Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ polygonum multiflorum thunb

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG  BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB TRƯƠNG CÔNG PHI NGUYỄN XUYẾN THÀNH THẮNG BIÊN HÒA, 12/2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG  BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG CÔNG PHI NGUYỄN XUYẾN THÀNH THẮNG Giảng viên hướng dẫn: ThS Trịnh Thị Thanh Huyền BIÊN HÒA, 12/2012 LỜI CẢM ƠN Bài báo cáo nghiên cứu chúng em có thành hôm nhờ giúp đỡ quan tâm tận tình thầy cô anh chị trước Chúng em xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp chân thành lời động viên thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại học Lạc Hồng Chúng em xin cảm ơn chị Trịnh Thị Thanh Huyền, người trực tiếp hướng dẫn đề tài nghiên cứu chúng em quan tâm tận tình hướng dẫn thao tác kỹ thuật, kiến thức lý thuyết chuyên ngành Chúng em xin chân thành cảm ơn anh Ngô Quang Hưởng, chị Phí Thị Thu Hiền… làm việc Phòng Nuôi Cấy Mô Thực Vật, thuộc Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai hướng dẫn giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Và cuối em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, người thân, tập thể bạn khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường khóa 2008, giúp đỡ động viên chúng em suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu i MỤC LỤC Mục Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i TÀI LIỆU THAM KHẢO iii PHỤ LỤC iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU .iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu, mục đích đề tài Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu đề tài Những đóng góp mặt hạn chế Kết cấu đề tài PHẦN II: NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung hà thủ ô đỏ 1.1.1 Nguồn gốc hình thái 1.1.2 Tác dụng dƣợc lý 1.2 Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật .5 1.2.2 Quy trình tạo mẫu chồi in vitro ii 1.2.3 Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi 1.2.4 Tăng sinh cụm chồi in vitro 1.2.5 Tạo rễ hoàn chỉnh chuyển vƣờn ƣơm 1.3 Những vấn đề nuôi cấy mô 1.3.1 Sự tạp nhiễm 1.3.2 Tính bất định mặt di truyền 1.3.3 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy 1.3.4 Hiện tƣợng thủy tinh thể .8 1.4 Các công trình nghiên cứu liên quan CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 10 2.1 Thời gian địa điểm 10 2.2 Trang thiết bị dụng cụ 10 2.3 Nội dung nghiên cứu 11 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất khử trùng thời gian xử lý lên mẫu hà thủ ô đỏ 11 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi hà thủ ô đỏ 12 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi hà thủ ô đỏ 14 2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ hoàn chỉnh 15 2.3.5 Thí nghiệm 5: Nuôi trồng nhà kính 15 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 16 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 iii 3.1 Kết khảo sát nồng độ javel thời gian xử lý thích hợp để khử trùng mẫu hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb 17 3.2 Kết khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi hà thủ ô đỏ 20 3.3 Kết khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi hà thủ ô đỏ 25 3.4 Kết khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ hoàn chỉnh hà thủ ô đỏ 29 3.5 