

(0,4mg/L) cho hiệu quả nhất lên quá trình tạo rễ Sự tăng trưởng của cây in vitro về

chiều cao, số lá, số cành nhanh hơn cây giâm từ thân ngầm và cho trọng lượng thân

cao hơn Cây Bạc hà in vitro có hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone cao hơn

cây giâm từ thân ngầm

iii

SUMMARY

“Build-up of process for in vitro propagation of mint (Mentha arvensis L.)

and observation of essence oil, menthol and menthone”

Asian peppermint’s oil and menthol content in mint are high, but the mints have been mainly planted by using underground stem, leading to long

multiplication, time-consuming and degeneracy after many crops To overcome the

aboved limitations and research on methods increasing oil, menthol and menthone content in Asia peppermint Thus, we carried out the project “Build-up of process

for in vitro propagation of mint (Mentha arvensis L.) and observation of essence oil,

menthol and menthone”

The main contens of this project are to induce the in vitro plane leafs of mint from in vitro, through callus tissue, Survey growth and development of in vitro mint Analysis of oil, menthol and menthone content in the mints growed from in vitro plantlet

From the optained results, some achieved results are follow: For sterile of

mint samples (Mentha arvensis L.) the optimal results were obtained with

treatments using: Javel:water of 1:2 (v/v) in 10 minutes (55.6% samples have ability

of regeneration) The treatment of 0.5 mg/L NAA combined with 0.25 mg/L BA stimulates callus formation from leaf MS medium supplemented with BA (2.0 mg/L) is the most effective for shoot generation MS medium additional NAA (0.4mg/L) is the most effective process for root formation The plant height, leave number, and stem number of mint are better than plant these of cutting plants

induced from the underground stem and the stem of in vitro plants is also higher

The content oil, menthol and menthone of mint is higher these of cutting plants induced from the underground stem

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây Bạc hà 3

2.1.1 Cây Bạc hà Châu Á (hay Bạc hà Á) 3

2.1.1.1 Đặc điểm thực vật Bạc hà Á 4

2.1.1.2 Phân bố sinh thái 4

2.1.1.3 Phân loại giống Bạc hà Châu Á 5

2.1.1.4 Kỹ thuật trồng Bạc hà Châu Á 6

2.1.2 Cây Bạc hà Châu Âu 7

2.1.2.1 Đặc điểm thực vật Bạc hà Âu 8

2.1.2.2 Phân loại giống Bạc hà Châu Âu 8

2.2 Giới thiệu chung về tinh dầu 9

2.2.1 Lịch sử phát triển tinh dầu 9

2.2.2 Định nghĩa tinh dầu 10

2.2.3 Tinh dầu bạc hà 11

2.3 Phương pháp chưng cất tinh dầu 12

2.3.1 Phương pháp chưng cất bằng nước 12

2.3.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước 13

2.3.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng 13

v

2.4 Sắc ký khí ghép khối phổ 13

2.5 Nhân giống vô tính in vitro 14

2.5.1 Khái niệm 14

2.5.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô 14

2.5.3 Phương pháp nhân giống vô tính in vitro 16

2.5.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 16

2.5.3.2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây 17

2.5.3.3 Nhân giống bằng chồi nách 17

2.5.4 Quá trình thực hiện nhân giống vô tính in vitro 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Thời gian và địa điểm 19

3.2 Đối tượng nghiên cứu 19

3.3 Vật liệu nghiên cứu 19

3.4 Nội dung nghiên cứu 19

3.4.1 Tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh 20

3.4.1.1 Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng 20

3.4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến sự hình thành callus 21

3.4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA lên khả năng tái sinh chồi 22

3.4.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành rễ 23

3.4.2 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà in vitro 23

3.4.2.1 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm 23

3.4.2.2 Trồng cây con ra đất 24

3.4.3 Quy trình ly trích tinh dầu cây Bạc hà in vitro 24

3.4.4.Định lượng menthol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh 26

4.1.1 Nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng mẫu cấy 26

4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự hình thành callus 27

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA lên khả năng tái sinh chồi 28

4.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành rễ 29

4.2 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà in vitro 31

4.2.1 Thuần hóa cây con Bạc hà in vitro ngoài vườn ươm 31

vi

4.2.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển cây Bạc hà 32

4.3 Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone 34

4.3.1 So sánh hàm lượng tinh dầu trong cây Bạc hà in vitro và cây đối chứng 34

4.3.2 Khảo sát hàm lượng menthol và menthone trong cây Bạc hà in vitro 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng 20

Bảng 3.2 Khảo sát của nồng độ BA và NAA đến sự tạo callus 21

Bảng 3.3 Khảo sát nồng độ BA lên khả năng tái sinh chồi 22

Bảng 3.4 Khảo sát nồng độ NAA lên khả năng hình thành rễ 23

Bảng 4.1 Tình trạng mẫu sau khi khử trùng 2 tuần 26

Bảng 4.2 Sự hình thành callus sau 3 tuần nuôi cấy 27

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA lên khả năng tái sinh chồi từ callus 28

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên khả năng hình thành rễ 30

Bảng 4.5 Kết quả so sánh chiều cao, số lá, số cành, khối lượng thân 33

Bảng 4.6 Kết quả so sánh hàm lượng tinh dầu 34

Bảng 4.7 Kết quả đường chuẩn menthol 35

Bảng 4.8 Kết quả đường chuẩn menthone 36

Bảng 4.9 Kết quả xác định hàm lượng menthol và menthone 38

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Mentha arvensis L 3

Hình 2.2 Mentha piperrita L 7

Hình 4.1 Chồi Bạc hà nẩy từ đốt thân mang chồi ngủ 27

Hình 4.2 Mô sẹo 3 tuần tuổi từ lá của cây Bạc hà 28

Hình 4.3 Ảnh hưởng nồng độ BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 29

