Nghiên cứu nhân giống song mật (calamus platyacanthus warb ex beccc) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy in vitro đến khả năng tạo cụm chồi Song mật .... DANH MỤC CÁC BẢNG 2.1 Các công thức khử trùng chồi măng 2.2 Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khoá học Thạc sĩ tại trường Đại học Lâm nghiệp, được sự đồng ý của Lãnh đạo Nhà trường, Khoa Đào tạo sau Đại học, Khoa Lâm học, Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học đã cho phép tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kỹ

thuật nhân giống Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex Becc) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro” dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Hà Văn Huân – Trung

tâm Giống và CNSH, Khoa Lâm học, trường Đại học Lâm nghiệp

Trong quá trình thực tập làm luận văn tốt nghiệp, tôi nhận được sự giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi của lãnh đạo Trường Đại học Lâm nghiệp, Khoa Đào tạo sau Đại học, Khoa Lâm học, Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hà Văn Huân, người đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận

Xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Huệ, Chủ nhiệm đề tài cấp Bộ “Nghiên

cứu tạo cây con Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex becc) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”, đã cho phép tôi tham gia trực tiếp vào toàn bộ các nội dung

nghiên cứu thực nghiệm cuả đề tài và được phép sử dụng một phần kết quả của đề tài để báo cáo trong luận văn tốt nghiệp này Xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Văn Giảng - Giám đốc Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học, ThS Nguyễn Thị Hồng Gấm đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi và có nhiều đóng góp quý báu cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ thuộc: Trung tâm Giống và CNSH, Khoa Lâm học, Khoa Đào tạo sau Đại học đã tận tình truyền đạt những kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp, gia đình và người thân đã luôn ủng hộ, động viên, giúp tôi vượt qua các khó khăn trong suốt quá trình học tập và công tác

Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, tháng 11 năm 2012

Học viên

Trần Thị Thời

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục các từ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Đại cương về nuôi cấy mô- tế bào Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 1.1.3 Một số phương thức nhân giống in vitro 2

1.1.4.Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro 5

1.1.5 Những vấn đề trong nhân giống in vitro 7

1.1.6 Thành tựu nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro 8

1.1.7 Ý nghĩa của kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật 10

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 11

1.2.1 Tổng quan về Song mây 11

1.2.2 Tổng quan về Song mật 12

1.2.3 Một số nghiên cứu nhân giống Song mật 13

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro 17

2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro 17

2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi 18

2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ 18

2.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro ở nhà lưới/vườn ươm 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro 19

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi 22

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ 24

2.3.5 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro ở nhà lưới/vườn ươm 25 2.3.6 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro 29

3.2 Kết quả nghiên cứu tạo cụm chồi 32

3.2.1 Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng làm vật liệu tạo cụm chồi 32

3.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy in vitro đến khả năng tạo cụm chồi Song mật 34

3.2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi 35

3.2.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi in vitro 36

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo cụm chồi Song mật 39

3.3 Kết quả nghiên cứu nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi 41

3.3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh

chồi in vitro 41

3.3.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến kích thích tăng trưởng chồi 44

3.4 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật tạo cây hoàn chỉnh 46

3.4.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ in vitro 47 3.5 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây Song mật in vitro trồng ở vườn ươm 50

3.5.1 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây Song mật in vitro tại vườn ươm 50

KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 57

1 Kết luận 57

2 Tồn tại và khuyến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kinetin 6- furfuryl amino purine

MS Murashige & Skoog 1962 (Môi trường MS 1962)

NaOCl Natri hypoclorit

% w/v Phần trăm khối lượng trên thể tích

% v/v Phần trăm thể tích trên thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Các công thức khử trùng chồi măng

2.2 Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến khả năng tạo

cụm chồi

2.3 Ảnh hưởng hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo cụm chồi

2.4 Ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo

cụm chồi

2.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi tối đến khả năng tạo cụm chồi

2.6 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng tạo cụm chồi

2.7 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân

nhanh chồi

2.8 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân

nhanh chồi

2.9 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ

2.10 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ

2.11 Ảnh hưởng của thành phần phối trộn trong ruột bầu đến khả

năng sống và sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm

2.12 Ảnh hưởng của chế độ che sáng trong vườn ươm đến khả năng

sống và sinh trưởng của cây

3.1 Kết quả tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng Song mật

3.2 Kết quả ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến khả năng

tạo cụm chồi

3.3 Kết quả ảnh hưởng phối hợp các chất ĐHST đến khả năng tạo

cụm chồi

3.4 Kết quả ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả

năng tạo cụm chồi

3.5 Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi tối đến khả năng tạo cụm chồi

3.6 Kết quả ảnh hưởng của cường độ ánh sáng giàn nuôi đến khả

năng tạo cụm chồi

3.7 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng

nhân nhanh chồi Song mật in vitro

3.8 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng

kích thích tăng trưởng chồi

3.9 Kết quả ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ của chồi

3.10 Kết quả ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ

3.11 Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống

và sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm

3.12 Kết quả ảnh hưởng của độ che sáng trong vườn ươm đến khả

năng sống sống sinh trưởng của cây

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Biểu đồ ảnh hưởng của công thức khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch

và tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm

3.2 Chồi măng trước khi vào mẫu

3.3 Chồi măng nảy mầm

3.4 Biểu đồ ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến đến khả

năng tạo cụm chồi in vitro

3.5 Chồi măng tạo cụm chồi

3.6 Biểu đồ ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo cụm chồi

3.7 Cụm chồi Song mật in vitro trong môi trường Ph8 (A), Ph4 (B)

và Ph9 (C)

3.8 Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng

tạo cụm chồi

3.9 Cụm chồi trên môi trường MS (A) và 2MS (B)

3.10 Cụm chồi trên môi trường MS*

3.11 Biểu đồ ảnh của chất điều hòa sinh trưởng đến hệ số nhân nhanh chồi

3.12 Chồi sau 4 tuần ở môi trường NC11 (A) và NC6 (B)

3.13 Biểu đồ ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng

kích thích tăng trưởng chồi Song mật in vitro

3.14 Chồi tăng trưởng ở công thức KT8 (A) và KT 11 (B)

3.15 Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp của IBA và NAA đến khả năng ra

rễ in vitro

3.16 Chồi Song mật ra rễ trên môi trường R5

3.17 Cây con tạo ra trông môi trường MS (A) và 1/2MS* (B)

3.18 Biểu đồ ảnh hưởng của giá thể trồng cây đến khả năng sống và

sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm

3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của độ che sáng trong vườn ươm đến tỷ lệ

sống của cây con

3.20 Cây Song mật in vitro sau khi cấy vào bầu đất

3.21 Cây Song mật ở vườn ươm sau 04 tuần với độ che sáng 75%

3.22 Cây Song mật ở vườn ươm sau 08 tuần

3.23 Cây Song mật ở vườn ươm đủ tiêu chuẩn trồng rừng

Hiện nay, nhiều địa phương đang có các chương trình mở rộng diện tích trồng Song mật nguyên liệu, vì vậy nhu cầu thị trường về cây giống chất lượng cao ngày một lớn Song mật là loài cây có giá trị kinh tế cao nên người dân thường khai thác trước khi cây ra hoa, kết quả Bên cạnh đó, hạt Song mật có độ ẩm cao, thường bị giảm khả năng nảy mầm rất nhanh, nên khó bảo quản Sự thiếu hụt hạt giống là yếu

tố cản trở lớn nhất cho việc mở rộng diện tích gây trồng Mặt khác, quần thể cây trồng từ cây con thực sinh có hiện tượng phân li hữu tính, nên khả năng sinh trưởng

và phát triển, cũng như cho số lượng và chất lượng các sản phẩm chuyên dụng không đồng đều Điều này đã có ảnh hưởng không nhỏ đến việc gây trồng, chăm sóc, khai thác và chế biến Việc áp dụng kỹ thuật tạo cây con Song mật bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro - phương pháp nhân giống sinh dưỡng tiên tiến -

nhằm chủ động tạo ra số lượng lớn các cây con có phẩm chất di truyền tốt và đồng đều, trong thời gian ngắn thực sự là việc làm cần thiết và có nhiều ý nghĩa Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1 Một số phương thức nhân giống in vitro

1.1 Nhân giống từ mô và cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi măng tây (Asparagus) đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa, thì thân có khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn [7,12,14,17]

- Nguyên liệu sử dụng của phương thức nhân giống này là những khối mô và cơ quan tách rời như: mảnh lá, chồi, đoạn thân, rễ, nhánh củ, các bộ phận của hoa,

