Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro cây sa nhân tím nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro cây sa nhân tím (amomum longiligulare tlwu) pdf

LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian đƣợc học tập làm việc Viện Công nghệ sinh họcTrƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam mang đến cho hào hứng hành trang giúp chuẩn bị tốt cho công việc tƣơng lai Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tham gia thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Viện Trong q trình nghiên cứu tìm hiểu tơi định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)” làm khóa luận tốt nghiệp Để hồn thành đƣợc báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hồng Gấm - Bộ môn Công nghệ tế bào - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện hết mức, sát trực tiếp hƣớng dẫn suốt q trình thực hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ tế bào thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện q trình tơi thực đề tài Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2019 Sinh viên thực Đỗ Thanh Hằng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH .vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .2 1.1 Đặc điểm hình thái phân bố Sa nhân tím 1.1.1 Đặc điểm hình thái .2 1.1.2 Phân bố 1.2 Đặc điểm sinh thái, sinh học 1.3 Giá trị kinh tế, dƣợc học bảo tồn 1.3.1.Giá trị kinh tế 1.3.2.Giá trị dƣợc học 1.3.3.Giá trị môi trƣờng bảo tồn 1.4 Tình hình nghiên cứu Sa nhân tím ni cấy mô Việt Nam giới 1.4.1 Một số kết nghiên cứu invitro loài Sa nhân tím Việt Nam 1.4.2 Một số kết nghiên cứu in vitro loài Sa nhân tím giới 1.5 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro Họ Gừng Việt Nam giới .9 PHẦN 12 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tƣợng, vật liệu địa điểm nghiên cứu 12 2.2 Mục tiêu nghiên cứu 12 2.3 Nội dung nghiên cứu 12 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Phƣơng pháp luận 13 2.4.2 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 13 2.4.3 Phƣơng pháp thu thập xử lí số liệu 16 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 17 ii 3.1 Tạo mẫu in vitro 17 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi in vitro 19 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng NAA đến khả rễ in vitro Sa nhân tím 22 PHẦN 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 4.1 Kết luận 28 4.2 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Từ viết tắt BAP Benzylamino purine-6 IBA Indole-3- butyric acid Ki Furfuryamino purine-6 NAA Naphthylacetic acid ĐHST Điều hòa sinh trƣởng MS Murashige&Skoog, 1962 CTTN Cơng thức thí nghiệm TB Trung bình Cs Cộng Sig Mức ý nghĩa (Significant) IAA Acid Indolacetic iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu 14 Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Sa nhân tím 14 Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng nồng độ NAA đến phát triển rễ Sa nhân tím 15 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng tỷ lệ phối trộn nguyên liệu đến phát triển 15 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu .17 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng BAP NAA đến khả nhân nhanh chồi Sa nhân tím 19 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ NAA đến khả rễ Sa nhân tím 22 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng tỷ lệ phối trộn nguyên liệu đến phát triển .25 