Nuôi trồng nhà kính 32 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tình trạng mẫu sau xử lý 18 Biểu đồ 3.2: Biểu diễn tương tác nồng độ javel sử dụng thời gian xử lý 19 Biểu đồ 3.3 : Biểu diễn môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến tăng sinh cụm chồi hà thủ ô đỏ 26 Biểu đồ 3.4: Biểu diễn môi trường ảnh hưởng đến chiều cao chồi 27 Biểu đồ 3.5: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy 30 Biểu đồ 3.6: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tỷ lệ emodin physcion Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ javel thời gian khử trùng mẫu 11 Bảng 2.2: Khảo sát môi trường tối ưu để tái sinh chồi hà thủ ô đỏ 12 Bảng 2.3: Khảo sát môi trường tăng sinh cụm chồi hà thủ ô đỏ 14 Bảng 2.4: Khảo sát môi trường tạo rễ hoàn chỉnh 15 Bảng 3.1: Tình trạng mẫu hà thủ ô đỏ sau khử trùng tuần 18 Bảng 3.2: Kết tái sinh chồi sau tuần nuôi cấy 21 Bảng 3.3: Kết tăng sinh cụm chồi sau tuần nuôi cấy 25 Bảng 3.4: Kết chồi tạo rễ sau tuần nuôi cấy 29 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây hà thủ ô đỏ Hình 3.1: Mẫu hà thủ ô đỏ phát triển từ đốt thân mang chồi ngủ sau tuần nuôi cấy 19 Hình 3.2: Các chồi tái sinh phát triển môi trường nuôi cấy sau tuần nuôi cấy 24 Hình 3.3: Cụm chồi phát triển môi trường sau tuần nuôi cấy 28 Hình 3.4: Rễ tái sinh môi trường sau tuần nuôi cấy 31 Hình 3.5: Rễ tái sinh môi trường sau tuần nuôi cấy 32 Hình 3.6: Cây hà thủ ô trồng giá thể xơ dừa 33 Hình 3.7: Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb 34 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA: Deoxyribonucleic acid ĐHSTTV: Điều hòa sinh trưởng thực vật NAA: Naphthaleneacetic acid KIN: Kinetin BA: N6-benzyladenin MS: Murashige & Skoog, 1962 PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Thảo dược nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để sản xuất chế biến loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh phục hồi sức khỏe cho người Trong đó, hà thủ ô đỏ tìm thấy Trung Quốc vào năm 713 sử dụng loại thảo dược trường sinh người Trên giới, hà thủ ô đỏ có nhiều Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản Ấn Độ Ở Việt Nam, hà thủ ô phân bố chủ yếu miền núi phía Bắc Hà Giang, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ An… hà thủ ô đỏ chủ yếu biết đến vị thuốc bổ, trị suy nhược thần kinh, ích huyết, khỏe gân cốt, đen râu tóc Trong y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, chữa đau mỏi tay chân, chữa tóc hay rụng, sớm bạc, làm đen tóc kéo dài tuổi thọ [3] Trong hà thủ ô đỏ có số hợp chất quan trọng như: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ trồng hạt dâm cành [3] Tuy nhiên, Lin (2003), xác định hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro cho tỉ lệ chất emodin physcion cao so với tự nhiên [1] Trước đây, nguồn hà thủ ô đỏ tự nhiên nước ta dồi gần bị khai thác mức nạn phá rừng nên lượng hà thủ ô đỏ bị giảm sút, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc sản xuất chế biến loại thuốc để chữa bệnh cho người Do đó, việc nhân nhanh số lượng hà thủ ô đỏ phương pháp nuôi cấy in vitro để đáp ứng nhu cầu cung cấp nguồn dược liệu cần thiết Để góp phần vào việc đáp ứng nhu cầu thực tiễn, thực đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb” Mục tiêu, mục đích đề tài - Mục tiêu: xây dựng quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ - Mục đích: Tạo giống hà thủ ô đỏ có chất lượng cao phương pháp nuôi cấy in vitro T19 - T35 T19 - T36 T19 - T37 T19 - T38 T19 - T39 T19 - T4 T19 - T40 T19 - T41 T19 - T42 T19 - T43 T19 - T44 T19 - T45 T19 - T46 T19 - T47 T19 - T48 T19 - T49 T19 - T5 T19 - T50 T19 - T6 T19 - T7 T19 - T8 T19 - T9 T2 - T20 T2 - T21 T2 - T22 T2 - T23 T2 - T24 T2 - T25 T2 - T26 T2 - T27 T2 - T28 T2 - T29 T2 - T3 T2 - T30 T2 - T31 T2 - T32 T2 - T33 T2 - T34 T2 - T35 T2 - T36 T2 - T37 T2 - T38 T2 - T39 T2 - T4 T2 - T40 T2 - T41 T2 - T42 T2 - T43 T2 - T44 T2 - T45 T2 - T46 T2 - T47 T2 - T48 T2 - T49 T2 - T5 T2 - T50 T2 - T6 T2 - T7 *2,44 *1,77333 *2,22 *1,77333 *3,77333 *3,77333 *2,66333 *1,88333 *1,88333 *1,88333 *2,33 *2,22 *1,99667 *1,99333 *2,33 *2,21667 *3,77333 *1,99333 *2,66333 *2,55333 *1,55333 *2,55333 0,0 -0,223333 0,11 0,333333 -0,333333 -0,11 0,336667 0,333333 0,11 0,22 0,0 -0,22 -0,22 0,446667 0,223333 0,0 0,333333 -0,333333 0,113333 -0,333333 *1,66667 *1,66667 *0,556667 -0,223333 -0,223333 -0,223333 0,223333 0,113333 -0,11 -0,113333 0,223333 0,11 *1,66667 -0,113333 *0,556667 0,446667 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 T2 - T8 T2 - T9 T20 - T21 T20 - T22 T20 - T23 T20 - T24 T20 - T25 T20 - T26 T20 - T27 T20 - T28 T20 - T29 T20 - T3 T20 - T30 T20 - T31 T20 - T32 T20 - T33 T20 - T34 T20 - T35 T20 - T36 T20 - T37 T20 - T38 T20 - T39 T20 - T4 T20 - T40 T20 - T41 T20 - T42 T20 - T43 T20 - T44 T20 - T45 T20 - T46 T20 - T47 T20 - T48 T20 - T49 T20 - T5 T20 - T50 T20 - T6 T20 - T7 T20 - T8 T20 - T9 T21 - T22 T21 - T23 T21 - T24 T21 - T25 T21 - T26 T21 - T27 T21 - T28 T21 - T29 T21 - T3 T21 - T30 T21 - T31 T21 - T32 T21 - T33 T21 - T34 T21 - T35 T21 - T36 T21 - T37 T21 - T38 T21 - T39 -0,553333 0,446667 -0,223333 0,11 0,333333 -0,333333 -0,11 0,336667 0,333333 0,11 0,22 0,0 -0,22 -0,22 0,446667 0,223333 0,0 0,333333 -0,333333 0,113333 -0,333333 *1,66667 *1,66667 *0,556667 -0,223333 -0,223333 -0,223333 0,223333 0,113333 -0,11 -0,113333 0,223333 0,11 *1,66667 -0,113333 *0,556667 0,446667 *-0,553333 0,446667 0,333333 *0,556667 -0,11 0,113333 *0,56 *0,556667 0,333333 0,443333 0,223333 0,00333333 0,00333333 *0,67 0,446667 0,223333 *0,556667 -0,11 0,336667 -0,11 *1,89 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 0,525356 T21 - T4 *1,89 0,525356 T21 - T40 *0,78 0,525356 T21 - T41 0,0 0,525356 T21 - T42 0,0 0,525356 T21 - T43 0,0 0,525356 T21 - T44 0,446667 0,525356 T21 - T45 0,336667 0,525356 T21 - T46 0,113333 0,525356 T21 - T47 0,11 0,525356 T21 - T48 0,446667 0,525356 T21 - T49 0,333333 0,525356 T21 - T5 *1,89 0,525356 T21 - T50 0,11 0,525356 T21 - T6 *0,78 0,525356 T21 - T7 *0,67 0,525356 T21 - T8 -0,33 0,525356 T21 - T9 *0,67 0,525356 T22 - T23 0,223333 0,525356 T22 - T24 -0,443333 0,525356 T22 - T25 -0,22 0,525356 T22 - T26 0,226667 0,525356 T22 - T27 0,223333 0,525356 T22 - T28 0,0 0,525356 T22 - T29 0,11 0,525356 T22 - T3 -0,11 0,525356 T22 - T30 -0,33 0,525356 T22 - T31 -0,33 0,525356 T22 - T32 0,336667 0,525356 T22 - T33 0,113333 0,525356 T22 - T34 -0,11 0,525356 T22 - T35 0,223333 0,525356 T22 - T36 -0,443333 0,525356 T22 - T37 0,00333333 0,525356 T22 - T38 -0,443333 0,525356 T22 - T39 *1,55667 0,525356 T22 - T4 *1,55667 0,525356 T22 - T40 0,446667 0,525356 T22 - T41 -0,333333 0,525356 T22 - T42 -0,333333 0,525356 