- Các bước tiến hành nhân giống từ mô và cơ quan tách rời như sau:

+ Chọn cây mẹ để lấy mẫu mô và cơ quan nuôi cấy thích hợp;

+ Chọn mẫu thích hợp: lá bánh tẻ, cành bánh tẻ, đầu rễ non;

+ Khử trùng mẫu với chế độ khử trùng thích hợp đối với từng loại mô và cơ quan cụ thể;

+ Cấy mẫu sạch đã khử trùng vào môi trường vào mẫu thích hợp đối với từng lọai mô, cơ quan của từng loại cây nuôi cấy Sau một thời gian nhất định từ các mẫu

mô và cơ quan nuôi cấy sẽ hình thành nên các chồi hoặc cụm chồi;

+ Nhân nhanh các chồi hình thành bằng môi trường nhân nhanh chồi thích hợp đối với từng loại cây;

+ Cấy chồi cây vào môi trường tạo rễ thích hợp để tạo cây hoàn chỉnh;

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ khác nhau của cây rất khác nhau có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn các bon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (nitơ, photpho, kali, canxi và vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co ) Ngoài ra cần một số chất vô cơ đặc biệt như vitamin (B1, B6, axit nicotinic)

và các chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên chuyển sang môi trường mới [7,12,14,17]

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy

cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng axit amin, đường, rượu và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa

sình trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này

Nhân giống từ mô và cơ quan tách rời được thực hiện bằng hai cách:

+ Nuôi cấy mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng

Mô phân sinh thường là những mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước 0,1mm - 1 cm Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non Các công trình nuôi cấy mô phân sinh của Morel, Martin (1952) Tiếp đó là công trình của Murashige (1970), Quack (1977) và nhiều công trình khác Mô phân sinh được nuôi cấy trên môi trường White, Murashige & Skooge, Gambog có bổ sung đường saccharose hoặc glucose

và vitamin Đối với việc nuôi cấy mô phân sinh, sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokynin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA [7,12,14,17]

+ Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Các bộ phận của cây như: mảnh lá, đoạn thân, mảnh rễ, các bộ phận của hoa cũng có thể được sử dụng để nuôi cấy tạo chồi mới và tạo thành cây hoàn chỉnh

Nhân giống từ mô và cơ quan tách rời có những ưu điểm sau:

Nuôi cấy mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và duy trì tính sạch virus, ví dụ: khoai tây, dứa, mía, phong lan, hoa cúc [7,12,14,17]

Tạo ra quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đặc tính tốt, ưu trội của cây mẹ đầu dòng

Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan Nuôi cấy mô phân sinh cũng được sử dụng để tạo các cây đa bội thông qua xử

1.2 Nhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹo

Nhân giống vô tính in vitro bằng cách tái sinh cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu

vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được các cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo, sau đó từ mô sẹo mới hình thành chồi và từ đó mới tạo thành cây hoàn chỉnh

Các bước tiến hành nhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹo như sau:

- Các bước chọn cây mẹ, chọn bộ phận làm mẫu nuôi cấy và khử trùng mẫu cũng giống như phương thức nhân giống từ mô và cơ quan tách rời Ở phương thức nhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹo thì sau khi cấy mẫu sạch đã khử trùng vào môi trường nuôi cấy, sau một thời gian các mô và cơ quan nuôi cấy sẽ phát sinh tạo ra

mô sẹo;

- Nhân nhanh để tạo ra khối lượng mô sẹo bằng môi trường thích hợp;

- Dưới tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng và các yếu tố của môi trường nuôi cấy thì các cấu trúc hình thái,( chồi, rễ ) được hình thành từ khối mô sẹo Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo có ưu điểm là hệ số nhân nhanh rất cao, thông qua giai đoạn tạo mô sẹo có thể thu được những cá thể sạch virus như thí nghiệm của Kehr và Schaffer (1976) trên đối tượng tỏi, qua mô sẹo có thể chọn dòng tế bào kháng bệnh ở lúa, chịu muối ở thuốc lá, chịu hạn của cây lúa cạn, cây bông hay nuôi cấy bảo tồn các cây có giá trị làm thuốc như cây thanh hao hoa vàng, cây thông đỏ hoặc nhân nhanh một số cây trồng như giống mía, phong lan [7,12,14,17]

Hạn chế của phương thức nhân giống này ở chỗ: tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền, vì khi mô cấy chuyển nhiểu lần thường hình thành các tế bào đa bội và lệch bội, ngoài ra có thể mất các yếu tố di truyền [7,12,14,17] Để khắc phục, người ta sử dụng tế bào mô sẹo sơ cấp (vừa phát sinh)

hy vọng thu được cây tái sinh đồng nhất

1.3 Nhân giống bằng việc tạo phôi soma

Một số loài thực vật sự tái sinh cây từ một tế bào xảy ra theo sự phân hóa phôi Phân hóa phôi cũng bắt đầu bằng sự tái phân hóa của tế bào đã biệt hóa trong

mô nuôi cấy (hình thành mô sẹo), sau đó xảy ra quá trình tạo phôi

Steward và cộng sự (1958) đã mô tả sự hình thành cấu trúc phôi trong tế bào

cà rốt nuôi cấy trong môi trường lỏng như sau: Đầu tiên tế bào phân chia mạnh để tạo thành các cụm tế bào Trong các cụm này các phần tử của xylem được hình thành sau đó xảy ra quá trình tạo mầm mống rễ Khi chuyển sang môi trường nuôi

tiếp thì quan sát thấy hình thành chồi và sau đó là cây hoàn chỉnh Reinert quan sát thấy sự phát triển phôi xảy ra với sự thay đổi các pha phát triển (tiền phôi, globula

và torpedo) ở mô mạch của mô nuôi cấy hoặc mô sẹo [7,12,14,17]

Các bước tiến hành nhân giống bằng việc tạo phôi soma như sau:

- Các bước tiến hành chọn mẫu cấy và vô trùng mẫu cấy cũng giống như các phương thức nhân giống trên;

Ở phương thức nhân giống bằng việc tạo phôi soma thì sau khi cấy mẫu sạch

đã khử trùng vào môi trường nuôi cấy một thời gian các mẫu mô và cơ quan nuôi cấy sẽ phát sinh ra khối mô sẹo

- Nhân nhanh để tạo ra khối lượng lớn mô sẹo bằng môi trường thích hợp;

Dưới tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng và các yếu tố của môi trường nuôi cấy từ mô sẹo hình thành nên phôi soma Từ phôi soma có thể tạo chồi và cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng phôi soma tạo hạt nhân tạo [12,17]

Ưu điểm của phương thức nhân giống này là có hệ số nhân giống rất lớn và có thể thực hiện trên quy mô công nghiệp với việc sử dụng các thiết bị nuôi cấy được gọi là bioreactor Phương thức nhân giống này còn có ưu điểm là bảo quản được lượng mẫu lớn trong thời gian dài

Ngày nay, có nhiều loại cây trồng đã sử dụng phương thức nhân giống bằng việc tạo phôi soma và hạt nhân tạo như: cần tây, rau diếp, linh lăng, hoa ly, cúc, địa lan, hồng môn [11,12]

2.Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia ra 5 giai đoạn chính như sau:

- Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ

Cây mẹ là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy và giai đoạn này coi như là một bước thuần hóa vật liệu để nuôi cấy Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Thông thường, cây mẹ là cây ưu việt, có những tính trạng tốt, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối tượng đang có nguy cơ bị tuyệt chủng Cây mẹ được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên của nó rồi trồng trong điều kiện thích hợp để chăm sóc và phòng bệnh trước khi lấy mẫu Như vậy sẽ hạn chế được tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy, đồng thời chủ động được nguồn mẫu trong công tác nhân giống [7,12,14,17]

- Giai đoạn 2: Tạo vật liệu khởi đầu

Các chồi mới từ các mẫu vật đã được khử trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ

sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy cho nên khi lấy mẫu cấy cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Theo Bhatt thì mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn các mô của cây trưởng thành (Bhatt, 1979) Hạt cũng là đối tượng được ưu

tiên trong nuôi cấy in vitro bằng cách phá ngủ nghỉ của hạt và tạo điều kiện cho hạt

nảy mầm ngay trong ống nghiệm Đối với mẫu dễ bị hóa nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung vào môi trường than hoạt tính hay ngâm mẫu trước khi cấy vào axit xitric (25 -

150 mg/l) [7,12,14,17]

Chọn đúng phương pháp khử trủng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và trong môi trường dinh dưỡng thích hợp mẫu cấy sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh nhất Giai đoạn này thường kéo dài 4 - 6 tuần lễ