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Sa nhân tím (A) Quả Sa nhân tím (B) Hình 3.1a: Mẫu ban đầu 18 Hình 3.1b: Các kết mẫu từ Sa nhân tím đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy khởi động thu đƣợc sau tuần 18 Hình 3.2a: Các cơng thức nhân nhanh chồi Sa nhân tím sau tuần ni .21 Hình 3.2c Chồi phát triển tốt để đƣa rễ 21 Hình 3.3a: Cây Sa nhân tím rễ môi trƣờng khác 23 Hình 3.3b: Cây Sa nhân tím hồn chỉnh 24 Hình 3.5a: Cây bắt đầu cấy vào giá thể 26 Hình 3.5b: Cây Sa nhân tím in vitro trồng giá thể khác sau tuần 26 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc chi Sa nhân (Amomum), họ gừng (Zingiberaceae) Đây thuốc quý, có danh mục thực vật rừng quý ban hành kèm theo nghị định số 18-HĐBT ngày 17/01/1992 (Hội đồng Bộ trƣởng, 1992) [5] Quả Sa nhân chứa tinh dầu với nhiều hợp chất hóa học giá trị nhƣ: camphen, β-pinen, limonen, camphor; borneol, saponin (Nguyễn Đức Minh et al.,1994) Tinh dầu Sa nhân có tác dụng kháng khuẩn nấm (Đỗ Thị Hoa Viên et al., 1994; Sabulal et al., 2006; Aneja, Joshi 2009; Li et al., 2011) Sa nhân đƣợc sử dụng nhiều thuốc đơng y nhƣ: Chữa có thai bị lạnh bụng, đầy hơi, tiểu tiện không thông; chữa tiêu chảy; chữa ăn không tiêu, nôn mửa, đau bụng; chữa đau nhức răng; chữa tê thấp…(Đỗ Tất Lợi, 2003) Ngoài ra, Sa nhân đƣợc biết đến loại gia vị đắt thứ ba giới sau Saffron vanilla (Đỗ Năng Vịnh et al., 2006) Hiện nay, rừng tự nhiên bị tàn phá nghiêm trọng Cây dƣợc liệu bị khai thác tự nên diện tích sản lƣợng ngày suy giảm, nhu cầu sử dụng thuốc đơng dƣợc để chăm sóc bảo vệ sức khỏe ngày cao Để giải vấn đề phát triển dƣợc liệu có Sa nhân tím, khắc phục khó khăn địi hỏi phải có hệ thống giải pháp toàn diện quản lý, quy hoạch vùng ngun liệu, quy trình cơng nghệ Nhân giống in vitro nhờ có ƣu điểm cho hệ số nhân giống cao, thực trở thành giải pháp cần thiết cơng tác giống trồng, góp phần phát triển nguồn dƣợc liệu Chính mà định chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro Sa nhân tím(Amomum longiligulare T.L.Wu)” nhằm góp phần bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật làm sở cho việc nhân nhanh loài dƣợc liệu này, cung cấp nguồn giống chất lƣợng cao để mở rộng vùng dƣợc liệu Sa nhân nƣớc PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm hình thái phân bố Sa nhân tím 1.1.1 Đặc điểm hình thái Nhắc đến Sa nhân tím cịn có số tên khác nhƣ: Mè tré bà, co nẻnh (Thái), mác nẻnh (Tày), Sa ngần (Dao), pa dóoc (K’Dong), la vê (Ba Na), Sa nhân lƣỡi dài, Hải nam Sa nhân [1,2] Sa nhân tím thân thảo, sống lâu năm, cao 1,5- 2,5 m Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23- 30 cm, rộng 5- cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt bóng, lƣỡi bẹ mỏng, xẻ đơi; cuống dài 510 mm [1,2] Cụm hoa mọc từ thân rễ thành bông, có 5- hoa màu trắng; bắc ngồi hình bầu dục, màu nâu, bắc dạng ống; đài dài 1,5 cm, có nhọn; tràng hình ống dài 1,3- 1,5 cm, chia thùy, mặt ngồi có lơng thƣa, thùy giƣa hình trứng ngƣợc, hai thùy bên hẹp; cánh mơi gần trịn, đƣờng kính 2- 2,6 cm, lõm, mép màu vàng, có sọc đỏ, đầu cánh mơi xẻ hai thùy nhỏ gập phía sau, khơng có nhị lép, nhị dài bao phấn; bầu hình trụ trịn, phình giữa, có lơng trắng [1] Quả hình cầu, chín có màu nâu đen, đƣờng kính 1,3- cm, mặt ngồi có gai ngắn, chia ơ; hạt có áo, đa dạng, đƣờng kính 3- mm [1] Nhiều loài khác mang tên Sa nhân đƣợc dùng nhƣ Amomum vespertilis Gagnep (Sa nhân thầu dầu), A mengtzense Tsai Chen (Sa nhân khế), A pavieanum