T22 - T43 -0,333333 0,525356 T22 - T44 0,113333 0,525356 T22 - T45 0,00333333 0,525356 T22 - T46 -0,22 0,525356 T22 - T47 -0,223333 0,525356 T22 - T48 0,113333 0,525356 -* denotes a statistically significant difference Thí nghiệm 3: Bảng 6: Bảng phân tích ANOVA ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên tăng sinh cụm chồi ANOVA Table for SOCHOI by MOITRUONG Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -Between groups 108,819 16 6,80117 60,16 0,0000 Within groups 3,84393 34 0,113057 -Total (Corr.) 112,663 50 Table of mean Table of Means for SOCHOI by MOITRUONG with 95,0 percent LSD intervals -Stnd error MOITRUONG Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -N0 1,22 0,194128 0,941035 1,49896 N1 2,22 0,194128 1,94104 2,49896 N10 2,44333 0,194128 2,16437 2,7223 N11 2,22 0,194128 1,94104 2,49896 N12 2,22 0,194128 1,94104 2,49896 N13 2,22 0,194128 1,94104 2,49896 N14 2,99667 0,194128 2,7177 3,27563 N15 2,77333 0,194128 2,49437 3,0523 N16 3,22 0,194128 2,94104 3,49896 N2 3,22 0,194128 2,94104 3,49896 N3 3,44333 0,194128 3,16437 3,7223 N4 3,44 0,194128 3,16104 3,71896 N5 2,99667 0,194128 2,7177 3,27563 N6 3,22 0,194128 2,94104 3,49896 N7 4,99667 0,194128 4,7177 5,27563 N8 8,10667 0,194128 7,8277 8,38563 N9 2,66333 0,194128 2,38437 2,9423 -Total 51 3,15412 Bảng 7: Bảng trắc nghiệm LSD ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên tăng sinh cụm chồi Multiple Range Tests for SOCHOI by MOITRUONG -Method: 95,0 percent LSD MOITRUONG Count Mean Homogeneous Groups -N0 1,22 X N13 2,22 X N1 2,22 X N11 2,22 X N12 2,22 X N10 2,44333 XX N9 2,66333 XXX N15 2,77333 XXX N14 2,99667 XXX N5 2,99667 XXX N6 3,22 XX N2 3,22 XX N16 3,22 XX N4 3,44 X N3 3,44333 X N7 4,99667 X N8 8,10667 X -Contrast Difference +/- Limits -N0 - N1 *-1,0 0,55793 N0 - N10 *-1,22333 0,55793 N0 - N11 *-1,0 0,55793 N0 - N12 *-1,0 0,55793 N0 - N13 *-1,0 0,55793 N0 - N14 *-1,77667 0,55793 N0 - N15 *-1,55333 0,55793 N0 - N16 *-2,0 0,55793 N0 - N2 *-2,0 0,55793 N0 - N3 *-2,22333 0,55793 N0 - N4 *-2,22 0,55793 N0 - N5 *-1,77667 0,55793 N0 - N6 *-2,0 0,55793 N0 - N7 *-3,77667 0,55793 N0 - N8 *-6,88667 0,55793 N0 - N9 *-1,44333 0,55793 N1 - N10 -0,223333 0,55793 N1 - N11 0,0 0,55793 N1 - N12 0,0 0,55793 N1 - N13 0,0 0,55793 N1 - N14 *-0,776667 0,55793 N1 - N15 -0,553333 0,55793 N1 - N16 *-1,0 0,55793 N1 - N2 *-1,0 0,55793 N1 - N3 *-1,22333 0,55793 N1 - N4 *-1,22 0,55793 N1 - N5 *-0,776667 0,55793 N1 - N6 *-1,0 0,55793 N1 - N7 *-2,77667 0,55793 N1 - N8 *-5,88667 0,55793 N1 - N9 -0,443333 0,55793 N10 - N11 0,223333 0,55793 N10 - N12 0,223333 0,55793 N10 - N13 0,223333 0,55793 N10 - N14 -0,553333 0,55793 N10 - N15 -0,33 0,55793 N10 - N16 *-0,776667 0,55793 N10 - N2 *-0,776667 0,55793 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N14 N14 N14 N14 N14 N14 N14 - N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N12 N13 N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N13 N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 *-1,0 *-0,996667 -0,553333 *-0,776667 *-2,55333 *-5,66333 -0,22 0,0 0,0 *-0,776667 -0,553333 *-1,0 *-1,0 *-1,22333 *-1,22 *-0,776667 *-1,0 *-2,77667 *-5,88667 -0,443333 0,0 *-0,776667 -0,553333 *-1,0 *-1,0 *-1,22333 *-1,22 *-0,776667 *-1,0 *-2,77667 *-5,88667 -0,443333 *-0,776667 -0,553333 *-1,0 *-1,0 *-1,22333 *-1,22 *-0,776667 *-1,0 *-2,77667 *-5,88667 -0,443333 0,223333 -0,223333 -0,223333 -0,446667 -0,443333 0,0 -0,223333 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 0,55793 N14 - N7 *-2,0 0,55793 N14 - N8 *-5,11 0,55793 N14 - N9 0,333333 0,55793 N15 - N16 -0,446667 0,55793 N15 - N2 -0,446667 0,55793 N15 - N3 *-0,67 0,55793 N15 - N4 *-0,666667 0,55793 N15 - N5 -0,223333 0,55793 N15 - N6 -0,446667 0,55793 N15 - N7 *-2,22333 0,55793 N15 - N8 *-5,33333 0,55793 N15 - N9 0,11 0,55793 N16 - N2 0,0 0,55793 N16 - N3 -0,223333 0,55793 N16 - N4 -0,22 0,55793 N16 - N5 0,223333 0,55793 N16 - N6 0,0 0,55793 N16 - N7 *-1,77667 0,55793 N16 - N8 *-4,88667 0,55793 N16 - N9 0,556667 0,55793 N2 - N3 -0,223333 0,55793 N2 - N4 -0,22 0,55793 N2 - N5 0,223333 0,55793 N2 - N6 0,0 0,55793 N2 - N7 *-1,77667 0,55793 N2 - N8 *-4,88667 0,55793 N2 - N9 0,556667 0,55793 N3 - N4 0,00333333 0,55793 N3 - N5 0,446667 0,55793 N3 - N6 0,223333 0,55793 N3 - N7 *-1,55333 0,55793 N3 - N8 *-4,66333 0,55793 N3 - N9 *0,78 0,55793 N4 - N5 0,443333 0,55793 N4 - N6 0,22 0,55793 N4 - N7 *-1,55667 0,55793 N4 - N8 *-4,66667 0,55793 N4 - N9 *0,776667 0,55793 N5 - N6 -0,223333 0,55793 N5 - N7 *-2,0 0,55793 N5 - N8 *-5,11 0,55793 N5 - N9 0,333333 0,55793 N6 - N7 *-1,77667 0,55793 N6 - N8 *-4,88667 0,55793 N6 - N9 0,556667 0,55793 N7 - N8 *-3,11 0,55793 N7 - N9 *2,33333 0,55793 N8 - N9 *5,44333 0,55793 -* denotes a statistically significant difference Bảng 8: bảng ANOVA ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên chiều cao chồi ANOVA Table for CcaoCHOI by MOITRUONG Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14,2276 16 0,889227 15,66 0,0000 Within groups 1,93107 34 0,0567961 Total (Corr.) 16,1587 50 Table of mean Table of Means for CcaoCHOI by MOITRUONG with 95,0 percent LSD intervals Stnd error MOITRUONG Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit N0 1,77667 0,137594 1,57894 1,97439 N1 3,38333 0,137594 3,18561 3,58106 N10 2,46 0,137594 2,26228 2,65772 N11 2,47667 0,137594 2,27894 2,67439 N12 2,79 0,137594 2,59228 2,98772 N13 2,48333 0,137594 2,28561 2,68106 N14 2,74 0,137594 2,54228 2,93772 N15 2,86667 0,137594 2,66894 3,06439 N16 3,22 0,137594 3,02228 3,41772 N2 3,44 0,137594 3,24228 3,63772 N3 2,92333 0,137594 2,72561 3,12106 N4 3,44 0,137594 3,24228 3,63772 N5 3,14667 0,137594 2,94894 3,34439 N6 2,76333 0,137594 2,56561 2,96106 N7 2,66667 0,137594 2,46894 2,86439 N8 4,25667 0,137594 4,05894 4,45439 N9 2,81 0,137594 2,61228 3,00772 Total 51 2,9202 Bảng 9: Bảng trắc nghiệm LSD ảnh hưởng môi trường lên chiều cao chồi Multiple Range Tests for CcaoCHOI by MOITRUONG Method: 95,0 percent LSD MOITRUONG Count Mean Homogeneous Groups N0 1,77667 X N10 2,46 X N11 2,47667 XX N13 2,48333 XX N7 2,66667 XXX N14 2,74 XXX N6 2,76333 XXXX N12 2,79 XXXX N9 2,81 XXXX N15 2,86667 XXXX N3 2,92333 XXX N5 3,14667 XXX N16 3,22 XX N1 3,38333 X N4 3,44 X N2 3,44 X N8 4,25667 X Contrast Difference +/- Limits N0 - N1 *-1,60667 0,395449 N0 - N10 *-0,683333 0,395449 N0 - N11 *-0,7 0,395449 N0 - N12 *-1,01333 0,395449 N0 - N13 *-0,706667 0,395449 N0 - N14 *-0,963333 0,395449 N0 - N15 *-1,09 0,395449 N0 - N16 *-1,44333 0,395449 N0 - N2 *-1,66333 0,395449 N0 - N3 *-1,14667 0,395449 N0 - N4 *-1,66333 0,395449 N0 - N5 *-1,37 0,395449 N0 - N6 *-0,986667 0,395449 N0 - N7 *-0,89 0,395449 N0 - N8 *-2,48 0,395449 N0 - N9 *-1,03333 