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro nhằm mục đích là tạo ra hệ số nhân cao

nhất Vì vậy, giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của toàn quá trình Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh thành nhiều chồi mầm cung cấp cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn trên và cấy chúng vào môi trường mới theo định kỳ Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ 3 đến 50 lần tùy thuộc loài cây và phương pháp nhân nhanh Quan trọng là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có thể đạt hiệu quả cao nhất Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi, nhưng không ảnh hưởng đến sức sống và bản chất di truyền của cây

Bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng mới (tăng hàm lượng cytokinin, giảm hàm lượng Auxin để kích thích tạo chồi) [7,12,14,17]

Tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mô phân hóa tạo chồi mạnh [7,12,14,17]

Bảo đảm chế độ nhiệt 20 - 300C Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng, mục đích thí nghiệm cần chế độ nuôi cấy khác nhau

- Giai đoạn 4: Tạo rễ

Đây là giai đoạn các chồi đã đạt được kích thước nhất định và được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh Thường sau 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng Cytokinin và tăng lượng

Auxin để rễ phát triển Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng [7,12,14,17]

- Giai đoạn 5: Đưa cây ra trồng ở ngoài tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi trường tự nhiên Khi cây con cứng cáp và đủ tiêu chuẩn thì mang trồng Đây là bước quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất

Để đưa cây từ ống nghiệm ra môi trường tự nhiên bên ngoài đạt tỷ lệ sống cao cần đảm bảo một số yêu cầu sau:

+ Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây)

+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể tơi xốp, thoát nước;

+ Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên 50%

để cây con không mất nước trong 2 - 3 tuần lễ, tránh ánh sáng quá mạnh làm cháy

lá, tránh nhiễm vi khuẩn và nấm gây hiện tượng bị thối nhũn Điều kiện môi trường trong giai đoạn này rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng cáp

3.2 Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy

Mẫu mới cấy hay bị hóa nâu, hóa đen rồi chết là hiện tượng thường gặp Nguyên nhân của hiện tượng này là do có chứa nhiều tanin hay Hydroxyphenol trong mẫu cấy đã già Để khắc phục hiện tượng này người ta thường áp dụng mấy phương pháp sau:

- Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1-0,3%) hoặc PolyVinyl Pyrolidone (PVP) Vài giờ trước khi cấy, ngâm mẫu vào dung dịch chứa các chất có tác dụng ngăn chặn oxy hóa Phenol như Axit Ascobic, Axit chanh;

- Mẫu nuôi cấy trong môi trường lỏng, nồng độ oxy thấp và không có ánh sáng trong 1 - 2 tuần trước khi cấy

3.3 Hiện tượng thủy tinh hóa

Cây nuôi cấy mô có khi trở nên mọng nước, lá và thân trong suốt do đó rất khó sống, đặc biệt khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường ít thạch, trao đổi khí thấp Có thể hạn chế hiện tượng này bằng hai cách:

- Giảm nồng độ chất chứa N trong môi trường nuôi cấy;

- Giảm sự hình thành ethylen trong bình mới;

- Xử lý Axit Abxixic hoặc các chất ức chế sinh trưởng;

- Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ trong phòng nuôi cấy

3.4 Tính bất định về di truyền

Trong một số trường hợp nhân giống in vitro có xảy ra đột biến tế bào soma

một cách ngẫu nhiên Thông thường khi nuôi cấy mô sẹo gặp nhiều đột biến hơn nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng Nguyên nhân gây ra hiện tượng này có thể là:

- Kiểu di truyền của mô nuôi cấy;

- Số lần cấy chuyển càng nhiều thì tỷ lệ đột biến càng cao;

- Loại mô cấy

4 Thành tựu nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Ở nước ta việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô-tế bào thực vật

để nhân nhanh một số giống cây trồng đã được tiến hành từ những năm 1980, đến nay đã đạt được những kết quả đáng kể Các đối tượng cây trồng đã được nhân

giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, như: (1) Các loài cây có giá

trị kinh tế phục vụ gây trồng quy mô lớn, như Cây hoa: hoa lan, cúc, đồng tiền, lily, phăng, cẩm chướng, lay ơn, hoa hồng; Cây lương thực, thực phẩm: khoai tây, cà chua, súp lơ, khoai sọ, khoai môn, sắn; Cây ăn quả: chuối, dứa, dâu tây, cam, quýt, bưởi; Cây công nghiệp: mía, cà phê, thuốc lá; Cây lâm nghiệp: bạch đàn, keo, hông, tếch, thông, tùng, sưa, dó bầu, lõi thọ, Xoan ta, Song mật; (2) Các loài cây dược liệu quý hiếm như: sâm ngọc linh, trinh nữ hoàng cung, lan kim tuyến, hoàn ngọc; (3) Các loài cây có khả năng tái sinh sinh tự nhiên thấp (Thông đỏ, Thủy tùng)

Các kết quả nhân giống cây trồng tiêu biểu

Các cán bộ khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sau nhiều năm nghiên cứu đã thu được nhiều kết quả quan trọng trong lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật, như: Đã hoàn thiện được nhiều quy trình

công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, làm sạch vi rút đối với nhiều giống cây trồng nông- lâm nghiệp, cây dược liệu có giá trị cao, như: Cây khoai lang, khoai

mỡ, măng cụt, chanh không hạt, cây sung Mỹ, hồ tiêu, điều, cây Paulownia, cây tre,

dó bầu, xoan chịu hạn, lõi thọ, keo lai, lát Mêhicô, phong lan, hồng môn, cẩm chướng, đồng tiền, cây xả, trinh nữ hoàng cung, sâm Ngọc linh Điển hình là Viện

đã triển khai ứng dụng sản xuất giống khoai tây bằng củ bi và đã cung cấp gần 400.000 củ bi giống cho vùng sản xuất Đà Lạt; Xây dựng thành công quy trình kỹ

thuật nhân giống chuối (Cavendish Sp.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và đã được

đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp, mỗi năm cung cấp hàng triệu cây giống chuối nuôi cấy mô cho sản xuất; Ngoài ra, Viện cũng đã cung cấp một số lượng lớn cây giống như hoa phong lan, đồng tiền, hông, nghiến, xoan chịu hạn và một số giống tre cho thị trường

Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa, Cây cảnh - Viện Nghiên cứu Rau quả cũng xây dựng thành công hơn 30 quy trình kỹ thuật nhân giống, trồng và chăm sóc hoa thương phẩm điển hình là: Quy trình kỹ thuật nhân giống hoa lan Hồ

Điệp trên quy mô công nghiệp, quy trình này đã được chuyển giao áp dụng cho 11

tỉnh, thành trong cả nước, góp phần đưa công nghệ sản xuất hoa ở Việt Nam tiếp cận với các nước trong khu vực; Quy trình sản xuất hoa lily áp dụng cho các tỉnh phía Bắc, giúp cho miền Bắc Việt Nam từ chỗ không sản xuất được hoa lily đến nay quy mô sản xuất đã đạt trên 10 triệu củ (cây)/năm, chất lượng tương đương các vùng trồng hoa lớn, có điều kiện tốt như Đà Lạt – Lâm Đồng, Côn Minh (Trung Quốc); Các Quy trình trên đã và đang được chuyển giao ứng dụng cho hơn 40 tỉnh, thành trên cả nước, góp phần đáng kể vào sự nghiệp nghiên cứu, phát triển sản xuất hoa, cây cảnh ở Việt Nam

Các kết quả nghiên cứu về nhân giống một số loại cây trồng có giá trị kinh tế

ở Viện Di truyền Nông nghiệp: Đã hoàn thiện được quy trình nhân giống in vitro cho 2 giống hoa cúc (giống CN97 và CN98) Quy trình nhân nhanh in vitro một số giống hoa Lilium spp và tếch đã được công nhận là tiến bộ kỹ thuật và quy trình

nhân nhanh các giống hoa đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy lớp cắt mỏng đã được công nhận giống tạm thời Các quy trình này đã được chuyển giao cho các cơ

sở sản xuất

Đối với nhân giống cây lâm nghiệp cũng đã đạt được nhiều thành quả đáng

kể, chủ yếu tập trung ở một số cơ sở nhân giống cây lâm nghiệp lớn, như: Trung tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh, Viện Nghiên cứu Cây

nguyên liệu giấy Phù Ninh, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Trường Đại học Lâm nghiệp, Công ty Giống lâm nghiệp Trung ương, Nhiều quy trình kỹ thuật nhân giống cây lâm nghiệp đã được xây dựng, như: Quy trình nhân giống cây Bạch đàn urô dòng U6, Bạch đàn lai, Keo, Hông, Tếch, Dó bầu, Lõi thọ, Song mật Trong đó, điển hình là Trung tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh triển khai nhiều đề tài, dự án cấp bộ, cấp nhà nước về nhân giống cây lâm nghiệp đạt kết quả xuất sắc Đặc biệt là Dự án