Gagnep (Sa nhân sung), A aurantiacum H.T Tsai (Sa nhân đỏ), A schmidtii Gagnep (Sa nhân hồi), A biflorum Jack (Sa nhân hai hoa), A repens Sonn (Sa nhân trúc sa), A repoense Pierre (Sa nhân cánh) [1] A B Hình 1.1 Cây Sa nhân tím (A) Quả Sa nhân tím (B) (Nguồn ảnh: Sa nhân tím xuất xứ Sơn Long Trung tâm Nghiên cứu Lâm sản gỗ, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam nghiên cứu chọn tạo) 1.1.2 Phân bố Chi Amomum Roxb có khoảng 250 lồi giới, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, đặc biệt khu vực nhiệt đới Đông Nam Nam Á Ở Việt Nam, có khoảng 30 lồi; Borneo 30 lồi, Java 13 lồi, Malaysia 18 lồi Sa nhân tím có vùng phân bố từ đảo Hải Nam- Trung Quốc, đến vùng Trung Lào Việt Nam Ở Việt Nam, Sa nhân tím phân bố tập trung tỉnh Tây Nguyên Những địa điểm có nhiều Sa nhân tím huyện M’Đrắc (Đắc Lắc); An Khê K’Bang (Gia Lai); Vĩnh Thạch (Bình Định); Sơng Hinh (Phú n); Ba Tơ (Quảng Ngãi)… Ở Sa nhân tím mọc tƣơng đối tập trung xen lẫn với loài Sa nhân trắng, diện tích hàng ngàn hecta rừng Trong tỉnh phía Bắc nhƣ Phú Thọ, Thái Bình, Hịa Bình, Hải Dƣơng, Sa nhân tím mọc với trữ lƣợng trạng thái hoang dại trồng vƣờn [1] 1.2 Đặc điểm sinh thái in c Sa nhân tím ƣa ẩm, chịu bóng (20- 50%) dƣới tán rừng; chịu sáng trƣờng hợp mọc thành quần thể lớn loài đất sau nƣơng rẫy Cây thƣờng mọc thành đám ven rừng kín thƣờng xanh, rừng thứ sinh dọc theo hành lang ven suối; sinh chồi gốc khỏe vào vụ xuân- hè hèthu Số nhánh đƣợc sinh hệ tăng theo cấp số nhân với công bội 1- nghĩa là, số nhánh sinh hệ gấp đôi số nhánh có hệ trƣớc cộng thêm (đó mẹ ban đầu) Do qua nghiên cứu trồng Sa nhân tím Vĩnh Trạch (Bình Định), Tân Lạc (Hịa Bình), n Lập (Phú Thọ)… thấy từ nhánh ban đầu, sau 16- 20 tháng tuổi tạo thành khóm Sa nhân trung bình từ 5- Ở khóm cực đại có đến 15- 17 [1] Sa nhân tím có hoa gần nhƣ quanh năm.Tuy nhiên, nhiều nơi có vụ hoa năm Ở vụ xuân- hè, hoa tháng 3, già vào khoảng tháng 6- 7, vụ hoa Vụ hoa phụ bắt đầu khoảng tháng 7, già vào tháng 11 Hoa sinh từ gốc sau năm tuổi Cây trồng đƣợc 16- 20 tháng tuổi, có 28,2- 40% số nhánh có hoa Trong quần thể Sa nhân tím trồng lâu năm (3- năm) hay quần thể tự nhiên, tỷ lệ số nhánh có hoa 70% So với vài loài Sa nhân đƣợc nghiên cứu Việt Nam (ví dụ lồi A villosum Lour), lồi Sa nhân tím hoa tƣơng đối hàng năm; tỷ lệ đậu cụm hoa cao Bởi lẽ, vụ hoa Sa nhân tím sớm lồi Sa nhân khác Vào thời điểm đó, thời tiết mƣa (ở miền nam mùa khô) nên thụ phấn hoa có hiệu [1] Việt Nam nƣớc có nguồn Sa nhân mọc tự nhiên phong phú khu vực Theo số thống kê chƣa đầy đủ, năm, khai thác từ vài trăm đến 1000 Sa nhân khô chủ yếu dành cho xuất Tuy nhiên, với cách khai thác thiếu hƣớng dẫn nhƣ nay, phần lớn non chƣa đủ tiêu chuẩn thƣơng phẩm Kết hợp với chủ trƣơng giao đất giao rừng cho nông dân, cần có kế hoạch phát triển trồng thêm Sa nhân Sa nhân tím Lào, Thái Lan Trung Quốc nƣớc đầu việc trồng Sa nhân bán tự nhiên Riêng tỉnh Vân Nam (Trung Quốc), vài năm gần trồng đƣợc 13.000 hecta Sa nhân đất rừng, góp phần phủ xanh chống xói mịn có hiệu [1] 1.3 Giá trị kinh tế, dƣợc h c bảo tồn Việt Nam số quốc gia có nguồn Sa nhân mọc tự nhiên phong phú Dƣợc liệu Sa nhân nƣớc ta thực tế đƣợc thu hái từ lên 1,0mg/l, rễ trở nên mảnh hơn, số rễ giảm (1,90 rễ/chồi), rễ dài mảnh Và nồng độ yếu so với nồng độ khác Điều cho thấy nhu cầu sử dụng Auxin Sa nhân tím cho trình hình thành rễ thấp Ở nồng độ NAA cao gây ức chế khả rễ So sánh với kết nghiên