Hình 4.4 Ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành rễ 31

Hình 4.5 Cây Bạc hà ngoài vườn ươm 31

Hình 4.6 Cây Bạc hà 30 ngày sau trồng 33

Hình 4.7 Sắc ký đồ menthol và menthone chuẩn 35

Hình 4.8 Sắc ký đồ menthol và menthone trong tinh dầu cây Bạc hà đối chứng 37

Hình 4.9 Sắc ký đồ menthol và menthone trong tinh dầu cây Bạc hà in vitro 37

Biểu đồ 4.1 Biểu đồ tăng trưởng chiều cao, số lá, số cành của cây Bạc hà 32

Biểu đồ 4.2 Đường chuẩn menthol ở 5 nồng độ 36

Biểu đồ 4.3 Đường chuẩn menthone ở 5 nồng độ 36

Châu Á (Mentha arvensis L.) rất được quan tâm do có công dụng chữa cảm sốt,

nhức đầu, sổ mũi, đau họng, khản tiếng, kích thích tiêu hoá, chữa các bệnh đường ruột, sát trùng, giảm đau và những ứng dụng khác trong các ngành kỹ nghệ thực phẩm và mỹ phẩm Ngoài ra, tinh dầu cây Bạc hà Châu Á còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như: Thực phẩm, dệt, dược phẩm, hóa mỹ phẩm,… Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống ngày càng cao, con người cần sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm bảo vệ sức khỏe và môi trường Tuy nhiên, các sản phẩm như kẹo cao su, kem đánh răng, kẹo ngậm,… Có mùi Bạc hà hiện đang thương mại trên thị trường phần lớn là sử dụng bằng phương pháp hoá học vì có thể sản xuất với số lượng lớn và giá thành thấp Mặt khác cây Bạc hà Châu Á trồng chủ yếu bằng thân ngầm cho hệ số nhân chồi không cao, tốn thời gian hơn nữa cây sẽ thoái hoá sau nhiều vụ trồng Vấn đề đặt ra là làm thế nào giảm giá thành tinh dầu chiết xuất từ cây trồng

Để khắc phục những hạn chế trên phương pháp nuôi cấy in vitro là một

phương pháp hữu hiệu để nhân nhanh các giống cây trồng với số lượng lớn trong thời gian ngắn và sản phẩm cây con chất lượng cao một cách chủ động Nhằm góp phần nghiên cứu phát triển cây Bạc hà Châu Á ở nước ta nay chúng tôi thực hiện đề

tài: “ Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) và

khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone”

2

1.2 Yêu cầu

‐ Xác định nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp để tạo nguồn mẫu sạch ban đầu

‐ Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự hình thành callus in vitro

của cây Bạc hà

‐ Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ BA đến sự tái sinh chồi từ callus của cây Bạc hà in

vitro

‐ Khảo sát sự ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành rễ của cây Bạc hà in vitro

‐ Thuần hoá cây con ngoài vườn ươm

‐ Xác định hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong tinh dầu của cây Bạc hà

in vitro

1.3 Nội dung thực hiện

- Tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh thông qua nuôi cấy mô sẹo

- Khảo sát sự sinh trưởng phát triển của cây Bạc hà in vitro

- Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong tinh dầu của cây Bạc hà

in vitro

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây Bạc hà

Người La Mã, Do Thái, Ai Cập, Trung Quốc và Nhật Bản là những dân tộc đầu tiên trồng và sử dụng cây Bạc hà Dựa theo các tài liệu lịch sử thì cây Bạc hà đã được sử dụng cách đây khoảng 2000 năm

Tuy Bạc hà có từ lâu đời nhưng được khai thác và sản xuất nhiều nhất là khoảng cuối thế kỷ XVIII đầu thế kỷ XIX trở lại đây

Loài Bạc hà - chi Metha L., họ Hoa môi (Lamiaceae) Chi Metha là một chi rất

đa dạng và phức tạp Loài này có khoảng 50 loại hoang dại Hiện nay trên thế giới

có hai loài Bạc hà chủ yếu được khai thác

2.1.1 Cây Bạc hà Châu Á (hay Bạc hà Á)

Tên khoa học : Mentha arvensis Linn

Tên khác : Bạc hà nam – Nhân đơn thảo (Trung Quốc) – Mentha (Pháp) – Peppermint (Anh)

Hình 2.1 Mentha arvensis L

Hình do tác giả chụp cây trồng tại Trường Đại học Nông Lâm

4

2.1.1.1 Đặc điểm thực vật Bạc hà Á

Cây Bạc hà là cây cỏ, sống lâu năm, cao 10 – 60 cm, thân vuông màu tía, mọc đứng hay hơi bò, có khi phân nhánh, trên thân và lá có nhiều lông Lá mọc đối, chéo chữ thập, cuống dài, rộng 2 - 3 cm, dài 3 - 5 cm, mép có răng cưa, mặt trên và mặt dưới đều có lông che chở và lông bài tiết Hoa mọc vòng ở kẽ lá, màu tím hay hồng nhạt, có khi màu trắng Mùa hoa tháng 7 – 10, tất cả thân, cây, lá, hoa đều có mùi thơm

- Rễ Bạc hà: Cấu tạo từ thân ngầm dưới đất Phân bố lớp đất từ 30 – 40 cm phân

nhánh như rễ phụ Từ các đốt ngầm mọc thân ký sinh Thân ngầm không chứa tinh dầu

- Thân Bạc hà: Rỗng ruột khi già Trên thân có đốt, mỗi đốt mọc hai mầm đối

xứng nhau và các rễ bất định Giữa hai đốt là các lóng, độ dài ngắn phụ thuộc vào các giống và điều kiện trồng trọt Thân chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỉ lệ tinh dầu

- Lá Bạc hà: Là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất làm nhiệm vụ quang hợp,

hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu Là nguyên liệu chính để cất tinh dầu, chiếm khoảng 2,4 - 2,7% tỉ lệ tinh dầu

- Hoa Bạc hà: Cụm hoa bồng hình chóp Trên hoa có cuống ngắn, 5 đài cánh

hợp thành hình chuông Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ Chiếm khoảng 4 - 6% tỉ

lệ tinh dầu (Đỗ Tất Lợi, 1987)

2.1.1.2 Phân bố sinh thái

¾ Trên thế giới

Loài bạc hà này được trồng ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc,

Ấn Độ,… Sản lượng hàng năm trên thế giới là 4.300 tấn (1990) Các nước sản xuất chính: Trung Quốc 2.000 tấn, Ấn Độ 1.200 tấn, Paraguay 800 tấn, Bắc Triều Tiên

200 tấn, Đài Loan 50 tấn, Việt Nam 20 tấn

- Nhật Bản: Bạc hà M arvensis L var piperascens đã được trồng rất lâu đời và

tập trung chủ yếu ở khônđô Đến đầu thế kỷ XX, lan rộng các vùng Uzen, Amatô, Hirôsima,… Sự phát triển mạnh mẽ trong thời kỳ này đã đưa Nhật bản lên vị trí đứng đầu thế giới về sản xuất tinh dầu bạc hà, năm 1914, 50% tinh dầu thế giới được sản xuất tại Nhật Bản Vùng sản xuát chính hiện nay là đảo Hôcaiđô Ngoài ra, Bạc hà Châu Âu cũng sớm được di thực vào Nhật Bản nhưng không phát triển, tuy Bạc hà