“Hoàn thiện, triển khai công nghệ vi nhân giống trong sản xuất công nghiệp cây giống bạch đàn U6 và một số dòng bạch đàn Urô có triển vọng khác tại Quảng Ninh”, trong 3 năm Trung tâm đã sản xuất được 21 triệu cây, đem lại doanh thu hàng năm cho Trung tâm từ 2,5-4 tỷ đồng, đồng thời tạo nhiều việc làm cho người dân trong và ngoài tỉnh

5 Ý nghĩa của kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại ý nghĩa vô cùng to lớn Nó đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật góp phần giải quyết vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt

là lĩnh vực nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô

Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được xem là một trong những giải pháp

công nghệ mới có ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học Trên các môi trường nhân tạo, từ các mô hay tế bào thực vật sẽ phân chia, phân hóa và phát triển thành cây hoàn chỉnh Đây là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vô tính

Những ưu việt của phương pháp nhân giống này là:

+ Tạo ra quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ

+ Có hệ số nhân giống cao (trong một thời gian ngắn có thể tạo ra số lượng lớn

cây giống chất lượng cao);

+ Cây giống có hình thái đồng đều, sạch bệnh;

+ Cây con được tạo ra bằng nuôi cấy mô được trẻ hóa cao độ;

+ Sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô-tế bào thực vật không cần

nhiều diện tích, không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết;

+ Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15 kg) Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi Các cây giống giữ ở nhiệt độ

40C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống đến 95% [7,12,14,17]

2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

2.1 Tổng quan về Song mây

Song mây là thuật ngữ gọi chung cho khoảng 600 loài thuộc chi Calamus và Daemonorops Song mây là một trong những loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao, có vai trò đặc biệt quan trọng đối với việc phát triển kinh tế- xã hội vùng nông thôn miền núi

Do thân Song mây có đặc tính dẻo dai, dễ uốn, màu sắc đẹp (có thể dùng sơn

để tạo thân Song mây có vân giống như vân gỗ), nên có thể dùng được nhiều chủng loại đồ dùng bằng Song mây với nhiều kiểu dáng và màu sắc khác nhau Đã từ lâu Song mây được sử dụng nhiều trong đời sống hàng ngày của người dân (làm hàng thủ công mỹ nghệ, đan lát, bàn ghế,…) Ngoài ra lá Song mây được người dân miền núi dùng để lợp nhà, quả dùng để ăn và là vị thuốc tốt [10,11,15,16] Đây chính là một loài cây trồng có nhiều triển vọng phát triển ở vùng nông thôn và miền núi ở nước ta

Song mây là một trong những chi có sự đa dạng nhất về loài (khoảng 600 loài

thuộc 13 nhóm loài (Rao et al.,1997)), có phạm vi phân bố rộng ở nhiều vùng địa lý

khác nhau, thích hợp với vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, như: vùng Xích đạo châu Phi, vùng phía Tây Thái Bình Dương, Australia, khu vực Đông Nam Á, phía Nam Trung Quốc (Dransfield và Manokaran, 1993) Các sản phẩm từ Song mây đem lại lợi ích cho người dân nhiều nước, ở khu vực Đông Nam Á có gần một triệu người dân sinh sống liên quan đến nghề gây trồng và chế biến Song mây (Menon, 1980) Theo thống kê năm 1979, giá trị thương mại của Song mây nguyên liệu đạt 50 triệu USD, sản phẩm được chế từ Song mây nguyên liệu đạt 1,2 tỷ USD

và giá trị thương mại của các sản phẩm từ Song mây đạt trên 2 tỷ USD (Rao et al.,

1997)

Hiện nay, trên thế giới có khoảng trên 700 triệu người buôn bán và sử dụng song mây với rất nhiều mục đích khác nhau Thương mại toàn cầu và giá trị sử dụng của Song mây cũng như giá trị của chúng được dự báo vào khoảng 7.000 triệu USD trong một năm Tại Việt Nam, con số thống kê cho thấy sản lượng của Song mây giao động trong khoảng 20.000 – 80.000 ngàn tấn và sử dụng ít nhất 2-3 triệu lao động trên khắp đất nước (FAO, 2003)

Trung Quốc có 40 loài và 21 dưới loài thuộc 3 nhóm loài, chủ yếu tập trung ở vùng phía Nam, trong đó có 19 loài có giá trị thương mại quan trọng và 18 loài khác được người dân sử dụng tại địa phương Các loài Song mây có giá trị thương mại

cao tập trung chủ yếu ở đảo Hải Nam và tỉnh Vân Nam Ngay từ đầu những năm

1980, hàng năm Trung Quốc thu được khoảng 4.000 – 7.000 tấn Song mây nguyên liệu tự nhiên, trong đó có khoảng 4.000 tấn từ đảo Hải Nam và khoảng 2.000 tấn từ tỉnh Vân Nam (chiếm 90% sản lượng của cả nước) Do tốc độ phát triển kinh tế xã hội nhanh, nhu cầu của dân về các sản phẩm làm từ Song mây ngày càng tăng, dẫn đến việc khai thác quá mức Đến nay nguồn Song mây tự nhiên ở Trung Quốc hầu như đã bị cạn kiệt

Indonesia có khoảng 300 loài, trong đó những loài quan trọng dùng cho xuất khẩu

là C manna, C trachycoleus, C caesius, C inops và C.scopionum Từ những năm

1985, nước này đã sản xuất được 575.000 tấn Song mây nguyên liệu Indonesia là nước cung cấp Song mây nguyên liệu lớn nhất (khoảng 90%) trên thị trường thế giới

Ngoài ra, Song mây còn tập trung ở một số quốc gia khác, như: Thái Lan (khoảng 50 loài), Philippines (khoảng 60 loài) và Ấn Độ (khoảng 46 loài)

Trong những năm gần đây sản lượng Song mây bị giảm sút đáng kể do rừng nhiệt đới bị tàn phá nặng nề Hiện nay, vấn đề gây trồng Song mây thương mại không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến việc làm và mức sống của người dân vùng trồng Song mây mà có khuynh hướng ảnh hưởng tới các nước khác có liên quan trong khu vực Thực vậy, việc trồng Song mây thương mại ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á đã trở thành một trong những yếu tố làm tăng sự phụ thuộc lẫn nhau giữa các quốc gia Ví dụ như Indonesia là nước có sản lượng Song mây nguyên liệu lớn nhất thế giới đã đưa ra chính sách cấm xuất khẩu Song mây nguyên liệu, chỉ xuất khẩu những sản phẩm đã qua chế biến Chính sách này nhằm mục đích tăng việc làm cho người dân và tăng giá trị của sản phẩm Mặt khác, nó cũng giúp cho việc bảo tồn nguồn Song mây khỏi bị khai thác quá mức Song chính sách này đã ảnh hưởng đến nguồn Song mây nguyên liệu của Thái Lan, Trung Quốc và Philippine vì các nước này chủ yếu nhập Song mây nguyên liệu từ Indonesia

1.2.2 Tổng quan về Song mật

Song mật (Calamus platyacanthus Warb.Ex Becc) là một trong những loài lâm

sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế rất cao Do thân Song mật có kích thước lớn, dài, bền, dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt, nên từ lâu Song mật đã được sử dụng nhiều trong đời sống hàng ngày (làm hàng mỹ nghệ cao cấp, bàn ghế, thay thế dây cáp cầu nhỏ ở vùng núi, cuốn bè mảnh) (Lê Mộng Chân, 2002) Song mật là loài cây ưa sáng và

ẩm, luôn vươn lên tầng cao nhất của tán rừng Cũng gặp Song mật mọc xen kẽ lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 700 m Trên thế giới, Song mật tập trung chủ yếu ở Trung

Quốc, Việt Nam và một số nước khác Ở Trung Quốc, Song mật tập trung chủ yếu ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900 m, thành từng cụm lớn, đường kính thân khoảng 20 - 50 mm, lóng dài hơn 50 cm, lá dài 2 - 6 cm, quả hình trứng kích thước