0,395449 N1 - N10 *0,923333 0,395449 N1 - N11 *0,906667 0,395449 N1 - N12 *0,593333 0,395449 N1 - N13 *0,9 0,395449 N1 - N14 *0,643333 0,395449 N1 - N15 *0,516667 0,395449 N1 - N16 0,163333 0,395449 N1 - N2 -0,0566667 0,395449 N1 - N3 *0,46 0,395449 N1 - N4 -0,0566667 0,395449 N1 - N5 0,236667 0,395449 N1 - N6 *0,62 0,395449 N1 - N7 *0,716667 0,395449 N1 - N8 *-0,873333 0,395449 N1 - N9 *0,573333 0,395449 N10 - N11 -0,0166667 0,395449 N10 - N12 -0,33 0,395449 N10 - N13 -0,0233333 0,395449 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N10 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N11 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N12 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N13 N14 N14 N14 - N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N12 N13 N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N13 N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N14 N15 N16 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N15 N16 N2 -0,28 *-0,406667 *-0,76 *-0,98 *-0,463333 *-0,98 *-0,686667 -0,303333 -0,206667 *-1,79667 -0,35 -0,313333 -0,00666667 -0,263333 -0,39 *-0,743333 *-0,963333 *-0,446667 *-0,963333 *-0,67 -0,286667 -0,19 *-1,78 -0,333333 0,306667 0,05 -0,0766667 *-0,43 *-0,65 -0,133333 *-0,65 -0,356667 0,0266667 0,123333 *-1,46667 -0,02 -0,256667 -0,383333 *-0,736667 *-0,956667 *-0,44 *-0,956667 *-0,663333 -0,28 -0,183333 *-1,77333 -0,326667 -0,126667 *-0,48 *-0,7 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 N14 - N3 N14 - N4 N14 - N5 N14 - N6 N14 - N7 N14 - N8 N14 - N9 N15 - N16 N15 - N2 N15 - N3 N15 - N4 N15 - N5 N15 - N6 N15 - N7 N15 - N8 N15 - N9 N16 - N2 N16 - N3 N16 - N4 N16 - N5 N16 - N6 N16 - N7 N16 - N8 N16 - N9 N2 - N3 N2 - N4 N2 - N5 N2 - N6 N2 - N7 N2 - N8 N2 - N9 N3 - N4 N3 - N5 N3 - N6 N3 - N7 N3 - N8 N3 - N9 N4 - N5 N4 - N6 N4 - N7 N4 - N8 N4 - N9 N5 - N6 N5 - N7 N5 - N8 N5 - N9 N6 - N7 N6 - N8 N6 - N9 N7 - N8 -0,183333 *-0,7 *-0,406667 -0,0233333 0,0733333 *-1,51667 -0,07 -0,353333 *-0,573333 -0,0566667 *-0,573333 -0,28 0,103333 0,2 *-1,39 0,0566667 -0,22 0,296667 -0,22 0,0733333 *0,456667 *0,553333 *-1,03667 *0,41 *0,516667 0,0 0,293333 *0,676667 *0,773333 *-0,816667 *0,63 *-0,516667 -0,223333 0,16 0,256667 *-1,33333 0,113333 0,293333 *0,676667 *0,773333 *-0,816667 *0,63 0,383333 *0,48 *-1,11 0,336667 0,0966667 *-1,49333 -0,0466667 *-1,59 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 0,395449 N7 - N9 -0,143333 0,395449 N8 - N9 *1,44667 0,395449 * denotes a statistically significant difference Thí nghiệm 4: Bảng 10: Bảng phân tích ANOVA ảnh hưởng môi trường lên số rễ ANOVA Table for SORE by MOITRUONG Analysis of Variance -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -Between groups 26,2667 6,56667 9,85 0,0017 Within groups 6,66667 10 0,666667 -Total (Corr.) 32,9333 14 Table of mean Table of Means for SORE by MOITRUONG with 95,0 percent LSD intervals -Stnd error MOITRUONG Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -R0 1,0 0,471405 0,257285 1,74271 R1 4,66667 0,471405 3,92395 5,40938 R2 2,66667 0,471405 1,92395 3,40938 R3 1,66667 0,471405 0,923952 2,40938 R4 1,33333 0,471405 0,590619 2,07605 -Total 15 2,26667 Bảng 11: Bảng trắc nghiệm LSD ảnh hưởng môi trường lên số rễ Multiple Range Tests for SORE by MOITRUONG -Method: 95,0 percent LSD MOITRUONG Count Mean