cứu Đặng Ngọc Phúc đồng tác giả (2011), rễ đƣợc cảm ứng thời gian tuần môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA đạt 18,42 rễ/chồi [9] Với nồng độ BAP để cảm ứng rễ, nhƣng rút ngắn thời gia tuần Trƣơng Thị Bích Phƣợng đồng tác giả (2017), rễ đƣợc cảm ứng tốt mơi trƣờng MS có bổ sung 0,6 mg/l NAA cho số rễ cao (7,17 rễ/chồi) rễ phát triển nhanh chiều dài môi trƣờng bổ sung 0,4 mg/l IBA (3,89 cm) [12] Nhƣ vậy, chọn đƣợc môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi rễ cao đạt 93,33% R1 R2 R3 R4 R4 Hình 3.3a: Cây Sa nhân tím rễ mơi trƣờng khác 23 R1 R2 R3 R4 Hình 3.3b: Cây Sa nhân tím hồn chỉnh 3.4 Kết nghiên cứu ản ƣởng giá thể đến khả ống Sa nhân tím Giá thể ƣơm vƣờn ƣơm yếu tố quan trọng định đến tỷ lệ sống, sinh trƣởng phát triển in vitro hoàn chỉnh Chọn giá thể tỷ lệ phối trộn giá thể phù hợp không đảm bảo tốt cho trình phát triển mà cịn thuận lợi cho q trình hóa canh tác sau đƣa khỏi bình ni cấy Mỗi lồi thích hợp với giá thể khác Giá thể sử dụng phải đáp ứng đủ nhu cầu dinh dƣỡng độ ẩm để thích nghi với mơi trƣờng bên ngồi, sinh trƣởng phát triển tốt 24 Vì thí nghiệm giai đoạn này, đất phù sa, mùn hữu cơ, trấu hun cát giá thể đƣợc sử dụng để vƣờn ƣơm Cây in vitro hồn chỉnh có chiều cao khoảng 5,0- 6,5cm, với 4- Cây đƣợc trồng trực tiếp hỗn hợp loại giá thể khác đất phù sa, trấu hun mùn hữu Kết sau tuần theo dõi đƣợc thể bảng 3.4 Bảng 3.4: Ản CTTN ƣởng tỷ lệ phối trộn nguyên liệu đến phát triển Tỉ lệ nguyên liệu (p ần) Mùn Đất Trấu Cát cƣa phù sa hun vàng Tỷ lệ ống (%) SN1 - 70% SN2 1 1 40% SN3 - - 60% Sig Đặc điểm Cây k ỏe xan đậm có p át triển đỉn in trƣởng c ất lƣợng tốt Lá xanh nhạt, phát triển chậm Cây khỏe, xanh, phát triển 0,0001 Kết cho thấy tỷ lệ sống có Sig nhỏ 0,05 nên thấy đƣợng có khác biệt cơng thức thí nghiệm kết nghiên cứu có ý nghĩa Trong q trình thực hiện, có khơng sống sót đƣợc giá thể mùn hữu chặt giữ nƣớc nên in vitro dễ bị úng gây thối rễ Do việc bổ sung thêm trấu hun, giúp thống khí Cây in vitro mà có kết hợp trấu hun mùn hữu với giá thể đất phù xa cho tỷ lệ sống sót đạt 70 %- mức sống cao Cây có vƣơn cao đỉnh sinh trƣởng, non mọc lên, màu xanh đậm, có sức sống tốt Tuy nhiên, rễ in vitro nên phát sinh yếu tốc độ sinh trƣởng cịn chậm Mới đƣa mơi trƣờng bên ngồi chƣa kịp thích ứng hay bị tác nhân có hại bên ngồi xâm nhiễm gây tổn thƣơng làm hại cho Vì cần có biện pháp chăm sóc tốt cho in vitro đƣa bên 25 So sánh với kết nghiên cứu Đặng Ngọc Phúc đồng tác giả (2011), in vitro đƣợc trồng giá thể trộn đất phù sa : trấu hun : mùn hữu cho tỷ lệ sống cao đạt 93,14% [9] Phần lựa chọn giá thể cho Sa nhân tím, tơi thu đƣợc giá thể thích hợp nhƣ nghiên cứu tác giả, nhiên bƣớc đầu tỷ lệ sống mà thu đƣợc thấp hơn, đạt 70% Giai đoạn lựa chọn giá thể phù hợp cho con, tơi có chọn trấu hun thêm cát để thử nghiệm có kết định Nhƣ vậy, giá thể mà chọn cho in vitro mùn hữu cơ: trấu hun: đất phù sa tƣơng ứng với tỷ lệ 1:1:2 SN1 SN3 SN2 Hình 3.5a: Cây bắt đầu cấy vào giá thể SN3 SN2 SN1 Hình 3.5b: Cây Sa nhân tím in vitro trồng giá thể khác sau tuần 26 SƠ ĐỒ HĨA QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO SA NHÂN TÍM Trên sở kết thu đƣợc tơi đƣa quy trình nhân giống in vitro Sa nhân tím nhƣ sau: Gốc thân ( mang chồi nách) Khử HgCl2 0,1% phút + cồn 70o 60 giây + cefotaxim 15 phút Mẫu Nuôi tuần: MS0 Mẫu tái sinh chồi Nhân nhanh chồi 10 tuần: MS + 1,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA Cụm chồi Ra rễ tuần: MS + 0,5 mg/l NAA Cây hoàn chỉnh Giá thể (đất phù sa : trấu hun : mùn hữu = 2:1:1) tuần Cây vƣờn ƣơm 27 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Chúng xây dựng đƣợc quy trình nhân giống in vitro Sa nhân tím (1) Chồi ngủ gốc thân đƣợc khử trùng HgCl2 0,1% phút cho tỷ lệ mẫu cao đạt 83,33% (2) Chồi in vitro đƣợc nhân nhanh môi trƣờng MS bổ sung 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,25 mg/l NAA đạt hệ số nhân chồi cao 9,45 chồi/ mẫu (3) Rễ đƣợc cảm ứng môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệ rễ cao 93,33% (4) Cây in vitro đƣợc trồng giá thể trộn đất phù sa : trấu hun : mùn hữu cho tỷ lệ sống cao đạt 70,00% Quy trình vi nhân giống áp dụng để sản xuất hàng loạt Sa nhân tím chất lƣợng tốt, đáp ứng nhu cầu nguồn giống Sa nhân tím 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu chế độ chăm sóc vƣờn ƣơm để đánh giá chất lƣợng nuôi cấy in vitro 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Việt Nam Đỗ Huy Bích Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Võ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Viện Dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật: 643-645 Võ Văn Chi (2012), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội: 637 Trần Việt Hà, Nguyễn Văn Việt, Đoàn Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Huyền, Đinh Văn Hùng, Sounthone Douangmala (2018), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhân giống Gừng gió (Zingiber zerumbet), Tạp chí KH-CN Lâm nghiệp (6): 10-16 Trần Thị Thu Hà đồng tác giả, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên, nghiên cứu khả nhân chồi Sa nhân tím (Amomum longiligulare) vƣờn ƣơm, Tạp chí KH CN 108(08): 93-97 Hội đồng trƣởng (1992) Quy định danh mục thực vật rừng, động vật rừng quý chế độ quản lý, bảo vệ (số 18-HĐBT ngày 17-1-1992) Nguyễn Văn Hồng, Trần Thị Tý (2013), Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) phƣơng pháp ni cấy mơ tế bào thực vật, Tạp chí Khoa học công nghệ 108(08): 105-112 Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Nguyễn Đức Minh, Ngô Văn Thông, Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Ngọc Tú (1994), Nghiên cứu thành phần hóa học hạt Sa nhân (Amomum longiligulare T.L.Wu), Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp Thực phẩm 390 (12): 464-465 Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dƣơng Thị Thùy Châu, Trƣơng Thị Bích Phƣợng (2011), Nhân giống in vitro Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 9(4A): 689-698 10 Nguyễn Thanh Phƣơng (2011), Nghiên cứu gây trồng Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) tỉnh Quảng Ngãi, Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ 11 Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Nguyễn Thành, Nguyễn Đức Tuấn, Nguyễn Đức Chung (2016), Nuôi cấy callus Sa nhân trắng (Anmomum xanthioidex L.), Báo cáo Khoa học Hội nghị Quốc gia Nghiên cứu Giảng dạy Sinh học Việt Nam, Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nhà xuất Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội: 1168-1175 12 Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Thân Trọng Bảo Khánh, Nguyễn Đức Tuấn, Nguyễn Thị Thu Liên, Nguyễn Thị Tân (2017), nhân giống in vitro Sa nhân huyện A Lƣới, tỉnh Thừa Thiên Huế, Đại học Huế 13 Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Trần Thị Bích Nga, Nguyễn Đức Tuấn, Ngô Thị Minh Thu, Trần Thị Thu Hà (2018), Nghiên cứu nhân giống in vitro Gừng (Zingiber officinale Rosc.) Huế, Tạp chí khoa học nông nghiệp 14 Nguyễn Phƣơng Quý, Phạm Thị Kim Hạnh, Lê Quỳnh Mai, Lê Khả Tƣờng (2017), Nhân giống vô tính giống Gừng trâu (Zingiber officinale (Willd.) Roscoe) ni cấy cắt lát tế bào in vitro, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S: 127-133 15 Nguyễn Tập (2007), “Sa nhân tím”, Nxb Lao Động, Hà Nội 16 Lƣu Ngọc Trình, Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Trần Danh Sửu, Hoàng Thị Huệ (2003), Nghiên cứu thăm dị quy trình vi nhân giống hai lồi hoa riềng tía nghệ đỏ làm hoa cảnh, Báo cáo khoa học, Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 17 Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Ngọc Tú, Nguyễn Đức Minh, Ngơ Văn Thơng (1994), Nghiên cứu tính kháng khuẩn hạt Sa nhân TC Nông nghiệp Công nghiệp Thực phẩm 390 (12): 466-467 Tài liệu nƣớc 18 Aneja RK, Joshi R (2009) Antimicrobial activity of Amomum subulatum and Elettariacardamomum against dental caries causing microorganisms, Ethnobotanical Leaflets 13: 840-849 19 Hongdong X, Lei N, Yuchai X (2006) Tissue culture and rapid propagation of Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire Chinese wild plant resources 3: 61-63 20 Hong H, Na TL (2005) Tissue culture and plantlet regeneration of Amomum villosum Plant physiology communications 1: 57-61 21 Hoque M I., Perveen S and Sarker R H (1999) In vitro propagation of Ginger (Zingiber officinales Rocs.)Plant tissue cult 9: 45-51 22 Krishna Lal Poudel, Hari Kumar Prasai, Jiban Shrestha (2018), Micropropagation and Acclimatization of Large Cardamom (Amomum subulatum Roxb), Published 2018 23 Li W, Wang JP, Shigematsu M, Lu GZ (2011) Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from Amomum Tsao-Ko cultivated in Yunnan area Advanced Materials Research 183: 910-914 24 Pradhan S., Pradhan S., Basistha B.C and Subba K B (2014), In vitro micropropagation of Amomum subulatum (Zingiberaceae), a major traditional cash crop of Sikkim Himalaya, Int Jounal of LifeSc Bt& Pharm Res, April 2014, 3(2): 169-180 25 Rao M, Wenli Z, Fanhua W, Chunlin Q, Guixiu H (2003) In vitro Culture of Amomum longiligulare T L Wu Chinese jounal of tropical agriculture 4: 1-4 26 Rao M, Wenli Z, Fanhua W, Chenghe H (2004), Tissue Culture of Amomum krervanh Plant physiology communications, 2: 208-211 27 Sabulal B, Dan M, Pradeep S N, Valsamma K R, Georg V (2006) Composition and antimicrobial activity of essential oil from the fruits of Amomum cannicarpum Acta Pharm, 56: 473-480 28 Sajina A, Mini MP, John ZC, Babu NK, Ravindran NP, Perter VK (1997) Micropropagation of large cardamom (Amomum subulatum Roxb) Journal of Spices and Aromatic Crops (2): 145-148 29 S Balachandran, Sripad R Bhat, Khushboo Chandel, In vitro clonal multiplication of turmeric (Curcuma spp.) and ginger (Zingiber officinale Rosc.), Published in Plant Cell Reports 1990 30 S Pradhan, BC Basistha, KB (2014) In vitro micropropagation of Amomum subulatum (zingiberaceae), a major traditional cash crop of Sikkim HimalayaS Pradhan, B C Basistha, K B SubbaInt J LifeSc Bt& Phar Res 3(2): 169180 PHỤ BIỂU Phụ biểu 1: Kiểm tra tỷ lệ mẫu Gốc thân Sa nhân tím có thời gian khử trùng HgCl2 0,1% khác Case Processing Summary Cases Valid N CT * mausach Missing Percent 270 N Total Percent 100.0% N 0.0% Percent 270 100.0% CT * mausach Crosstabulation mausach 00 Count Total 1.00 15 75 90 16.7% 83.3% 100.0% 57 33 90 63.3% 36.7% 100.0% 69 21 90 76.7% 23.3% 100.0% 141 129 270 52.2% 47.8% 100.0% KT1 % within CT Count CT KT2 % within CT Count KT3 % within CT Count Total % within CT Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2sided) a 000 Likelihood Ratio 76.587 000 Linear-by-Linear Association 64.688 000 Pearson Chi-Square N of Valid Cases 71.608 270 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 43.00 Phụ biểu 2: Kiểm tra hệ số nhân nhanh chồi in vitro nồng độ BAP khác Test of Homogeneity of Variances hesonhannhanh Levene Statistic df1 376 df2 Sig 10 821 ANOVA hesonhannhanh Sum of Squares df Mean Square F Between Groups 50.811 12.703 Within Groups 10.835 10 1.084 Total 61.647 14 11.723 Sig .001 Phụ biểu 3: Kiểm tra chiều cao trung bình chồi in vitro Test of Homogeneity of Variances chieucaochoi Levene Statistic df1 271 df2 Sig 10 890 ANOVA chieucaochoi Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square F 2.394 599 530 10 053 2.924 14 11.292 Sig .001 Phụ biểu 4: Kiểm tra số rễ trung bình/ in vitro Test of Homogeneity of Variances Soretb Levene Statistic df1 2.717 df2 Sig 115 ANOVA Soretb Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 637.463 212.488 61.041 7.630 698.504 11 Within Groups Total 27.848 000 Phụ biểu 5: Kiểm tra tỷ lệ cảm ứng tạo rễ in vitro nồng độ NAA khác Case Processing Summary Cases Valid N CT * socayrare Missing Percent 360 N Total Percent 100.0% N 0.0% Percent 360 CT * socayrare Crosstabulation socayrare 00 Count Total 1.00 12 78 90 13.3% 86.7% 100.0% 84 90 6.7% 93.3% 100.0% 21 69 90 23.3% 76.7% 100.0% 78 12 90 86.7% 13.3% 100.0% 117 243 360 32.5% 67.5% 100.0% R1 % within CT Count R2 % within CT CT Count R3 % within CT Count R4 % within CT Count Total % within CT Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2sided) a 000 Likelihood Ratio 170.779 000 Linear-by-Linear Association 114.575 000 Pearson Chi-Square N of Valid Cases 166.268 360 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 29.25 Phụ biểu 6: Kiểm tra chiều dài rễ hồn chỉnh Sa nhân tím 100.0% Test of Homogeneity of Variances chieudaire Levene Statistic df1 3.332 df2 Sig 077 ANOVA chieudaire Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square F 1.731 577 919 115 2.650 11 Sig 5.020 030 Phụ biểu 7: Kiểm tra tỷ lệ Sa nhân tím sống sót giá thể khác Case Processing Summary Cases Valid N CT * caysongsot Missing Percent 270 N Total Percent 100.0% N 0.0% Percent 270 CT * caysongsot Crosstabulation caysongsot 00 Count Total 1.00 27 63 90 30.0% 70.0% 100.0% 54 36 90 60.0% 40.0% 100.0% 36 54 90 40.0% 60.0% 100.0% 117 153 270 43.3% 56.7% 100.0% SN1 % within CT Count CT SN2 % within CT Count SN3 % within CT Count Total % within CT Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2sided) 100.0% Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a 000 17.245 000 1.826 177 17.104 270 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 39.00 Phụ biểu 8: Thành phần môi trƣờng MS đƣợc sử dụng nghiên cứu Ký iệu môi trƣờng Đa lƣợng MS I MS II T àn p ần K ối lƣợng (mg/l) NH4NO3 MgSO4.7H2O KNO3 K2SO4 KH2PO4 CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O 1650 370 1900 170 332,2 FeSO4.7H2O Na2EDTA MnSO4.7H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O 27,8 37,3 16,9 8,6 6,2 0,83 0,025 0,025 0,25 Myo- inositol Glycine Nicotinic acid Pyridoxxin HCl Thiamin HCl 100 0,5 0,5 0,1 Vi lƣợng MS III MS IV Vitamin MS V