17 x 11 mm, được bao bọc bởi 20 vẩy màu sáng (Rao et al., 1997) Ở Việt Nam,

Song mật là loài cây tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Bắc như: Bắc Giang, Hòa Bình, Tuyên Quang, … Từ những năm 1985, Song mật đã bị khai thác mạnh để sản xuất hàng xuất khẩu, làm cho nhiều nơi đã mất giống làm cho khu phân bố bị thu hẹp dần và có nguy cơ bị tiêu diệt, vì vậy cần xây dựng một số khu rừng giống và khoanh một số khu vực còn tương đối nhiều cá thể để khai thác hợp lý, đảm bảo sản lượng ổn định lâu dài Sớm đưa Song mật vào gây trồng trong các rừng đặc dụng và rừng đầu nguồn

1.2.3 Một số nghiên cứu nhân giống Song mật

1.2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Nhận thức rõ vai trò quan trọng của loài cây có giá trị kinh tế cao này, ngay từ những năm đầu của thập kỷ 80, các nước trên thế giới, đặc biệt các nước trong khu vực Đông Nam Á đã tiến hành nghiên cứu về phân loại, kỹ thuật gây trồng, phân

tích lợi ích kinh tế của việc gây trồng Song mây (Yin Guangtian et al., 1993) Các

nghiên cứu về nguồn tài nguyên di truyền xác định những loài có giá trị thương mại

đã được tiến hành ở nhiếu quốc gia như: Bangladesh, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Philippine và Thái Lan (Ramanatha Rao., 1999) nhằm mục đích xác định số lượng, khu vực phân bố, vùng gây trồng phù hợp Ngoài ra còn có một số nghiên cứu ở Thái Lan về phân tích đa dạng di truyền bằng các phương pháp phân tích phân tử (isozyme, RAPD, RFLP, AFLP…)

(Hong et al., 2002)

Do nguồn Song mây nguyên liệu tự nhiên ngày càng suy kiệt, nguồn hạt giống

khan hiếm, nên việc áp dụng kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in

vitro đang được xem là một giải pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề tồn tại trên

Các nghiên cứu về nhân giống Song mây in vitro đã được tiến hành từ rất sớm,

tiêu biểu là các nghiên cứu của các tác giả: Patena (1984), Umali- Garcia (1985), Barb (1985), Yusoff (1985), Gunawan (1989) và Dekkers (1989)

Kết quả các nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng trong nuôi cấy in vitro các loài

Song mây, vật liệu dùng để nuôi cấy là nhân tố quan trọng quyết định đến sự thành công Vật liệu dùng để nuôi cấy rất đa dạng như: phôi hạt, vùng cổ chồi, đỉnh chồi, mảnh lá, cuống lá, bẹ cây con, chóp rễ, … Tùy từng loài mà lựa chọn vật liệu nuôi

cấy thích hợp Cụ thể: đối với loài C tetradactylus dùng phôi và đỉnh chồi, loài C

obvoideus dùng vùng cổ của cây con, còn đối với loài C egregious dùng phôi hạt

để nuôi cấy là phù hợp nhất Nhìn chung, phôi hạt và vùng cổ rễ của cây non là vật

liệu tốt nhất cho nhân giống in vitro của nhiều loài Song mây (Zeng el al., 1999) Năm 1985, Umali - Garcia đã lấy đỉnh chồi của 3 loài mây thuộc chi Calamus

làm vật liệu nuôi cấy Đỉnh chồi được cấy vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo, cho

mô phát triển thành cụm chồi, sau đó tách chồi cấy vào môi trường thúc rễ để tạo cây con hoàn chỉnh Năm 1989, Yuoff và Manokaran đã tạo được mô sẹo từ phôi

hạt của loài C manna, sau đó cho mô sẹo phát triển thành chồi, thúc chồi ra rễ để

tạo thành cây con hoàn chỉnh Các tác giả trên cũng đã thành công trong nghiên cứu tạo đa chồi bằng cách dùng vùng cổ chồi cây con nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BAP hoặc Kinetin, (10-6 đến 10-4 M), sau đó tách chồi để cấy vào môi trường hàm lượng Cytokinin thấp để tạo cây hoàn chỉnh và chuyển ra trồng ngoài tự nhiên

Năm 1986, Gunawan và Yani đã nuôi cấy phôi hạt chưa chín của loài C

manna trên môi trường MS (Marashige và Skoog, 1962) và Y3 (Eewens, 1976)

cũng đã tạo được cây in vitro hoàn chỉnh

Năm 1989, Dekkers và Rao lấy phôi hạt của loài C trachycoleus cấy vào môi

trường MS có bổ sung 2.4D hoặc NAA với hàm lượng 5 mg/l Sau khoảng 2- 4 tuần thấy xuất hiện mô sẹo Mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường có hàm lượng 2.4D thấp để cảm ứng tạo chồi

Các công trình nghiên cứu về nhân giống Song mây in vitro của Trung Quốc

được tiến hành chủ yếu ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp nhiệt đới Quảng Châu (tỉnh Quảng Đông) và Viện thực vật học Côn Minh Năm 1987, Zhuang Chengji đã thông

báo thành công bước đầu của việc nghiên cứu tạo cụm chồi ở hai loài C

yunnanensis và C.obovoideu trong điều kiện nuôi cấy in vitro Nhìn chung các điều

kiện về nuôi cấy in vitro Song mây mới chỉ tập trung cho những loài quan trọng,

đặc biệt những loài có giá trị kinh tế cao Năm 1993, Zhuang Chengji đã công bố

kết quả nghiên cứu ở 3 loài C tetradactylus, C simplicifolius và D margaritae Cheng Zhiying đã tiến hành nghiên cứu với các loài C gracilis và C nambariensis Zeng Bingshan (1991- 1997) đã tiến hành nghiên cứu với các loài: C egregious, D

Jenkisiana, C dioicus, C rhabdocladus, C egregious và D margaritae đã được tạo

ra với số lượng lớn bằng nuôi cấy in vitro và đã được trồng thành rừng vô tính ở

tỉnh Quảng Tây và Quảng Đông

Đến nay, Viện nghiên cứu Lâm nghiệp nhiệt đới đã cho 16 năm kinh nghiệm

nghiên cứu về nhân giống Song mây bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, đã hoàn thiện được quy trình nhân giống cho 3 loài C simlicifolius, D margaritae và D

jenkinsiana Các quy trình công nghệ nhân giống này hoàn toàn đáp ứng được yêu

cầu của sản xuất ở quy mô công nghiệp

1.2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Ở nước ta trong những năm gần đây việc ứng dụng công nghệ nhân giống in

vitro đã thành công ở một số loài cây trồng rừng phổ biến như: Bạch đàn cao sản,

Keo lai, Dó trầm, Tếch, Hông,… Nhiều cơ sở nghiên cứu và sản xuất đã áp dụng công nghệ này để sản xuất cây con ở quy mô công nghiệp nhằm chủ động cung cấp nguồn cây con chất lượng cao phục vụ trồng rừng sản xuất đang có nhu cầu rất lớn Tuy nhiên, đối với những loài cây bản địa và cây đặc sản rừng có giá trị kinh

tế cao nói chung, đặc biệt cho Song mật nói riêng, vẫn chưa nghiên cứu đầy đủ

Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro đối với các loài cây này còn rất mới mẻ

và nhiều hạn chế, mới chỉ được tiến hành một cách đơn lẻ ở một số cơ sở nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm và mang tính thăm dò là chính

Thí nghiệm về khả năng nảy mầm của hạt với các biện pháp tác động khác nhau như: hoá chất, nhiệt độ, cơ học đã được tiến hành (Trần Quang Việt, 1994; Vũ Văn Dũng và Lê Huy Cường, 1996; Nguyễn Quang Khải, 1998), trong đó việc xử

lý bằng cạy nắp rốn hạt của tác giả Nguyễn Quang Khải đã rút ngắn đáng kể thời gian bắt đầu nẩy mầm của hạt Song mật

Một số thí nghiệm về chăm sóc cây con, phòng trừ sâu bệnh ở giai đoạn vườn ươm đã được thực hiện (Trần Quang Việt, 1994) Tác giả cũng tìm được phương pháp bảo quản hạt giống bằng cách làm sạch hạt và ngâm vào dung dịch benlat nồng độ 0,5% sau đó phơi khô rồi bảo quản trong tủ lạnh, sau 1 năm tỷ lệ nảy mầm vẫn đạt 70%