Châu Âu – Mentha piperita L vào Nhật Bản, nhưng về mặt công nghiệp người ta vẫn trồng loài Bạc hà địa phương Mentha arvensis var piperascens Briquet có mùi rất khác

5

- Trung Quốc: Trồng loại M arvensis L var glabrata Holms Sản xuất tập

trung ở một số tỉnh phía nam

- Ấn Độ: Năm 1966, diện tích trồng 1000 ha Loài Bạc hà Nhật Bản Mentha

arvensis L đưa vào trồng tỏ ra cho hiệu quả kinh tế cao hơn loài Bạc hà Châu Âu Mentha piperita L Vì hàm lượng menthol trong tinh dầu Bạc hà cao hơn Sau khi

tách menthol, người ta dùng tinh dầu bạc hà Nhật Bản như các tinh dầu bạc hà khác

để làm thơm thực phẩm và các chế phẩm hương liệu Hiện nay, toàn bộ các loài Bạc

hà đưa vào trồng trên phạm vi công nghiệp ở Ấn Độ là loài Nhật Bản hay Bạc hà

Châu Á Mentha arvensis L.”

- Ngày nay, tại các nước Châu Âu, khi muốn chế menthol cũng hướng vào loài

Mentha arvensis L (Đỗ Tất Lợi, 1987)

¾ Ở nước ta

Cây Bạc hà được trồng nhiều ở Nghĩa Trai (Hưng Yên), Đại Yên (Hà Nội) Ngoài ra Bạc hà mọc hoang nhiều ở Sa Pa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba Vì (Hà Tây), Bắc Cạn, Sơn La, được di thực về đồng bằng để trồng trọt nhưng không phát triển

Đã có nhiều tỉnh trồng để khai thác tinh dầu như ngoại thành Hà Nội, Hà Tây, Nam Hà, Thái Bình, Quảng Ninh, Đà Nẵng, Thành Phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Long An

2.1.1.3 Phân loại giống Bạc hà Châu Á

Bạc hà Á ở Việt Nam có hai nguồn gốc:

¾ Bạc hà bản địa

Mọc hoang nhiều ở Sa Pa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba Vì (Hà Tây), Bắc Cạn, Sơn La Cây có thể cao đến 1,50 m Thân xanh, xanh lục hoặc tím Loại này khi trồng ở đồng bằng thì cho năng suất xanh cao, nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng menthol trong tinh dầu thấp nên không có giá trị kinh tế Ở một số vùng khác còn phát hiện chủng mọc hoang khác giàu piperiton oxyd và pulegon

Hiện nay cây Bạc hà được trồng nhiều ở Nghĩa Trai (Hưng Yên), Đại Yên (Hà Nội) Đây là loại Bạc hà có hoa màu trắng hồng, mọc quanh kẽ lá Thành phần menthol trồng tinh dầu này rất thấp (3,6 - 8,2%), trong khi tỷ lệ pulegon lại khá cao (33,0 - 56,5%) Loại này được trồng chủ để làm thuốc (Vương Văn Ánh và ctv, 2006)

6

¾ Bạc hà di thực gồm nhiều giống loại

- Giống Bạc hà X-2: (viết tắt của chữ Bạc hà màu xanh số 2), mọc lâu đời ở

những vùng cao, mát, thuộc huyện Hắc Hà, Sapa (Hoàng Liên Sơn), Sìn Hô (Lai Châu) Giống này có hàm lượng menthol chỉ đạt 25 - 35%, nhưng giống Bạc hà X-2 mọc rất khỏe, cho lượng cây xanh rất cao, tinh dầu rất thơm

- Giống Bạc hà BH-974: Tên BH-974 được đặt do Bộ Ngoại Thương, đưa từ

Trung Quốc vào Việt Nam tháng 9/1974 Năm 1975, đây là một giống thuộc loại Bạc hà Châu Á đã được tuyển chọn và có sức mọc rất mạnh, có hàm lượng menthol trong tinh dầu cao (65 – 90%) Được trồng nhiều ở hai miền Nam Bắc vì Giống này

có ưu điểm: Chịu hạn, chịu rét, chịu sâu bệnh (Đỗ Tất lợi, 1987)

- Giống Bạc hà BH-975: Giống Bạc hà này có nguồn gốc ở Nhật Bản, sau thế

chiến 2 được di thực và phát triển mạnh ở Braxin Giống này cũng là một loại cỏ có thân mang nhiều cành mọc đứng, cao khoảng 40 - 60 cm, hoa màu hồng tím mọc thành bông ở đầu cành hoặc ngọn Giống này là cho năng suất cây xanh cao, hàm lượng tinh dầu trong cây cao, hàm lượng menthol (60 - 85%)

- Giống Bạc hà BH-976: Giống Bạc hà có tên gọi là Mentha arvensis L hay gọi

là Bạc hà nam, là một loại cỏ thân bò hay mọc thẳng cao từ 10 - 60cm, có lá hình trứng hoặc hình mác, mép răng cưa hoặc khía tay bèo, khả năng chịu úng kém Giống này có lượng cây xanh cao, hàm lượng menthol và tinh dầu xấp xỉ giống Bạc

hà BH-974 Đây cũng là một giống Bạc hà quý

- Giống Bạc hà Đài Loan: Được di thực vào Việt Nam như thế nào chưa rõ Có

thân màu tím Lượng cây xanh và hàm lượng tinh dầu thì thấp hơn hai giống

BH-974 và BH-975 Tuy nhiên khả năng chịu bệnh tốt, cũng như thích hợp với khí hậu đất đai ở các tỉnh miền Nam nên được nhân dân trồng nhiều

- Giống Bạc hà Húng Spearmint hay Lưu Lan Hương: Giống này mọc ở các tỉnh

Sơn La, Lai Châu, Hoàng Liên Sơn Giống này có hàm lượng tinh dầu thấp nên đến nay chỉ được trồng làm gia vị

2.1.1.4 Kỹ thuật trồng Bạc hà Châu Á

- Chuẩn bị đất: Đất được cày bừa kỹ, lên luống cao từ 15 - 20 cm, rộng từ 1 - 1,5 m,

dài không quá 30 m Mặt luống bằng phẳng, các rạch hàng cách đều nhau và sâu từ

15 - 20 cm để bón phân

7

- Chọn hom giống: Bạc hà được trồng bằng đoạn thân, thân bò hay thân ngầm

Trong đó thân ngầm cho năng suất chất xanh và hàm lượng tinh dầu cao nhất Hom ngọn cây không đều, yếu cho năng suất thấp

- Xử lý hom giống trước khi trồng: Chọn thân ngầm màu trắng hoặc xanh nhạt,

nhặt mắt có đường kính > 5mm dài 60 - 70 cm, rửa sạch và cắt thành từng đoạn dài khoảng 10 - 20 cm, Sau đó ngâm trong dung dịch CuSO4 5% trong 15 phút trước khi trồng Hom được bảo quản 3 - 5 ngày ở nơi thoáng mát chú ý tưới nhẹ

- Cách trồng: Cắm chếch 45o, 2/3 dùi trong đất 3 - 4 cm, còn 1/3 thân trên mặt đất Mật độ trồng hàng x hàng 30 – 50 cm, cây x cây 10 - 15 cm lương hom là 250.000 - 300.000 hom/ha, tương đương với 1000 - 1500 kg/ha Tỷ lệ nhân giống 1:10

- Bón phân:

Nguyên tắc: Bón phân ban đầu, bón thúc nhiều lần, bón dứt điểm sớm Sau mỗi lứa cắt cần bón phân để súc tiến sự sinh trưởng của cây, làm tăng năng suất của lứa tiếp theo

Phân chuồng, kali, lân đem ủ tươi 2/3 lượng dùng để bón lót, còn 1/3 bó thúc vào giai đoạn phân cành.Với lứa cắt lần 2,3 dùng phân chuồng bó rải trên mặt luống Đạm và lân giúp tăng khối lượng chất xanh và năng suất tinh dầu Cẩn thận khi bón kali,vì tuy kali cũng làm tăng năng suất chất xanh song năng suất tinh dầu lại giảm Liều lượng: Đạm 250 - 300 kg/ha, lân 300 - 400kg/ha, kali 400kg/ha

2.1.2 Cây Bạc hà Châu Âu: có nguồn gốc Châu Âu gọi tắt là Bạc hà Âu

8

¾ Trên thế giới

Tên khác là Bạc hà cay có nguồn gốc ở Châu Âu Giống được ưa chuộng là Mitcham (Anh), Milly và Maine et Loire (Pháp) Tinh dầu cất ở vùng Châu Âu này tuy hàm lượng menthol không cao khoảng 45 - 50% nhưng tinh dầu có mùi thơm nhẹ, rất thích hợp với sở thích của người Châu Âu Mỗi nước trồng lại cho tinh dầu và chất lượng khác nhau thường người ta lấy giống ở vùng Mithcham gần Luân Đôn làm chuẩn Bạc hà Âu hiện nay được trồng và khai thác nhiều ở các nước Châu Âu, Bắc

- Bộ rễ Bạc hà: Bạc hà Âu có nhiều rễ tơ (rễ phụ) và nhiều thân ngầm tạo thành

gốc cây, có thể ăn sâu tới 40 cm

- Thân Bạc hà: Vuông, phân cành mạnh và cao tới 100 cm Thân và cành có

màu xanh đậm đến đỏ tím, chúng chứa rất ít tinh dầu và hoàn toàn không có trong thời kỳ ra hoa Thân ngầm được tạo thành từ những đốt đầu tiên của thân cây vào cuối mùa hè Về cấu tạo thân ngầm giống với thân cây, tùy theo vị trí tạo thành mà được gọi là thân ngầm hay thân bò Vào đầu mùa xuân, từ các mầm nách của thân

bò sẽ tạo thành cây mới Thân ngầm không chứa tinh dầu

- Lá Bạc hà: Mọc đối, cuống ngắn, hình trứng, phiến lá xẻ răng cưa, màu xanh

thẩm hay đỏ tím nhưng mặt dưới luôn sáng màu hơn mặt trên Hai phía mặt lá đều có túi tinh dầu, mặt trên có số lượng túi nhiều hơn

- Hoa Bạc hà: Hoa tự bông nhỏ, hình chóp, khác với Bạc hà Á là hoa mọc thành

nhiều vòng thành bông ở ngọn cành

2.1.2.2 Phân loại giống Bạc hà Châu Âu

Bạc hà Châu Âu còn có tên gọi là Bạc hà Anh hay “ Bạc hà Mitsam” có hai giống:

- Giống Bạc hà đen: Có màu xanh thẩm ở thân có màu tím đỏ đến đỏ Ra hoa chậm hơn Bạc hà trắng Lá khô chứa 2,5% tinh dầu với hàm lượng 48 - 68%

2.2 Giới thiệu chung về tinh dầu

2.2.1 Lịch sử phát triển tinh dầu

Theo Lê Ngọc Thạch (2006), tinh dầu xuất hiện và phát triển theo nền văn minh nhân loại Các nhà nghiên cứu phương Tây cho rằng chính phương Đông là nơi bắt đầu lịch sử của tinh dầu Ngày xưa, người ta đã biết sử dụng trực tiếp các loài cây cỏ hoa lá có mùi thơm trong các nghi lễ tôn giáo

Việc sử dụng và mua bán những hợp chất có mùi thơm có nguồn gốc chủ yếu trong vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới là nét đặc trưng của những người cổ ở Mesopotamia (vùng Lưỡng Hà), Ai Cập, Ấn Độ và Trung Quốc Ngày đó, người ta hiểu biết rất ít về kĩ thuật chế biến, mặc dù người Ả Rập đã có nhiều tiến bộ trong hóa học về những hợp chất thiên nhiên Mãi đến thời kì Trung Cổ tại Châu Âu những hợp chất nói trên mới được lưu ý sử dụng rộng rãi, lúc đầu được xem như là những dược liệu Mặc dù sự chưng cất tinh dầu đã được thực hiện trong nhiều thế kỉ trước nhưng sự phát triển đầy đủ về kĩ thuật chưng cất bắt đầu từ thế kỷ thứ 13 tại Tây Ban Nha Kỹ nghệ về nước hoa, như loại nước hoa có nền là ethanol, do Koln điều chế, xuất hiện sau đó vài thế kỉ Còn ở vùng Grass ở niềm Nam nước Pháp trở thành trung tâm lớn nhất về tinh dầu đầu tiên trên thế giới vào thế kỷ thứ 17, đặc biệt tinh dầu các loài hoa: Lài, Hồng, Cam,…

Khoảng 50 năm trở lại đây, nhu cầu tinh dầu trên thế giới bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố Nhu cầu về nguyên liệu cho gia vị và nước hoa tăng lên một cách tự nhiên theo đà tăng của dân số thế giới, đặc biệt nguyên liệu tạo hương vị thực phẩm

Ở đây còn phải kể đến sự thay đổi lối sống ở phương Tây Vấn đề an toàn thực phẩm (không chứa chất gây hại trước mắt và lâu dài) đã làm cho người tiêu dùng có khuynh hướng dùng những thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Trong thời gian này, thói quen về ăn uống cũng đã thay đổi Một mặt, sự giao lưu quốc tế gia tăng dẫn đến hiện tượng sử dụng nhiều thức ăn nước ngoài, sử dụng ngày càng nhiều rau