Homogeneous Groups -R0 1,0 X R4 1,33333 XX R3 1,66667 XX R2 2,66667 X R1 4,66667 X -Contrast Difference +/- Limits -R0 - R1 *-3,66667 1,48543 R0 - R2 *-1,66667 1,48543 R0 - R3 -0,666667 1,48543 R0 - R4 -0,333333 1,48543 R1 - R2 *2,0 1,48543 R1 - R3 *3,0 1,48543 R1 - R4 *3,33333 1,48543 R2 - R3 1,0 1,48543 R2 - R4 1,33333 1,48543 R3 - R4 0,333333 1,48543 -* denotes a statistically significant difference Bảng 12: Bảng phân tích ANOVA ảnh hưởng môi trường lên chiều dài rễ ANOVA Table for CDaiRE by MOITRUONG Analysis of Variance -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -Between groups 23,7893 5,94733 11,85 0,0008 Within groups 5,02 10 0,502 -Total (Corr.) 28,8093 14 Table of mean Table of Means for CDaiRE by MOITRUONG with 95,0 percent LSD intervals -Stnd error MOITRUONG Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -R0 1,33333 0,409064 0,688838 1,97783 R1 4,23333 0,409064 3,58884 4,87783 R2 2,56667 0,409064 1,92217 3,21116 R3 1,3 0,409064 0,655505 1,94449 R4 0,7 0,409064 0,0555051 1,34449 -Total 15 2,02667 Bảng 13: Bảng trắc nghiệm LSD ảnh hưởng môi trường lên chiều dài rễ Multiple Range Tests for CDaiRE by MOITRUONG -Method: 95,0 percent LSD MOITRUONG Count Mean Homogeneous Groups -R4 0,7 X R3 1,3 XX R0 1,33333 XX R2 2,56667 X R1 4,23333 X -Contrast Difference +/- Limits -R0 - R1 *-2,9 1,28899 R0 - R2 -1,23333 1,28899 R0 - R3 0,0333333 1,28899 R0 - R4 0,633333 1,28899 R1 - R2 *1,66667 1,28899 R1 - R3 *2,93333 1,28899 R1 - R4 *3,53333 1,28899 R2 - R3 1,26667 1,28899 R2 - R4 *1,86667 1,28899 R3 - R4 0,6 1,28899 - denotes a statistically significant difference CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS (Murashige & Skoog, 1962) Khoáng đa lượng (mg/l) - Kali nitrat (KNO3) 1900 - Amoni nitrat (NH4NO3) 1650 - Canxi clorua (CaCl2.2H2O) 440 - Magie sulfat (MgSO4.7H2O) 370 - Kali monophosphat (KH2PO4) 170 Khoáng vi lượng (mg/l) - Boric acid (H3BO3) 6,2 - Mangan sulfat (MnSO4.4H2O) 22,3 - Kẽm sulfat (ZnSO4.7H2O) 8,6 - Kali iod (KI) 0,83 - Đồng sulfat (CuSO4.5H2O) 0,025 - Coban clorua (CoCl2.6H2O) 0,025 - Natri molypdat (Na2MoO4.2H2O) 0,25 - Na2EDTA.2H2O 37,3 - Sắt sulfat (FeSO4.7H2O) 27,8 - Glycine 2,0 - Nicotinic acid 0,5 - Piridoxin – HCL (B6) 0,5 - Thiamin – HCL (B1) 0,5 - Myo- inositon 100 Vitamine (mg/l) [...]... trong nhà kính sau in vitro 0 392±0 060 0 413±0 064 Sản phẩm Hà thủ ô đỏ 5 Vì vậy, nhân giống in vitro là phương pháp rất hiệu quả và phù hợp với cây hà thủ ô đỏ 1.2 Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng)... ra môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi và cụm chồi trong môi trường nuôi cấy in vitro cây hà thủ ô đỏ Lương Văn Thủy, năm 2007, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi và tạo callus của cây hà thủ ô đỏ Trần Thị Kim Thu, Trương Thị Bích Phượng, năm 2008, nghiên cứu nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Trên thế giới, năm 2003, Li Chang Lin... phạm vi nghiên cứu Đề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb , được thực hiện trên giống hà thủ ô đỏ do Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai cung cấp Phạm vi nghiên cứu của đề tài là nuôi cấy từ đoạn thân có chứa chồi ngủ cho đến tái sinh được hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro và chuyển cây ra vườn ươm 4 Phƣơng... lượng cây nhiều