Mô hình trồng rừng thí nghiệm đã được tiến hành ở Cầu Hai (Phú Thọ), Lương Sơn (Hoà Bình), Bà Rền (Quảng Bình) (Trần Quang Việt, 1995) với độ tàn che khác nhau cho thấy cây sinh trưởng tốt với độ tàn che 0,5 - 0,7 trong giai đoạn đầu

kể cả vườn ươm và rừng trồng đạt chiều cao 30,91cm, trong khi ở độ tàn che 0,3 - 0,4 chỉ đạt 26,08 cm Nhưng sau 15 tháng sau khi trồng cây ở độ tàn che thấp lại sinh trưởng tốt hơn và xu thế này càng ngày càng thể hiện rõ Kết quả cũng chỉ ra rằng sau 6 tháng trồng, khi trồng bằng cây con 2,5 tuổi đạt tỷ lệ sống cao và phát triển nhanh hơn so với cây 1 tuổi Lê Thu Hiền và cộng sự cũng đã xây dựng mô

hình trồng rừng dưới tán rừng phục hồi, tác giả cũng đưa ra tiêu chuẩn cây con cho trồng rừng là từ 18-24 tháng tuổi Ngoài ra còn có một số mô hình khác được trồng thử trên quy mô rất lớn như ở Trạm thí nghiệm Bình Thành (Hoà Bình), Viện điều tra quy hoạch rừng, Vườn Quốc Gia Xuân Sơn (Phú Thọ)

Gây trồng Song mật chủ yếu phụ thuộc vào cây hạt, do đặc tính sinh trưởng chậm nên việc tạo cây con đủ tiêu chuẩn cũng mất nhiều thời gian Một số tác giả

đã đưa ra hướng dẫn kỹ thuật trồng Song mật, trong đó tiêu chuẩn cây con đem trồng là 15 - 18 tháng tuổi (Vũ Văn Dũng và Nguyễn Huy Cường, 1996; Triệu Văn Hùng, 2007), từ 18 - 24 tháng tuổi (Lê Thu Hiền và cộng sự, 2005), cây cao khoảng

20 cm đạt từ 3 - 4 lá

Nhân giống sinh dưỡng cho cây Song mật được tiến hành (Nguyễn Ngọc Tân và Trần Hồ Quang, 1995) bằng lá non và phôi hạt Kết quả cho thấy có sự hình thành mô sẹo từ lá non nhưng không tái sinh chồi và chết dần khi môi trường có nồng độ Cytokinin cao Các tác giả thành công trong việc nhân giống từ phôi, các phôi được nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung Cytokinin và Auxin để tạo cây hoàn chỉnh Tuy nhiên nghiên cứu này còn hạn chế ở chu kỳ cấy chuyển dài từ 6 – 8 tuần, không thấy đề cập hệ số nhân chồi hữu hiệu, thời gian và tỷ

lệ ra rễ của cây con cũng như biện pháp huấn luyện cây con ở vườn ươm

Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các nội dung cơ bản trồng, chăm sóc, hiệu quả kinh tế mà chưa có công trình nghiên cứu nào công

bố chi tiết về phương thức nhân giống in vitro Song mật Mặc dù các nghiên cứu trên thế giới đã giải quyết nhiều vấn đề liên quan tới việc nuôi cấy in vitro Song mật nhưng có ít tác giả nghiên cứu đầy đủ và xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho

loài Song mật

Năm 2008 Trung tâm Giống & CNSH trường Đại học Lâm nghiệp mới thực

hiện đề tài cấp bộ nhân giống tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro do

Ths Vũ Thị Huệ chủ trì cùng tôi là cộng tác viên tham gia nghiên cứu chính trong đề tài này Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi có nghiên cứu thêm về môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả năng tạo cụm chồi trong đó môi trường MS* thích hợp cao với các giai đoạn tạo cụm chồi, nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi cho luận văn thạc sỹ của mình Tiếp theo, đến giai đoạn tạo rễ chúng tôi lại nghiên cứu tiếp và thấy rằng môi trường 1/2MS* rất thích hợp cho khả năng tạo rễ, môi trường dinh dưỡng giảm một nửa khả năng ra rễ mạnh hơn, thời gian ra rễ cũng sớm

hơn Đặc biệt là sẽ giảm được giá thành sản xuất khi đưa quy trình vào sản xuất trên quy mô công nghiệp

Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro còn đang là

vấn đề rất mới ở Việt Nam Do vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro là việc làm cần thiết và có ý nghĩa để sớm đưa quy trình ra sản xuất trên quy mô lớn đủ đáp ứng cây giống phục vụ cho công tác trồng rừng Song mật chất lượng cao

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro Song mật từ vật liệu

chồi măng, nhằm góp phần chủ động cung cấp nguồn giống chất lượng cao để phát triển Song mật làm nguyên liệu phục vụ sản xuất

Mục tiêu cụ thể:

- Xác định được kỹ thuật khử trùng vật liệu nhân giống đạt hiệu quả cao;

- Xác định được loại vật liệu nuôi cấy và công thức môi trường cảm ứng tạo cụm chồi tốt nhất;

- Xác định được công thức môi trường nhân nhanh chồi và kích thích tăng trưởng chồi thích hợp;

- Xác định được công thức môi trường nuôi cấy kích thích chồi ra rễ tốt nhất;

- Xác định được kỹ thuật trồng và chăm sóc cây con ở vườn ươm phù hợp nhất

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng đến

khả năng tạo mẫu sạch in vitro;

2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro

- Ảnh hưởng đường kính gốc chồi măng đến khả năng tạo cụm chồi in vitro;

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo cụm chồi in vitro;

+ Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi;

+ Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi

- Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo cụm chồi in vitro

2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi

- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi;

- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng kích thích tăng trưởng chồi

2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ

Nghiên cứu môi trường nuôi cấy để tạo rễ in vitro

- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ in vitro;

- Ảnh hưởng của môi dinh dưỡng đến khả năng ra rễ in vitro

2.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro ở nhà lưới/vườn ươm

- Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống của cây con Song mật ở vườn ươm;

- Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến khả năng sống và sinh trưởng của cây con Song mật ở vườn ươm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro

- Cách lấy mẫu: Chọn những chồi măng từ khóm Song mật trội đã qua tuyển chọn, những chồi măng này phải khoẻ mạnh, không sâu bệnh, chồi có độ tuổi dưới 1 năm, đường kính gốc từ 1 - 2 cm Dùng dao thật sắc tách rời chồi măng khỏi gốc cây mẹ sao cho gốc không được dập nát, chú ý cắt thật sát gốc cây mẹ

- Bảo quản mẫu: Dùng giấy báo để bọc mẫu và đựng trong túi ni non kín tránh thoát hơi nước;

- Cách khử trùng mẫu:

+ Khử trùng ngoài buồng cấy: lấy mẫu ngoài thực địa về, loại bỏ hết lá, gai, rễ

và 1 phần bẹ lá già, mẫu được rửa sạch đất, bụi bẩn dưới vòi nước chảy, ngâm mẫu trong nước xà phòng loãng khoảng 5 - 10 phút, lắc rửa mạnh cho sạch hết bụi bẩn bám vào các kẽ của bẹ lá, loại bỏ hết xà phòng và tráng bằng nước sạch nhiều lần + Khử trùng trong buồng cấy: cho toàn bộ mẫu vào bình nút xoáy, rót chất diệt khuẩn vào bình sao cho ngập mẫu, đậy thật chặt nút và lắc mạnh sao cho chất diệt khuẩn thấm sâu vào các kẽ, nách lá, đủ thời gian khử trùng thì loại bỏ chất diệt khuẩn và tráng mẫu bằng nước cất đã vô trùng nhiều lần (3 - 5 lần) Trước khi cấy mẫu vào môi trường cần loại bỏ bớt những bộ phận bị chất khử trùng ngấm vào để đảm bảo cho mẫu không bị chết

Khử trùng hóa chất lần 1: Bổ sung chất diệt khuẩn vào bình đến ngập mẫu, đậy thật chặt nút và lắc mạnh sao cho chất diệt khuẩn thấm sâu vào các kẽ, bẹ lá, đủ thời

gian khử trùng thì loại bỏ chất diệt khuẩn và tráng mẫu bằng nước cất đã vô trùng nhiều lần (3 - 5 lần)

Khử trùng hóa chất lần 2: Sau khi khử trùng hóa chất lần 1 xong, dùng dao sắc tách loại bỏ bớt lớp bẹ lá phía ngoài rồi tiến hành khử trùng lần 2, đủ thời gian loại

bỏ dung dịch diệt khuẩn và tráng lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần

Hóa chất diệt trùng và thời gian diệt trùng được bố trí như bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1 Các công thức khử trùng chồi măng

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro

2.3.2.1 Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến khả năng tạo cụm chồi

Thí nghiệm được bố trí với các vật liệu là chồi măng có đường kính gốc khác nhau (1cm, 1,5 cm và ≥ 2cm) Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung thêm 20 g đường/l + 7 g/l agar đồng thời bổ sung BAP với hàm lượng 2 - 4mg/l Chúng tôi bố trí 09 công thức thí nghiệm và các công thức thí nghiệm được bố trí như bảng sau

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến khả năng tạo cụm chồi

CM (cm)

BAP (mg/l)

TG mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (tuần)

Số lượng chồi TB/cụm

Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%)

Chất lượng chồi

CC1

1

2

2.3.2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi

Trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí 10 công thức khác nhau Môi trường nuôi cấy MS + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + các chất điều hoà sinh trưởng được bố trí theo bảng 2.3 dưới đây

Bảng 2.3 Ảnh hưởng hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo cụm chồi

CTTN

Chất điều hoà sinh trưởng ( mg/l)

Số chồi TB/Cụm

Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%)

Chất lượng chồi

2.3.2.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi

Thí nghiệm được thiết kế với 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau:

- Môi trường 1MS: Hàm lượng các chất khoáng đa lượng, khoáng vi lượng và vitamin của môi trường cơ bản MS – 1962;

- Môi trường 2MS: Hàm lượng các chất trong môi trường cơ bản MS tăng gấp 2 lần;

- Môi trường MS* (MS cải tiến): Tăng hàm lượng các chất khoáng đa lượng lên gấp đôi, giữ nguyên hàm lượng khoáng vi lượng và vitamin theo môi trường cơ bản MS- 1962

Tất cả các môi trường dinh dưỡng đều được bổ sung 20 g/l đường sucrose + 7 g/l agar + chất ĐHST phù hợp tìm được ở thí nghiệm trên Các công thức thí nghiệm được bố trí rong bảng 2.4 dưới đây

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi

Môi

trường

TG mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (tuần)

Số lượng chồi TB/cụm

Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%)

Chất lượng chồi

1MS

2MS

MS*

2.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo cụm chồi

- Ảnh hưởng của thời gian nuôi tối đến khả năng tạo cụm chồi:

Trong chu kỳ đầu, các mẫu sau khi cấy vào môi trường được nuôi ngay ở các điều kiện khác nhau Tất cả các môi trường nuôi cấy đều sử dụng môi trường MS*

bổ sung 20 g/l đường sucrose + 7g/l agar + + chất ĐHST phù hợp tìm được ở thí nghiệm trên Nguồn mẫu để thí nghiệm tạo cụm chồi sử dụng chồi măng có đường kính gốc 1,5 – 2 cm Nghiên cứu này chỉ áp dụng với thời gian đầu nuôi cấy, cho đến khi mẫu bắt đầu cảm ứng tạo cụm chồi

Thí nghiệm được bố trí với thời gian tiền nuôi tối khác nhau, sau đó đưa ra nuôi sáng Chu kỳ cấy chuyển là 4 tuần /lần Các công thức được ghi trong bảng 2.5

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi tối đến khả năng tạo cụm chồi

CTTN

mẫu tạo cụm chồi (tuần)

Số lượng chồi Tb/cụm

Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%)

Chất lượng chồi Nuôi tối Nuôi sáng

- Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng tạo cụm chồi

Thí nghiệm được bố trí với mẫu cấy được nuôi dưới ánh sáng nhân tạo có cường

độ khác nhau, với thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày Các công thức được ghi trong bảng 2.6 dưới đây

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng tạo cụm chồi

CTTN

Cường độ ánh sáng (Lux)

TG mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (tuần)

Số lượng chồi Tb/cụm

Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%)

Chất lượng chồi

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi

2.3.3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

Trong nghiên cứu này sử dụng môi trường MS* bổ sung 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + chất điều hòa sinh trưởng như bảng 2.7 dưới đây

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi

CTTN

chồi (lần)

Chất lượng chồi

NC1 0,5

0,2

NC 2 1,0

Bảng 2.8 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng kích thích tăng

Hệ số nhân chồi (lần)

Trước khi cấy

Sau khi cấy

KT5 1,5

KT6 0,5

0,2 0,3 0,3 KT7 1,0

KT8 1,5

KT9 0,5

0,5 KT10 1,0

KT11 1,5

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ

2.3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng môi trường MS + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + chất điều hoà sinh trưởng bố trí với hàm lượng khác nhau như bảng 2.9

Bảng 2.9 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ

(mg/l)

IBA (mg/l)

Thí nghiệm được thiết kế với 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau:

- Môi trường 1MS: Hàm lượng các chất khoáng đa lượng, khoáng vi lượng và vitamin của môi trường cơ bản MS - 1962

- Môi trường 2MS: Hàm lượng các chất trong môi trường cơ bản MS tăng gấp 2 lần

- Môi trường 1/2 MS*: Hàm lượng các chất bằng ½ môi trường MS*

Tất cả các môi trường dinh dưỡng đều được bổ sung 0,5mg/lNAA + 0,5mg/l IBA +20 g/l sucrose + 7g/l agar Các công thức thí nghiệm được bố trí như bảng 2.10 dưới đây

Bảng 2.10 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ

dinh dưỡng

Thời gian chồi bắt đầu ra rễ (ngày)

2.3.5 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro ở nhà lưới/vườn ươm

2.3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần phối trộn ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con

Trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí 8 công thức Mỗi công thức đóng 30 bầu, mỗi bầu cấy 01 cây con, và mỗi công thức được lặp lại 3 lần

Cây con Song mật có cùng kích thước, chế độ huấn luyện và chế độ chăm sóc, được cấy vào bầu có thành phần phối trộn trong ruột bầu khác nhau Thí nghiệm được bố trí như bảng 2.11 dưới đây Sau khi cấy cây Song mật được tưới bằng phương pháp phun sương với chế độ tưới 3 lần/ngày và lượng nước 5 - 6 lít/m2/ngày Sau khi cấy cấy xong dùng nilon trắng che tránh thoát hơi nước Sau 8 tuần chăm sóc ta đo chiều cao cây, đếm số lá, quan sát hình thái cây và lá

Bảng 2.11 Ảnh hưởng của thành phần phối trộn trong ruột bầu đến khả năng

sống và sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm

CTTN

Thành phần ruột bầu

Tỷ lệ cây sống (%)

Chiều cao cây sau 8 tuần (cm)

Số lá trung bình/cây

Đất tầng B (%)

Cát (%)

Trấu hun (%)

G5 50 50 -

2.3.5.2 Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến khả năng sống và sinh trưởng của cây

của cây in vitro tại vườn ươm

Trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí 8 công thức Mỗi công thức đóng 30 bầu, mỗi bầu cấy 01 cây con, và mỗi công thức được lặp lại 3 lần

Cây con Song mật có cùng kích thước, chế độ huấn luyện và chế độ chăm sóc, được cấy vào bầu có thành phần phối trộn trong ruột bầu khác nhau Sau khi cấy cây Song mật được tưới bằng phương pháp phun sương với chế độ tưới 3 lần/ngày

và lượng nước 5 - 6 lít/m2/ngày Thí nghiệm được bố trí như bảng 3.13 Sau 6 tuần nghiên cứu ta đo chiều cao cây, đếm số lá, quan sát hình thái cây và lá

Bảng 2.12 Ảnh hưởng của chế độ che sáng trong vườn ươm đến khả năng

sống và sinh trưởng của cây

Nuôi cây trong điều kiện vườn ươm

Thời gian

Tỷ lệ che sáng (%)

Tỷ lệ cây sống (%)

2.3.6 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu

2.3.6.1 Phương pháp thu thập số liệu

- Tạo mẫu sạch in vitro:

+ Chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ mẫu nhiễm

 Tỷ lệ mẫu sạch

 Tỷ lệ mẫu nảy mầm + Thời điểm thu thập số liệu: Sau 02 tuần, 04 tuần nuôi cấy

- Tạo cụm chồi:

+ Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu cấy tạo cụm chồi, thời gian tạo cụm chồi

+ Thời điểm thu thập số liệu: Sau 04 tuần nuôi cấy

- Kích thích tăng trưởng chồi:

+ Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi, số lá/chồi

+ Thời điểm thu thập số liệu: sau 04 tuần nuôi cấy

- Tạo cây hoàn chỉnh

+ Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/ chồi, chiều dài rễ, số chồi tạo rễ, chiều cao cây

Cách đo kích thước cây con: để cây con đặt nằm tự nhiên, kích thước cây con được đo bằng khoảng cách từ nơi cao nhất ra rễ tới mặt lá cao nhất

Cách đo tổng kích thước rễ: chiều dài rễ tính từ thân cây con tới đầu chóp rễ,

đo dần từng rễ, cộng tổng ra tổng kích thước rễ

+ Thời điểm thu thập số liệu: Quan sát thời gian xuất hiện rễ, thống kê số liệu sau 4 tuần nuôi cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể và chế độ chiếu sáng đến tỷ lệ sống của cây

mây nếp in vitro ngoài vườn ươm:

+ Chỉ tiêu theo dõi: Số cây sống, số cây chết

+ Thời gian thu thập số liệu: Sau 04 tuần và 08 tuần chăm sóc

2.3.6.2 Phương pháp xử lý số liệu:

- Tỷ lệ mẫu sạch (%) = Số mẫu sạch

×100 Tổng số mẫu cấy

- Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) = Số mẫu nảy mầm

×100 Tổng số mẫu cấy

- Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = Số mẫu tạo rễ

× 100 Tổng số mẫu cấy

- Tỷ lệ cây sống (%) = Số cây sống

× 100 Tổng số cây cấy

- Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5 (Nguyễn Hải Tuất, Vũ Tiến Hinh

và Ngô Kim Khôi, 2006) [19]

- Tính toán các đặc trưng mẫu

+ Trung bình X = 



m

i i

i X f

+ Phạm vi biến động R = Xmax - Xmin

- Kiểm tra sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm bằng phân tích phương sai một nhân tố và hai nhân tố

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Cho đến nay, các nghiên cứu về nuôi cấy mô - tế bào loài Song mật ở Việt Nam chưa có nhiều Thừa hưởng các kết quả nghiên cứu của loài Mây lá đơn, mây nếp của trung tâm Giống & Công nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khử trùng, tạo cụm chồi, nhân nhanh, kích thích tăng trưởng chồi và tạo cây hoàn chỉnh (tạo rễ) với việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng ở một số nồng độ khác nhau

Với những nội dung đã đề cập ở trên, thông qua những thí nghiệm đã được thực hiện chúng tôi thu được những kết quả sau:

3.1 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro

Để một quy trình nhân giống in vitro thành công thì khâu vào mẫu là rất quan

trọng Để có mẫu sạch đưa vào nuôi vô trùng ta phải lấy mẫu từ ngoài đem về khử trùng để tiêu diệt các vi sinh vật gây hại (nấm mốc, vi khuẩn…) có trên bề mặt Hiện nay, phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến để vô trùng mẫu cấy Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn hay được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật như: NaClO, Ca (OCl)2, HgCl2, H2O2, AgNO3, các chất kháng sinh Nhìn chung một loại hóa chất được lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải đảm bảo hai thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật cao, không hoặc có mức

độ độc tính thấp với mẫu cấy Bên cạnh đó phải đảm bảo được tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ

lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu nảy chồi cao

Tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng là công đoạn khá phức tạp, khó khăn hơn

so với tạo mẫu sạch từ phôi hạt Do Song mật là loài cây có cấu tạo bẹ lá phức tạp bao đỉnh sinh trưởng Quá trình tạo mẫu sạch từ chồi măng mang ý nghĩa hơn so với

tạo nguồn mẫu sạch từ phôi hạt trong quy trình nhân giống in vitro Vì cây con tạo

ra từ chồi măng có phẩm chất di truyền tốt như cây mẹ lựa chọn, cây sinh trưởng, phát triển đồng đều trong cùng một điều kiện sinh thái gây trồng Trong nghiên cứu

nuôi cấy in vitro cây Song mật, khử trùng chồi măng thường khó thực hiện hơn so

với các đối tượng cây trồng khác, vì đây là đối tượng mới, thân cây có cấu tạo dạng

bẹ Trên cơ sở tham khảo các công trình khoa học công bố về kỹ thuật tạo mẫu sạch in

vitro từ chồi cho các loài cây rừng, hầu hết các tác giả cho rằng sử dụng cồn 70% sát

khuẩn bề mặt mẫu trong khoảng thời gian ngắn, sau đó dùng dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% khử trùng trong 5 - 10 phút sẽ đạt được hiệu quả tạo mẫu sạch cao Dung dịch khử trùng HgCl2 là một chất gây độc cực mạnh đối với tế bào sống, do vậy trong quá trình

khử trùng tạo mẫu sạch in vitro nếu kéo dài thời gian khử trùng sẽ thu được tỷ lệ mẫu

sạch cao nhưng hầu hết mẫu lại mất khả năng nảy mầm nên không có ý nghĩa Ngược lại, nếu khử trùng trong khoảng thời gian ngắn lại cho tỷ lệ mẫu sạch thấp, do thời gian chưa đủ để tiêu diệt hết các mầm bệnh Trong khi các chồi măng của cây trội lại rất hiếm, vì khả năng đẻ chồi của Song mật rất chậm, mỗi năm chỉ đẻ 1 - 2 nhánh Vì vậy, cần phải tìm ra công thức tối ưu để nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch và khả năng nảy mầm của mẫu sạch Từ các công thức được bố trí như bảng 2.1, chúng tôi thu được kết quả như trong bảng 3.1 dưới đây

Bảng 3.1 Kết quả tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng Song mật

CTTN

mẫu sạch (%)

Tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm (%)

Chất khử trùng

Thời gian ( phút)

Chất khử trùng

Thời gian ( phút)

Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng của công thức khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và tỷ

lệ mẫu sạch nảy mầm

Kết quả phân tích phương sai 1 nhân tố có F tính (= 6,29) > F 0,05 (=4,6) cho thấy ảnh hưởng của sự phối hợp các chất khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu nảy mầm từ chồi măng là có ý nghĩa

Kết quả bảng 3.1 cho thấy: sự phối hợp các chất khử trùng đã cho kết quả rất khả quan, tỷ lệ mẫu sạch đã đạt khá cao Tuy nhiên, ở các công thức phối hợp khác nhau cho hiệu quả khác nhau Thời gian khử trùng tăng tỷ lệ thuận với tỷ lệ mẫu sạch, nhưng tỷ lệ nghịch với tỷ lệ mẫu nảy mầm Sự phối hợp giữa NaOCl 5% và HgCl2 0,1% (CM1- CM3) đã cho tỷ lệ mẫu sạch đạt từ 46 – 66% nhưng tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm còn thấp

Ở các công thức phối hợp giữa HgCl2 0,1% và HgCl2 0,1% (CM4- CM7) cho hiệu quả tạo mẫu sạch khá cao (đạt tỷ lệ từ 63 - 89%); tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm cũng đạt từ 59 - 65% Công thức khử trùng tốt nhất là CM7 (Khử trùng lần 1 dùng HgCl2

0,1% trong 7 phút, khử trùng lần 2 dùng HgCl2 0,1% trong 3 phút) cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 86,67%, tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm đạt 72,33% Điều này chứng tỏ hiệu quả khử trùng hai lần đều bằng HgCl2 tốt hơn là khử trùng lần 1 bằng NaOCl 5% và lần

2 là HgCl2 0,1%

Hình 3.2 Chồi măng trước khi vào mẫu Hình 3.3 Chồi măng nảy mầm

Tóm lại: Kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro tối ưu nhất từ chồi măng với công thức

khử trùng tốt nhất là công thức phối hợp 2 lần HgCl2 0,1% (lần 1 trong 7 phút, lần 2 trong 3 phút), tỷ lệ mẫu sạch đạt 86,67%, tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm đạt 72,33%

3.2 Kết quả nghiên cứu tạo cụm chồi

Mục đích của giai đoạn tạo cụm chồi là nhằm tạo ra được lượng lớn chồi/cụm

từ một chồi măng ban đầu Giai đoạn này cần đạt được yêu cầu là tạo ra được lượng lớn cụm chồi hữu hiệu trong thời gian ngắn nhất

3.2.1 Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng làm vật liệu tạo cụm chồi

Chồi măng của cây trưởng thành có nhiều thế hệ khác nhau nên có kích thước,

độ tuổi khác nhau, do đó cần phải phân thành từng loại cho phù hợp Với những chồi có đường kính gốc quá nhỏ, ít lá bao bọc, khi khử trùng thường bị thâm đen, không nảy mầm được và bị chết Còn đối với chồi có đường kính gốc lớn, thân và gốc chồi đã hoá gỗ nên rất cứng, khó khăn cho việc tách lá và cắt gốc Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu này là môi trường MS có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng BAP với hàm lượng 2 mg/l, 3 mg/l và 4 mg/l, các thí nghiệm được trình bày như bảng 2.2 Kết quả thu được tổng hợp trong bảng 3.2 dưới đây