20 năm gần đây, người ta đã tích lũy được nhiều thông tin mới về nền nông nghiệp trên cây tinh dầu ở vùng khí hậu ôn đới

Ngoài ra tinh dầu còn góp phần quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác như y học, nông nghiệp và mỹ phẩm,…

Một đặc điểm quan trọng không thể thay thế của tinh dầu so với các hợp chất hữu cơ tổng hợp khác là nó không gây hại môi trường và dễ phân huỷ

Do có những công dụng thực tiễn quan trọng nên ngày càng có nhiều nghiên cứu cũng như khai thác về tinh dầu trên toàn thế giới (Lê Ngọc Thạch, 2006)

Theo tài liệu ngành dược từ 1949, thế giới đã biết 3.000.000 chất hữu cơ trong

đó có 400.000 chất có mùi rõ rệt; một phần trong các chất này được dùng trong các ngành y tế, mỹ phẩm và thực phẩm

Nguyên liệu thiên nhiên không đáp ứng nổi nhu cầu (1 - 3 tấn cánh hoa hồng mới lấy được 1kg tinh dầu) nên thế giới ngày càng đi vào tổng hợp nhân tạo các chất thơm

Bắc Mỹ sản xuất tinh dầu khoảng 62% (2.483 tấn) và châu Mỹ ở phần lớn là sản xuất tinh dầu Bạc hà, tinh dầu Cam

Châu Á sản xuất hầu hết các loại tinh dầu tách từ hoa như tinh dầu Sả, tinh dầu Bạc hà, ; Sản lượng tinh dầu Châu Á nhiều hơn vì điều kiện tự nhiên (khí hậu, đất đai) rất thuận lợi cho sự phát triển thực vật Do đó có nhiều điều kiện để hình thành

nền công nghiệp này với quy mô lớn

2.2.2 Định nghĩa tinh dầu

Tinh dầu là một hỗn hợp nhiều chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu, phần lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật Tinh dầu thường là thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi hoàn toàn mà không bị phân hủy, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (Lê Ngọc Thạch, 2003)

¾ Tính chất vật lý

- Lỏng ở nhiệt độ thường, mùi thơm không màu hoặc màu nhạt

11

- Chỉ số khúc xạ cao, có năng suất quay cực

- Ít tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ, este, cồn, có tính sát trùng mạnh

- Tinh dầu là một hỗn hợp nên không có một độ sôi nhất định và chỉ số khúc

xạ, chỉ số quay cực thay đổi trong phạm vi nhất định

- Dễ bay hơi, khuếch tán mạnh ở nhiệt độ bình thường

- Tỷ trọng đa số là nhẹ hơn nước (Bạc hà, Sả, Cam, Chanh, Quýt, Bưởi) Một số

tinh dầu nặng hơn nước (Quế, Hương lài, Đinh hương)

- Tinh dầu dễ bị biến mùi khi có tác động của ánh sáng, nhiệt độ

¾ Tính chất hóa học

Một số tinh dầu chỉ có một hợp chất như: Tinh dầu Mơ, hạt Đào, hạt Cải Nhưng phần lớn tinh dầu là hỗn hợp của nhiều hợp chất với những tỉ lệ thay đổi, thành phần quan trọng nhất (về phương diện thơm) có khi chỉ ở một tỉ lệ rất thấp Một số hợp chất gặp trong thành phần tinh dầu:

- Hydrocarbon: Cacbur tecpenic (chiếm nhiều nhất), camphen, pinen, limonen,

caryophyllen, cacbur no: heptan, parafin

- Rượu: Menthol, rượu methylic, ethylic, xinamic, xitronellol, geraniol,

tecpineol, linalol, santatlol, xeneol

- Phenol và este phenolic: Anetol, eugenol, safrol, apiol, timol

- Andehyde: Xiamic, salyxilic, xitral

- Xeton: Comfo, thuyon, menthone

- Acid (dưới dạng este): Acetic, butyric, benzoic xinamic, saliailic (Nguyễn

Kim Phi Phụng, 2009)

2.2.3 Tinh dầu Bạc hà

¾ Tinh dầu Bạc hà Châu Á

Metha arvensis L., Bạc hà Á, cho tinh dầu với tên thương phẩm là Cornmint

oil (Oleum Methae arvensis), thành phần chính của tinh dầu là menthol

Bộ phận cho tinh dầu: Phần trên mặt đất (0,5 - 1,56%)

Thành phần hoá học: Menthol (51,8%); menthone (19,8%); neomentol (7,65%); β-pinen (1,1%); limonen (2,87%); acetat mentil (2,53%),…

Công dụng: Dùng chiết xuất menthol, phần tinh dầu còn lại dùng để chế cao xoa bóp Menthol có tác dụng kháng khuẩn, chống co thắt, giảm đau, kích thích tiêu hóa, chống hôi miệng,

12

Menthol được dùng nhiều trong nhiều ngành kỹ nghệ: Kỹ nghệ dược phẩm (1.550 tấn/năm), kỹ nghệ bánh kẹo (570 tấn/năm), kỹ nghệ sản xuất thuốc lá (1.350 tấn/năm), sản xuất thuốc đánh răng (1.800 tấn/năm), sản phẩm cạo râu (250 tấn/năm),…

¾ Tinh dầu bạc hà Châu Âu

Metha piperita L., Bạc hà Âu, cho tinh dầu tên thương phẩm là Peppermint oil

(Oleum Methae piperita), thành phần chính của tinh dầu là menthol

- Bộ phận cho tinh dầu: Phần trên mặt đất (1 - 3%)

- Thành phần hoá học: Menthol (30 - 50%); menthone (20 - 35%); neomentol

(7,65%); mentofuran (2 - 10%); acetat mentil (4 - 10%); camphen; limonen; pinen; α-pinen ,…

β Công dụng: Tinh dầu bạc hà Châu Âu có mùi thơm dịu, rất được ưa chuộng

Tinh dầu được dùng như là chất thơm trong kỹ nghệ dược phẩm, kỹ nghệ sản xuất rượu và bánh kẹo Tinh dầu bạc hà Châu Âu không dùng để chiết xuất menthol

2.3 Phương pháp chưng cất tinh dầu

Chưng cất có thể dược định nghĩa là: “sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều hợp chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng” Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan khuếch tán, và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước

ở nhiệt độ cao (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Chưng cất để lấy tinh dầu là một phương pháp tương đối đơn giản, trong thực

tế có thể thực hiện theo ba dạng chủ yếu sau:

2.3.1 Phương pháp chưng cất bằng nước

Nguyên liệu và nước cho vào trong một thiết bị (nồi), sau đó được đun tới sôi, nước bay hơi ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu Qua thiết bị làm lạnh sẽ ngưng tụ lại,

ta thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước ra Phương pháp này có thể áp dụng tốt cho những nguyên liệu xốp và rời rạc

Đây là phương pháp chưng cất tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với sản xuất nhỏ Nhưng tinh dầu sản phẩm chưa có chất lượng cao, khó điều chỉnh thông

số kỹ thuật (to, p) và khi chưng cất thời gian kéo dài, hiệu suất thấp Tốc độ chưng cất phụ thuộc rất nhiều vào lò đốt và nguyên liệu dễ bị khét

13

2.3.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước

Nguyên liệu và nước cùng cho vào một thiết bị nhưng có cách nhau một lớp vĩ nồi để cho nguyên liệu khỏi rơi lọt vào phần đáy, phần nước ở dưới đáy nồi được đun sôi và bốc hơi lên qua lớp vĩ nồi đi vào lớp nguyên liệu và qua đó kéo theo lớp hơi tinh dầu đi ra thiết bị làm lạnh

¾ Ưu điểm

- Nguyên liệu không bị cháy khét

- Ít tạo ra sản phẩm phân hủy

- Tốn ít nhiên liệu

- Khống chế được điều kiện kỹ thuật kể cả vận tốc chưng cất

¾ Nhược điểm

- Do thực hiện ở áp suất thường, nên những cấu phần có nhiệt độ cao sẽ đòi hỏi

một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi hoàn toàn và như thế sẽ tốn rất nhiều thời gian phẩm chất tinh dầu chưa tốt

2.3.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng

¾ Ưu điểm so với hai phương pháp trên

- Một nồi hơi có thể phục vụ cho nhiều nồi chưng cất

- Khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khét, phẩm chất và màu sắc của tinh

dầu tốt hơn

- Có thể điều chỉnh được vận tốc chưng cất

- Có thể chưng cất ở áp suất cao

¾ Nhược điểm

- Không dùng để tách nguyên liệu có hàm lượng thấp

- Cần tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm ngưng tụ một hỗn hợp hơi

- Sản phẩm sau khi chưng cất có thể bị ảnh hưởng nếu các cấu tử có trong thành

phần tinh dầu dể bị phân hủy trong quá trình chưng cất

- Không thể tách được các loại nhựa, sáp có trong nguyên liệu, mặc dù nhựa và

sáp này rất cần thiết để dùng làm chất định hương có giá trị

2.4 Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectrometry)

Sắc ký khí khối phổ là một trong những phương tiện hữu ích giúp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất cần khảo sát Hệ máy GC-MS có thể khảo sát một đơn chất hay một hỗn hợp Dòng khí sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần được cho vào

2.5 Nhân giống vô tính in vitro

2.5.1 Khái niệm

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy

chuyền để nhân giống

2.5.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô

¾ Ý nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa cực kì quan trọng trong phát triển công nghệ sinh học Khi tiến hành các kĩ thuật chuyển gen tạo ra các giống mới cũng như tìm cách nhân nhanh các giống mới đó, chúng ta đều cần đến kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Sự phát triển kĩ thuật này đến nay đã góp phần quyết định vào sự thành công của công nghệ sinh học thực vật

à Một số ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- Tạo sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1- 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

15

- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

- Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để

loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh

tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác

nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro hoặc trong bầu đất

- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh

- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ

à Hạn chế của vi nhân giống:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi

cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

- Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo

Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng

16

2.5.3 Phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Nhân giống vô tính in vitro thường được thực hiện bằng một trong những

phương pháp sau:

2.5.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Limmasets và Cornuet (1949) đã phát hiện rằng ở các cây nhiễm bệnh virus, virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy chúng ở vùng đỉnh

sinh trưởng Phát hiện đó là cơ sở để Morel và Martin (1952) chứng minh giả thuyết

trên bằng cách tạo được cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai tây qua nuôi cấy đỉnh

sinh trưởng (Dương Công Kiên,2002)

Kỹ thuật này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng làm mẫu vật nuôi cấy Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các mầm lá non Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) chỉ đúng khi mẫu vật được tách từ đỉnh sinh trưởng

có kích thước trong vòng 0,1 - 0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng Trong thực tế mẫu vật được tách với kích thước như vậy để tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch

virus cho cây trồng Thường sẽ gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các mô

phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ như vậy Do đó, trong khuôn khổ nhân

giống in vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng Phổ

biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, chuối,… đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5 - 10 mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần

mô xung quanh

Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi

và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy như sau:

- Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm (dicotyledon)

như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc,…

Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum):

Đỉnh sinh trưởng → Chồi nách → Cây

- Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm: Chủ yếu gặp ở các đối tượng một

lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ,… Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo) và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh

Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây

17

2.5.3.2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

¾ Nuôi cấy chồi bất định

Chồi bất định có cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng ở vi trí khác với nách lá bình thường Nguyên liệu nuôi cấy bao gồm:

- Đoạn thân: Thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải,…

- Mảnh lá: Thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao,…

- Cuống lá: Thủy tiên,…

- Các bộ phận của hoa: Súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá,…

- Nhánh củ: họ Hành, họ Lay ơn, họ Thủy tiên,…

- Đoạn mầm: Măng tây

Các chồi mới có thể phát triển trực tiếp trên mẫu cấy bắt đầu từ tế bào như mô

ở vị trí bên trong biểu bì hay ngay bên dưới bề mặt của thân Một số những tế bào này trở thành nhu mô phân sinh, chúng biểu hiện nguồn gốc từ một tế bào duy nhất

Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus

cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật

Sự hình thành chồi bất định có thể cho kết quả cao về tốc độ nhân giống nhưng làm tăng tỉ lệ cây biến dạng Khi sử dụng phương pháp này cần phải được đánh giá cẩn thận về tính biến dị của cây trồng

¾ Nhân giống thông qua giai đoạn callus

Callus là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma cao hơn (Dương Công Kiên, 2002)

2.5.3.3 Nhân giống bằng chồi nách

Chồi nách là chồi mọc từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính Thường chỉ có một số chồi nách nhất định phát triển, phần lớn các chồi nách điều bị ức chế bởi tính ưu thế ngọn

18

Khi các mẫu cây là chồi thì tính ưu thế ngọn sẽ giảm dần tới sự tự sản xuất các chồi nách ở nách lá Từ đó một số lượng lớn chồi con có thể được tách ra để cấy chuyền hay tăng sinh chồi mẹ hơn nữa hoặc tạo rễ và hình thành cây hoàn chỉnh

Sự xuất hiện của chồi nách sớm hay muộn, số lượng chồi nách nhiều hay ít của

phần lớn cây trồng trong nhân giống in vitro phụ thuộc vào sự cung cấp Cytokinin

Sự xuất hiện chồi nách sớm dẫn đến sự phát triển chồi bậc hai, bậc ba,… trong sự sinh cụm chồi Khi các cụm chồi như vậy phát triển chúng có thể được phân chia thành những cụm chồi nhỏ hơn hay các cụm chồi được tách ra để hình thành cụm chồi giống như cụm chồi mẹ Tiến hành phân chia có thể tiếp tục không giới hạn

Sử dụng Cytokinin ở nồng độ tối ưu và nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, tốc độ nhân giống có thể đạt 5 - 10 lần trong chu kì điều đặn 4 - 8 tuần Điều này có thể dẫn đến nhân giống cực nhanh trong khoảng 0,1 - 30 x 106 trong một năm Mức độ nhân giống này có thể duy trì suốt năm

2.5.4 Quá trình thực hiện nhân giống vô tính in vitro

Tiến trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các giai đoạn chính sau:

- Giai đoạn 1: Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng

Các mẫu chọn được khử trùng và cấy vào trong môi trường thích hợp Thời gian nuôi cấy khác nhau tùy loại cây, thường là 4 - 6 tuần Khi đó mẫu cấy mọc thành cây con cao khoảng 1cm

- Giai đoạn 2: Nhân vô tính in vitro

Mẫu cấy được chia ra và được cấy chuyền vào môi trường mới Tại môi trường mới các mẫu cấy sẽ phát triển thành những chồi nách và chồi bất định, môi trường nhân chồi thường có sự hiện diện của Cytokinin Giai đoạn này kéo dài từ 2 - 4 tuần

- Giai đoạn 3: Tạo rễ

Cây in vitro tái tạo hoàn chỉnh được đưa từ ống nghiệm ra môi trường bên

ngoài thường khá yếu nên cần thiết lập môi trường bên ngoài để cho cây làm quen

và thuần hóa cây in vitro Giai đoạn này nếu không có sự nhân giống liên tục thì kéo

dài khoảng 30 - 45 ngày Sau đó có thể đem trồng ra đồng ruộng sản xuất

Nếu ở giai đoạn vườn ươm dùng để sản xuất giống thương mại thì có thể kéo dài giai đoạn này 5 - 7 năm (Dương Công Kiên,2002)

19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2009 đến tháng 07/2010 Tại Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành trên giống Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.)

3.3 Vật liệu nghiên cứu

- Thí nghiệm được tiến hành trên giống cây Bạc hà (Mentha arvensis L.)

- Mẫu thí nghiệm:

+ Mẫu nuôi cấy in vitro: Đốt thân cây Bạc hà hai tháng tuổi mang chồi ngủ

+ Mẫu trồng ở vườn ươm: Cây Bạc hà in vitro 5 tuần tuổi

+ Mẫu chiết xuất tinh dầu: Bao gồm lá và thân của cây Bạc hà 3 tháng tuổi + Mẫu cây đối chứng: Cây Bạc hà giâm từ thân ngầm

+ Hóa chất xác định hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone: Menthol (chuẩn),

menthone (chuẩn), diethylether, toluene, ethylacetat, vaniline, H2SO4đđ, ethanol

3.4 Nội dung nghiên cứu

+ Nội dung 1: Tạo cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) in vitro hoàn chỉnh thông

qua phương pháp nuôi cấy mô sẹo

+ Nội dung 2: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà in vitro

+ Nội dung 3: Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong cây

Bạc hà in vitro

20

3.4.1 Nội dung 1: Tạo cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) in vitro hoàn chỉnh

Các thí nghiệm 2, 3, 4 đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn

toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại Trong mỗi bình cấy 3 mẫu Mỗi bình chứa 35 ml

môi trường

3.4.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp

để khử trùng mẫu cấy

à Vật liệu:

+ Đốt thân Bạc hà mang chồi ngủ

+ Chất khử trùng: Javel Super (nồng độ sodium hypochloride 5,25% - Công ty

TNHH Mỹ Hảo)

- Cách tiến hành:

+ Các thao tác ngoài phòng thí nghiệm

 Rửa mẫu bằng xà phòng

 Rửa mẫu dưới vòi nước sạch trong 20 phút

+ Các thao tác tiếp theo thực hiện trong tủ cấy

 Lắc mẫu với javel trong 10 - 15 phút

 Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ javel và thời gian xử lý khử trùng thích hợp

trì trong chu kỳ chiếu sáng là 16 giờ, ánh sáng 1000 – 2000 lux ở nhiệt độ 25oC ± 2oC

21

- Số nghiệm thức : 8

- Tổng số bình : 72

- Tổng số mẫu : 216

à Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ javel và thời gian xử lý thích hợp

nhất để vô trùng mẫu đốt thân mang chồi ngủ, tạo nguồn mẫu ban đầu cho quá trình

nhân giống tiếp theo

à Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ mẫu đạt (%) = (Tổng số mẫu đạt / Tổng số mẫu cấy) x 100

- Tỉ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy) x 100

à Thời gian theo dõi: 2 tuần

3.4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự

hình thành callus

à Vật liệu: Các mẫu lá được lấy từ cây in vitro 3 tuần tuổi của thí nghiệm 1, cắt

lá thành những mảnh có diện tích 0,5 cm2 được nuôi cấy trên mặt thạch Các lá này

cũng được nuôi cấy trên môi trường MS nhưng bổ sung thêm các chất kích thích sự

tạo callus BA có nồng độ từ (0 - 0,25 mg/L), NAA có nồng độ từ (0 - 1mg/L) Việc

nuôi cấy cũng được nuôi cấy trong điều kiện tối ở nhiệt độ 25oC ± 2oC

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự tạo callus từ lá

Nghiệm thức Nồng độ NAA

(mg/L)

Nồng độ BA (mg/L)

22

à Chỉ tiêu theo dõi:

- Phần trăm mẫu tạo callus

- Màu sắc và đặc điểm của callus

- Khối lượng callus

à Thời gian theo dõi: 3 tuần

3.4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA lên khả năng tái sinh

chồi từ callus của cây Bạc hà in vitro

à Vật liệu: Cấy chuyền các callus 3 tuần tuổi của thí nghiệm 2 Các mẫu callus

này cũng được nuôi cấy trên môi trường MS nhưng bổ sung thêm BA có nồng độ từ

(0 - 3,5 mg/L) chất kích thích sự tạo chồi Việc nuôi cấy cũng được duy trì trong chu

kỳ chiếu sáng là 16 giờ, ánh sáng 1000 - 2000 lux ở nhiệt độ 25oC ± 2oC

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ BA lên khả năng tái sinh chồi từ callus

à Mục đích: Xác định nồng độ BA thích hợp đến sự tái sinh chồi cây Bạc hà

à Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ mẫu tạo chồi

- Số chồi trên mẫu: Số chồi trung bình trên 1 mẫu cấy

- Chiều cao chồi (cm): Đo từ mặt thạch đến đỉnh sinh trưởng cao nhất của cụm chồi

- Số lá /chồi: Số lá trung bình trên 1 chồi

à Thời gian theo dõi: 5 tuần

23

3.4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành

rễ của cây Bạc hà in vitro

à Vật liệu: Chồi Bạc hà 5 tuần tuổi từ thí nghiệm 3, cao 1,5 cm trở lên Các chồi

này cũng được nuôi cấy trên môi trường MS nhưng bổ sung thêm các chất kích thích

sự tạo rễ NAA có nồng độ từ (0 - 0,6 mg/L) Việc nuôi cấy cũng được duy trì trong

chu kỳ chiếu sáng là 16 giờ, ánh sáng 1000 - 2000 lux ở nhiệt độ 25oC ± 2oC

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành

rễ của chồi Bạc hà in vitro

à Mục đích: Xác định nồng độ NAA thích hợp lên khả năng ra rễ của chồi Bạc hà

à Chỉ tiêu theo dõi:

- Phần trăm chồi có rễ

- Số rễ trung bình trên 1 chồi

- Chiều dài rễ (cm): Đo từ gốc đến hết chiều dài rễ

à Thời gian theo dõi: 3 tuần

3.4.2 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà in vitro

3.4.2.1 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm

à Mục đích: Khảo sát khả năng thích nghi của cây Bạc hà in vitro ngoài vườn ươm.

à Vật liệu: Cây con hoàn chỉnh cao từ 5 - 6 cm, có đủ rễ

Giá thể trồng: Đất dinh dưỡng sạch Tribat, tưới phun sương 2 lần/ngày

24

à Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ sống (%) = (Tổng số cây con sống / Tổng số cây con ra vườn) x 100

- Sức sống của cây con ngoài vườn ươm

à Thời gian theo dõi: 2 tuần

3.4.2.2 Trồng cây con ra đất

à Mục đích: Khảo sát đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Chiều cao, số lá, số cành,

trọng lượng thân

à Vật liệu:

- Cây đối chứng: Chọn cây giâm từ thân ngầm đạt chiều cao 8 -11 cm sau khi

giâm được 30 ngày

- Cây in vitro: Sau 2 tuần chăm sóc ngoài vườn ươm đạt chiều cao 8 – 11 cm

Chuyển cây trồng ra đất bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên gồm 2 nghiệm thức: (1)

cây in vitro; (2) cây đối chứng, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại mỗi lần lặp lại 9 cây

Cây Bạc hà được trồng ở khu vườn thực nghiệm của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.4.3.Quy trình ly trích tinh dầu cây Bạc hà in vitro

Thân lá Bạc hà sau khi thu hái được phơi khô ở nhiệt độ khoảng 30oC đến trọng lượng không đổi Tiến hành phương pháp chưng cất bằng nước:

Cân 100 g mẫu (mẫu khô, thân lá được xay nhuyễn) cho vào bình cất kéo 2 L, cho 1000 ml nước cất vào , sau đó ta đặt bình cất kéo lên bếp đun khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 80 - 90oC Khi đun hơi nước bốc lên đi ngang qua mẫu và mang theo tinh dầu, hơi nước và tinh dầu khi bốc hơi ra khỏi bình cất kéo thì gặp hệ thống làm lạnh

ở trên, khi đó hơi nước với tinh dầu sẽ ngưng tụ trong bình hứng Khi tinh dầu đã tách ra khỏi hết lớp tế bào, ngưng đun thu lấy tinh dầu ở bình hứng Làm khô với

Na2SO4 khan và bảo quản ở nhiệt độ 4oC

Định lượng menthol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Hàm lượng menthol và menthone trong tinh dầu bạc hà được phân tích trên hệ thống Hewlett-Packard HP5890II GC nối với đầu dò khối phổ 5971 MSD

- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 220°C, chế độ bơm mẫu chia dòng 1: 20

Khối lượng tinh dầu Khối lượng mẫu khô

- Đầu dò khối phổ năng lượng 70 eV

Khối lượng menthol (menthone) Thể tích tinh dầu X 100 Hàm lượng menthol

(menthone) (%)

26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh

4.1.1 Thí nghiệm 1: Nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng mẫu cấy

Thông thường một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật dài từ 1 - 5 tháng và môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng, vitamin, rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Đặt biệt nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn và nấm, khi đó mô nuôi cấy

sẽ chết dần và thí nghiệm phải bỏ đi Do đó, để tạo mẫu không nhiễm nấm và khuẩn

là khâu quan trọng đầu tiên trong quá trình nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002)

Nhằm mục tiêu tạo mẫu không nhiễm nấm và khuẩn, làm nguyên liệu cho thí nghiệm sau Tôi tiến hành xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp

và đạt được kết quả sau:

Bảng 4.1 Tình trạng mẫu sau khi khử trùng 2 tuần

Nghiệm thức

Nồng độ (javel:

nước)

Thời gian khử trùng (phút)

Tỉ lệ mẫu đạt (%)

Tỉ lệ mẫu sống (%)

Sau 2 tuần nuôi cấy mẫu khử trùng trong môi trường tái sinh, các nghiệm thức

1 đến 3và 5 đến 7 cho tỉ lệ mẫu đạt cung như tỉ lệ mẫu sống thấp dưới 50% Nghiệm thức 5 đến 8 có tỉ lệ mẫu đạt cao, nhưng do nồng độ javel cao, nên số mẫu sống

27

thấp Nghiệm thức 4, nồng độ xử lý bề mặt bằng javel pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:2 và thời gian xử lý là 10 phút cho hiệu quả tốt nhất Tỉ lệ mẫu không nhiễm đạt 63,0% và số mẫu sống đạt 55,6%

Hình 4.1 Chồi Bạc hà nẩy

từ đốt thân mang chồi ngủ

4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự hình thành callus

Kết quả tạo mô sẹo của lá Bạc hà in vitro trên môi trường MS có bổ sung

NAA (0 – 1,0 mg/L) và BA (0 – 0,25 mg/L) sau 3 tuần nuôi cấy

Bảng 4.2 Sự hình thành callus sau 3 tuần nuôi cấy

Trọng lượng callus (g)