có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu về giống cây hà thủ ô đỏ của thị trường Tuy nhiên đề tài còn một số hạn chế chưa khắc phục được như: chưa khảo sát được một số yếu tố có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hà thủ ô trong điều kiện in vitro như: độ pH, ánh sáng và nhiệt độ nuôi cấy 6 Kết cấu của đề tài Đề tài “ Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ Polygonum. .. viên đã xây dựng một quy trình nhân giống hà thủ ô đỏ và đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong cây được nhân giống với cây trồng tự nhiên Đây là nghiên cứu có giá trị quan trọng đối với các công ty dược muốn chiết xuất hai chất này cho mục đích thương mại Tất cả các nghiên cứu trên, đều có đóng góp quan trọng cho việc nhân nhanh cây hà thủ ô đỏ cho mục đích thương mại, bảo tồn cây hà thủ ô đỏ 10... làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp 9 1.4 Các công trình nghiên cứu liên quan Ở trong nước, năm 2004, Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống vô tính cây hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro Sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây hà thủ ô đỏ của Huỳnh Thị Đan... nghiệm + Nuôi cấy mô thực vật - Phân tích và xử lý số liệu thống kê 5 Những đóng góp và mặt hạn chế Đề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb , đã được thực hiện và thu được những kết quả thiết thực trong việc tìm ra các môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi, nhân nhanh cụm chồi, tạo rễ và tìm ra được quy trình khử trùng mẫu Từ đó nhân giống được... bản: Tạo mẫu in vitro vô trùng Tăng sinh mẫu in vitro và tạo cây hoàn chỉnh Nuôi trồng thực nghiệm trong nhà kính với các điều kiện có kiểm soát và ngoài tự nhiên 1.2.2 Quy trình tạo mẫu chồi in vitro Quy trình tạo chồi in vitro quá trình khử trùng mẫu chồi bằng các thuốc khử trùng có sẵn: kháng sinh, thuốc diệt nấm, javel hoặc calcihypochloride, cồn Quá trình này được xây dựng từ quá trình khử trùng... MS có bổ sung BA, NAA, KIN Thông thường để tạo lượng chồi lớn phục vụ cho công tác nhân giống, môi trường nuôi cấy bổ sung chất kích thích phân hóa chồi thuộc nhóm Cytokinin (BA, KIN…) hoặc kết hợp giữa Cytokinin và Auxin (NAA, IAA…) với tỉ lệ thích hợp Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với khả năng tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ trong môi trường BA kết hợp KIN hoặc BA kết hợp NAA... 2011, môi trường phù hợp để tái sinh chồi là môi trường có bổ sung BAP 4mg/l + NAA 0,1mg/l, với trung bình 8,54 chồi/mẫu 3.3 Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ Giai đoạn nhân cụm chồi là một trong những giai đoạn tương đối quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro của hầu hết các loại thực vật nói chung và đối với cây hà thủ ô đỏ nói riêng Nếu như tìm được môi ... trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb Mục tiêu, mục đích đề tài - Mục tiêu: xây dựng quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ - Mục đích: Tạo giống hà thủ ô đỏ có... nuôi cấy in vitro 2 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Đề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb , thực giống hà thủ ô đỏ Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh... quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb 35 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô