TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Đặc điểm sinh vật học, sinh thái học và giá trị kinh tế của Tràm năm gân
1.1.1 Đặc điểm sinh vật học
Tràm năm gân có tên khoa học là Melaleuca quinquenervia (Cav.) S.T.Blake
Tràm năm gân là cây thân gỗ có chiều cao từ 8 đến 12m, có thể đạt tới 25m tùy thuộc vào điều kiện môi trường Lá cây có màu xanh thẫm với năm gân rõ rệt, được gọi là "Five-veined Paperbark" trong tiếng Anh và mang tên khoa học là Boland et al (2006) và Doran và Turnbull (1997).
Cây tràm có cấu trúc nhiều lớp, dễ bong tróc, với lá mọc so le, hình trái xoan hẹp và đặc trưng bởi năm gân Lá cây tràm dài từ 55 - 120mm, rộng 10 - 31mm, có màu xanh xám và lông, được sắp xếp xen kẽ và phẳng Hoa của cây tràm thường xuất hiện ở nách lá phía trên, có nhụy màu trắng với 5 - 10 nhụy xếp xung quanh, cánh hoa dài 3mm và sẽ rụng khi hoa già Thời gian ra hoa kéo dài từ tháng 3 đến tháng 9, từ mùa xuân đến đầu mùa thu Quả nang của cây tràm có hình trụ, rộng 2,5mm và dài 4mm, mọc thành từng chùm và chứa nhiều hạt nhỏ bên trong.
Hình 1.1 Hoa Tràm năm gân
(Nguồn: Photo của Natural Standard Botton 2008) 1.1.2 Đặc điểm sinh thái học
Tràm năm gân là loài cây ưa sáng, phân bố tự nhiên chủ yếu ở duyên hải miền Đông Australia, Papua New Guinea, Irian Jaya (Indonesia) và New Caledonia Tại Australia và Papua New Guinea, loài cây này thường xuất hiện ở những vùng đất thấp, có độ cao dưới 100m so với mực nước biển và nằm trong khoảng vĩ độ 8.
34 o Nam có nhiệt độ trung bình tháng nóng nhất 27 - 31 o C, tháng lạnh nhất
Tràm năm gân thường phát triển ở Papua New Guinea trên đất sét phù sa giàu hữu cơ nhưng nghèo dinh dưỡng, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 - 1.600mm và nhiệt độ từ 6 - 7 độ C Vào mùa ẩm, các đồng bằng nơi đây thường bị ngập lũ sâu hơn 1m Tại New Caledonia, loài tràm này xuất hiện trên các đồi dốc và mỏm núi ở vùng cao, phát triển trên hầu hết các loại đất ngoại trừ những loại đất hình thành từ đá bazơ.
1.1.3 Tác dụng và giá trị kinh tế của Tràm năm gân
Tinh dầu tràm là sản phẩm chiết xuất từ lá tràm, chứa nhiều hợp chất thiên nhiên quý giá như 1,8-cineole, terpinen-4-ol, nerolidol và linalool Trong số đó, 1,8-cineole và terpinen-4-ol là hai loại tinh dầu được tiêu thụ nhiều nhất, trong khi nerolidol và linalool được ưa chuộng trong ngành sản xuất nước hoa và mỹ phẩm nhờ giá trị dược liệu và hương liệu cao 1,8-cineole là một chất thơm tự nhiên đặc trưng của tinh dầu tràm năm gân.
Tràm năm gân (Melaleuca quinquenervia) là loài cây giàu tinh dầu 1,8
Tinh dầu giàu 1,8-cineole nổi bật với tác dụng kháng khuẩn, giúp bảo vệ sức khỏe Ngoài 1,8-cineole, tinh dầu Tràm năm gân còn chứa các hợp chất hương liệu như nerolidol và linalool, trong đó nerolidol có thể chiếm đến 82% ở vùng Moreton, Queensland (Lê Đình Khả, 2012) Tinh dầu Tràm trà, giàu terpinen-4-ol, cũng mang lại nhiều tác dụng sinh học hữu ích.
- Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm
Tinh dầu Tràm năm gân nổi bật với tác dụng kháng khuẩn, tương tự như tinh dầu Tràm cajuput Các thành phần hóa học quan trọng trong tinh dầu này, bao gồm linalool, terpinen-4-ol, α-terpineol, α-terpinene, terpinolene và 1,8-cineole, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật.
Candida albicans, Escherichia coli và Staphylococcus aureus (MIC 0,06-
Tinh dầu Tràm năm gân có khả năng ngăn chặn sự phát triển của nấm và ức chế quá trình hình thành bào tử Chất này đặc biệt hiệu quả trong việc kháng Candida albicans cùng với các loại men và nấm trên da.
Tinh dầu Tràm năm gân có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh mẽ, an toàn cho da, nên được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm như nước súc miệng, mỹ phẩm, nước hoa, dầu gội, xà phòng thơm và kem đánh răng Ngoài ra, tinh dầu này cũng được sử dụng trực tiếp để điều trị mụn cóc và nám da do nấm.
- Tác dụng kháng virus và chống viêm
Tinh dầu Tràm năm gân có khả năng chống lại virus khảm thuốc lá và virus Herpes simplex (HSV) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh dầu này ức chế virus Herpes simplex khi được ủ với các nồng độ khác nhau, và các virus đã xử lý được dùng để gây nhiễm tế bào Đặc biệt, tinh dầu Tràm năm gân thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh nhất trên virus tự do, với khả năng ức chế hoàn toàn sự hình thành mảng bám ở nồng độ 1% và giảm khoảng 10% sự hình thành mảng bám ở nồng độ 0,1% (Lê Đình Khả, 2012).
- Tác dụng chữa trị một số bệnh ngoài da
Tinh dầu Tràm năm gân là một loại thuốc hiệu quả trong việc điều trị các bệnh ngoài da như mụn trứng cá, mụn nhọt, eczema và nhiễm trùng da, bao gồm mụn rộp, vết thương, mụn cóc, bỏng, côn trùng cắn Nó cũng có tác dụng trong việc điều trị các bệnh nấm như nấm móng tay, nấm da bàn chân, mồ hôi chân, nhọt và nấm onychia (onychomycosis) (Khuất Thị Hải Ninh, 2016).
Hình 1.2 Một số sản phẩm từ tinh dầu Tràm năm gân sản xuất tại Việt Nam
Tinh dầu Tràm năm gân có tác dụng sinh học đa dạng, không chỉ được sử dụng như một loại dược liệu đa tác dụng mà còn chứa các hợp chất thơm như nerolidol và linalool Chính vì vậy, tinh dầu tràm được ứng dụng rộng rãi trong nhiều sản phẩm mỹ phẩm, dầu tắm và dầu gội đầu, đặc biệt là trong các spa trên toàn thế giới.
Nghiên cứu về chọn giống Tràm năm gân
1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới
Tràm năm gân (M quinquenervia) là một trong những loài tràm có hàm lượng tinh dầu cao nhất, với lá có 5 gân nổi bật và được gọi là Tràm lá rộng Loài cây này có thân thẳng, cao từ 20-25m, phân bố tự nhiên ở Papua New Guinea và ven biển phía đông Australia Tràm năm gân không chỉ có giá trị kinh tế mà còn có khả năng xua đuổi muỗi, với hàm lượng tinh dầu trong lá tươi đạt từ 1,3% - 2,4% Thành phần 1,8-cineol trong tinh dầu có thể dao động từ 0,2% đến 65% Loài cây này đã được nghiên cứu và phát triển sản xuất tinh dầu Niaouli oil qua dự án hợp tác giữa Trung tâm giống cây rừng Australia và tổ chức Biological Foundation trong giai đoạn 2000-2002.
A study on the origin of 34 seed lots collected from Papua New Guinea to New South Wales revealed two chemotypes of the species The first chemotype, found in Sydney along the eastern coastal area up to Selection Flat in NSW and Maryborough Island in Queensland, is characterized by a high concentration of nerolidol (74-95%) and linalool (14-30%).
Nhóm giàu 1,8-cineole (10 - 75%) và viridiflorol (13-66%) cùng một số chất khác phân bố từ Sydney đến Papua New Guinea Các cây ở phía nam vĩ độ 25 độ Nam thường có hàm lượng tinh dầu cao và bao gồm cả hai chemotype, trong khi các cây ở phía bắc thường có hàm lượng tinh dầu thấp.
Theo nghiên cứu của Khan và Abourashed (2010), tinh dầu cajuput, hay còn gọi là tinh dầu tràm, là tên gọi chung cho các loại tinh dầu chứa 1,8-cineole, bao gồm Tràm năm gân, Tràm trà và Tràm cajuput.
Năm 2005, tại Ba Vì (Hà Nội), 14 xuất xứ của Tràm năm gân đã được khảo nghiệm so với giống đối chứng Tràm cajuput của Việt Nam Kết quả ở giai đoạn 2,5 tuổi cho thấy các xuất xứ Gympie Qld (Q4) và Bribie Island Qld (Q8) có hàm lượng tinh dầu lần lượt là 1,79% và 1,86%, với tỷ lệ 1,8-cineole đạt 75,72% và 78,59%, cùng tỷ lệ limonene là 2,77% và 2,55% Tiếp theo, năm 2008 và 2009, khảo nghiệm tại Phú Lộc (Thừa Thiên - Huế) và Thạnh Hóa (Long An) cho thấy các xuất xứ Casino NSW, West Malam PNG và một số dòng vô tính từ Gympie Qld có triển vọng, với hàm lượng tinh dầu trên 1,44% và tỷ lệ 1,8-cineole trên 65% Những xuất xứ và dòng vô tính này đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật và giống quốc gia.
Nghiên cứu lai giống giữa Tràm năm gân (Q40) và Tràm cajuput (Ca33) cho thấy hàm lượng tinh dầu của cây lai Q40Ca33 chỉ đạt 1,15%, thấp hơn so với cây bố mẹ, trong khi tỷ lệ 1,8-cineole cũng giảm xuống còn 6,8% Tương tự, tổ hợp lai L18Ca61 giữa Tràm lá dài và Tràm cajuput có hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole ở mức trung gian giữa hai cây bố mẹ Trong khi đó, tổ hợp lai Ca33L8 có hàm lượng tinh dầu chỉ đạt 0,85% và tỷ lệ 1,8-cineole 18,7%, kém hơn cây mẹ Ca33 Những kết quả này cho thấy việc lai giống chưa đạt được hiệu quả mong muốn trong việc chọn giống tràm lấy tinh dầu.
Nghiên cứu của Lê Đình Khả (2012) đã chỉ ra rằng các xuất xứ Tràm năm gân như Q4, Q8, Q15, Q16 và Q23 có năng suất tinh dầu khác nhau tại ba địa điểm khảo nghiệm Cụ thể, ở mật độ 11.100 cây/ha, sau ba năm, xuất xứ Q23 tại Phú Lộc đạt năng suất tinh dầu 170 kg/ha/năm, trong khi Q16 tại Thạnh Hóa có năng suất cao nhất là 108 kg/ha/năm và Q15 tại Ba Vì đạt 75 kg/ha/năm Ở giai đoạn 2,2 - 3 năm tuổi, tại Thạnh Hóa, các dòng vô tính Q4.419, Q4.41, Q4.44 và Q4.50 cho năng suất 128-138 kg/ha/năm; tại Phú Lộc, các dòng Q4.45 và Q4.50 đạt 116-133 kg/ha/năm, trong khi tại Ba Vì, các dòng Q4.45 và Q4.40 chỉ đạt 73-98 kg/ha/năm.
Kết quả nghiên cứu chọn giống Tràm năm gân của Lê Đình Khả (2017) cho thấy các cây trội được chọn từ các xuất xứ tốt nhất trong các khu khảo nghiệm giống trồng năm 2005 và 2008 tại Ba Vì, Phú Lộc và Thạnh Hóa Những cây này có sinh trưởng nhanh, hàm lượng tinh dầu từ 1,25 - 2,04%, vượt trội so với các cây khác với tỷ lệ 38 - 387% trong từng lần lặp, và tỷ lệ 1,8-cineole >60% Khảo nghiệm dòng vô tính Tràm năm gân được thực hiện trong các năm 2014 - 2015 tại Ba Vì, Phú Lộc và Thạnh Hóa, cùng với khảo nghiệm tại Phú Lộc cho dòng vô tính thuộc các xuất xứ Q8 và Q15 vào năm 2011 Các dòng vô tính đã được Bộ NN&PTNT công nhận qua khảo nghiệm.
Tại Ba Vì, các dòng vô tính được trồng vào tháng 8/2014 và đo vào tháng 11/2016 bao gồm Q15.013, Q15.38, Q16.427 và Q23.127, với hàm lượng tinh dầu dao động từ 1,35% đến 1,98% Trong đó, dòng Q15.38 có hàm lượng tinh dầu 1,5% và tỷ lệ 1,8-cineole đạt 61,34%, nhưng chưa được công nhận là giống Dòng Q15 có hàm lượng tinh dầu 1,08% và tỷ lệ 1,8-cineole là 61,93%, trong khi dòng Q23 có hàm lượng tinh dầu 1,26% và tỷ lệ 1,8-cineole là 59,90%.
Tại Phú Lộc, các dòng vô tính được trồng vào năm 2011, bao gồm Q15.13 và Q15.38, có hàm lượng tinh dầu lần lượt là 1,53% và 1,62%, với tỷ lệ 1,8-cineole đạt 66,77% và 67,55% Trong khi đó, các dòng vô tính trồng năm 2015 như Q15.21, Q15.38, Q23.127 và Q23.315 cho thấy hàm lượng tinh dầu cao hơn, dao động từ 1,80% đến 2,16%, và tỷ lệ 1,8-cineole đạt 66,16%, vượt trội hơn so với dòng Q23 đối chứng chỉ có 58,28%.
- Tại Thạnh Hóa Các dòng vô tính trồng tháng 12/2014 (đo tháng 11/2016), là Q15.38, Q23.21, Q23.315, Q23.127, có hàm lượng tinh dầu 1,8 - 2,61%, tỷ lệ 1,8-cineole 60,70 - 65,47%, cao hơn Q16 đối chứng (tỷ lệ 1,8- cineole 58,92%).
Nghiên cứu về nhân giống in vitro Chi Tràm
Nghiên cứu nuôi cấy mô Tràm trà bắt đầu từ năm 1996, sử dụng chồi non từ cây trưởng thành đã được trẻ hóa để tạo mẫu sạch Chồi có độ dài 1,5 - 3cm được cấy vào môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP để nhân chồi trong 12 tuần Sau đó, chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ MS với 0,15 mg/l IAA trong 8 tuần (List và cs., 1996).
Công thức tối ưu cho nhân chồi là môi trường MS rắn với 0,125 mg/l BAP hoặc MS lỏng với 0,25 mg/l BAP, tạo ra lần lượt 5,6 và 11,8 chồi/mẫu Trong khi đó, môi trường WPM rắn và lỏng bổ sung 0,125 mg/l BAP cho số chồi tương ứng là 5,5 và 4,7 chồi/mẫu Ba loại chất điều hòa sinh trưởng (NAA, IAA, IBA) ở nồng độ 0,1 mg/l và 0,5 mg/l được thử nghiệm trong giai đoạn tạo rễ in vitro, cho thấy rễ xuất hiện sau 8 ngày khi có chất điều hòa, trong khi không có thì sau 12 ngày Tuy nhiên, tác giả kết luận rằng việc bổ sung chất điều hòa không cần thiết cho quá trình ra rễ in vitro Nghiên cứu về nồng độ sucrose (15; 30; 45 g/l) và loại môi trường nuôi cấy cho thấy môi trường MS + 30 g/l sucrose không có chất điều hòa đạt tỷ lệ ra rễ 100%, trung bình 3 rễ/chồi và chiều dài rễ 2,2cm Việc thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy làm giảm tỷ lệ ra rễ (Yohana de Oliveira et al., 2010).
Nghiên cứu nuôi cấy mô Tràm trà được thực hiện từ chồi nách của cây trưởng thành Chồi được cắt, rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 15 phút, sau đó ngâm trong cồn 70% trong 30 giây và khử trùng bằng natri hypochlorite 10% trong 10 phút, rồi rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng Mẫu tiệt trùng được thấm khô trên giấy lọc vô trùng trước khi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA, đạt tỷ lệ 77% mẫu đẻ chồi và 23 chồi/mẫu cấy Giai đoạn tạo rễ in vitro sử dụng môi trường MS bổ sung 1 mg/l IBA, cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 33,3% (Nadia et al., 2012).
Nghiên cứu nuôi cấy mô loài M.bracteata cho thấy giai đoạn nhân nhanh chồi đạt hiệu quả cao khi sử dụng môi trường MS với 0,5 mg/l BAP và 0,01 mg/l NAA, cho ra 45,5 chồi đủ tiêu chuẩn để ra rễ/bình nuôi cấy Trong giai đoạn tạo rễ, môi trường MS bổ sung 1 - 1,5 mg/l IBA cho tỷ lệ chồi ra rễ cao, đạt 96% (Lê Đình Khả, 2012).
Nghiên cứu nhân giống in vitro Tràm trà cho thấy việc bổ sung cytokinin, đặc biệt là 6-benzyladenine (BA), có tác dụng tích cực trong việc tăng cường sự nhân chồi Các chồi in vitro được xử lý bằng BA cho thấy khả năng ra rễ tốt hơn so với môi trường không có BA Cụ thể, nồng độ BA thấp nhất (0,55 µM) đã làm tăng đáng kể tỷ lệ nhân giống, nhờ vào sự gia tăng số lượng chồi Ở giai đoạn ra rễ, các chồi được xử lý bằng BA trước đó có tỷ lệ ra rễ cao hơn (91-97%) và chiều cao tăng trưởng đáng kể so với nhóm đối chứng không có BA (66%) (Carla Midori Iiyama và Jean Carlos Cardoso, 2021).
Nghiên cứu về nhân giống in vitro Tràm trà chỉ ra rằng môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi là MS + 0,1 mg/l BA kết hợp với (0,3 - 0,5) mg/l IBA Đối với việc tạo rễ, môi trường thích hợp là MS + 0,3 mg/l IBA (Đinh Thị Huyền, 2006).
Nghiên cứu nhân giống in vitro Tràm cajuput cho thấy rằng việc khử trùng bề mặt mẫu cấy bằng cồn 70° trong 30 giây, dung dịch Clorox 20% trong 30 phút, và HgCl2 0,05% trong 30 phút là hiệu quả cho cả mẫu non và mẫu già Môi trường nhân nhanh chồi thích hợp cho Tràm cajuput là MS + 2 mg/l BA (Phùng Thị Hằng và Nguyễn Bảo Toàn, 2011).
Nghiên cứu nhân giống in vitro Tràm năm gân và Tràm trà cho thấy thời kỳ vào mẫu thích hợp là từ tháng 4 đến tháng 9, sử dụng dung dịch HgCl 2 0,1% trong 4 - 5 phút Môi trường nhân nhanh chồi cho Tràm năm gân được xác định với công thức MS + 2g/l than hoạt tính + 2 mg/l BAP + 1,0 ml GA3 (Lê Sơn, 2011).
Nghiên cứu về Tràm trà cho thấy việc sử dụng chồi đỉnh từ cây 4 năm tuổi, sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút và dung dịch javel 75% trong 15 phút, đạt tỷ lệ nảy chồi sạch là 70,59% Môi trường LV (Litvay, 1985) bổ sung 0,5 mg/l BAP tạo ra 1,1 chồi/mẫu trong giai đoạn tái sinh và 13,2 chồi/cụm trong giai đoạn nhân nhanh Tuy nhiên, khi bổ sung 1 - 2 mg/l BAP, mẫu cấy có xu hướng tạo chồi nhưng kìm hãm sự phát triển chiều cao Đặc biệt, môi trường LV bổ sung 2 mg/l NAA đạt tỷ lệ ra rễ cao nhất là 60,42%.
Nhân giống dòng vô tính Tràm năm gân Q4, Q15 và Q23 bằng nuôi cấy mô tại Viện Công nghệ sinh học lâm nghiệp cho thấy khử trùng mẫu cành bánh tẻ bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút (chia 2 lần) đạt tỉ lệ nhiễm chỉ 3% và tỉ lệ mẫu sạch nảy chồi 70 - 83,3% Môi trường MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin là tối ưu cho tái sinh chồi lần 1 với tỉ lệ nảy chồi 93,3-100% (3,5 - 4 chồi/nách lá) Để tái sinh chồi lần hai, môi trường MS* + 0,5mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 30 mg/l đường glucose (hoặc 20g/l glucose + 10g/l sucrose) là phù hợp nhất Môi trường tạo cụm chồi tốt nhất là MS* + 0,2 - 0,5mg/l BAP + 0,2mg/l K + 0,1mg/l NAA Môi trường tạo rễ thích hợp là MS* + 30g/l sucrose (hoặc 20g/l glucose + 10g/l sucrose) + 0,3 - 0,5mg/l NAA, với tỉ lệ ra rễ trên 90% và rễ chất lượng tốt Huấn luyện cây mô dưới ánh sáng tán xạ trong 2 tuần trước khi cấy ở vườn ươm giúp tỉ lệ cây sống đạt 86,7 - 91,1%.
Nghiên cứu nhân giống in vitro các dòng vô tính Tràm trà như A38.124, A38.39 và A30.310 cho thấy khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút (chia thành 2 lần: 3 phút + 2 phút) đạt tỷ lệ mẫu sạch và mẫu sạch nảy chồi hiệu quả cao nhất (67,8%) Môi trường tái sinh chồi tối ưu là MS* bổ sung 1 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin và 0,1 mg/l NAA, với 100% mẫu tạo cụm chồi, trung bình 6,41 chồi/cụm và chiều cao chồi đạt 0,9 cm Môi trường tạo cụm chồi thích hợp là MS* + 7g/l agar + 1 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 0,15 mg/l NAA, bổ sung 10g/l glucose và 20g/l sucrose, đạt 100% mẫu tạo cụm chồi và 5,45 chồi/cụm Môi trường kích thích tăng trưởng chồi hiệu quả là MS* + 0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA, với mức tăng trưởng đạt 2,2 cm.
Trong quá trình nuôi cấy cây con trong ống nghiệm, môi trường tối ưu nhất là MS* kết hợp với 0,3 mg/l NAA, cho tỷ lệ ra rễ đạt 98,7% và rễ phát triển với chất lượng tốt (Lê Đình Khả, 2017)[8].
Nhân giống bằng nuôi cấy mô Tràm năm gân được thực hiện cho các dòng vô tính triển vọng như Q4.44, Q15.38, Q23.21 Nghiên cứu cho thấy, sử dụng chồi nửa hóa gỗ khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút (chia thành 2 lần) đạt tỷ lệ nhiễm chỉ 3,3% và tỷ lệ nảy chồi từ 70 - 83,3% Môi trường MS* bổ sung 0,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l kinetin cho tỷ lệ nảy chồi lần một đạt 93,3 - 100% với 3,5 - 4 chồi/nách lá Để tái sinh chồi lần hai, môi trường MS* với 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin và 30 g/l glucose (hoặc 20 g/l glucose + 10 g/l sucrose) là tối ưu Đối với tạo cụm chồi, môi trường MS* với 0,2 - 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l K và 0,1 mg/l NAA là phù hợp Cuối cùng, để cây mô ra rễ, môi trường MS* với 30 g/l glucose (hoặc 20 g/l glucose + 10 g/l sucrose) kết hợp 0,3 - 0,5 mg/l NAA là hiệu quả.
Huấn luyện cây mô dưới ánh sáng tán xạ trong 2 tuần trước khi cấy vào bầu tại vườn ươm giúp nâng cao tỷ lệ sống đạt từ 86,7% đến 91,1%, với rễ có chất lượng tốt lên đến 90% (Lê Đình Khả, 2017).
Một số nhận định chính
Nghiên cứu cho thấy, Tràm năm gân trồng tại Việt Nam có hai nhóm chính: một nhóm giàu terpinen-4-ol và một nhóm giàu 1,8-cineole Do đó, có thể lựa chọn giống theo cả hai hướng này Trong những năm gần đây, tinh dầu Tràm trà đã mở rộng thị trường toàn cầu với giá thành cao, dự báo ngành công nghiệp tinh dầu Tràm trà sẽ phát triển mạnh mẽ trong tương lai.
Tràm năm gân đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra giá trị kinh tế cao Để phát triển các cánh rừng Tràm chất lượng, cần thiết phải nhân giống các loại đã được công nhận.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là điều hết sức cần thiết
Trồng cây tràm năm gân bằng phương pháp cây mô đang được xem là một hướng đi tiềm năng trong tương lai Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây tràm tại Việt Nam và trên thế giới sẽ là nền tảng cho việc thực hiện các nghiên cứu liên quan đến ba dòng cây tràm Q15.38, Q15.013 và Q16.427.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chung: Hoàn thiện kỹ thuật nhân giống in vitro cho 3 dòng
+ Xác định được phương pháp khử trùng thích hợp tạo mẫu sạch cho 3 dòng Tràm năm gân Q15.38, Q15.013, Q16.427
+ Xác định được chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng thích hợp để nhân nhanh chồi cho 3 dòng Tràm năm gân Q15.38, Q15.013, Q16.427
+ Xác định được chất điều hòa sinh trưởng phù hợp để tạo rễ in vitro cho 3 dòng Tràm năm gân Q15.38, Q15.013, Q16.427
+ Xác định được loại giá thể phù hợp để ra ngôi cây mô giai đoạn vườn ươm.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh thời gian khử trùng bằng Javen 5% đến khả năng tạo mẫu sạch;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đến khả năng tạo cụm chồi và kích thích tăng trưởng chồi;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây mô giai đoạn vườn ươm.
Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu : Dòng vô tính tràm năm gân Q15.38, Q15.013,
Q16.427 do Viện Cải thiện giống và Phát triển lâm sản cung cấp
- Vật liệu nghiên cứu : Chồi non mọc từ cây mẹ đã tiến hành trẻ hóa trước thời điểm lấy mẫu 1 - 1,5 tháng
- Địa điểm nghiên cứu : Tiến hành nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Viện
Công nghệ sinh học - Trường Đại học Lâm nghiệp.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện qua các bước bao gồm tạo mẫu sạch, phát triển cụm chồi, kích thích sự tăng trưởng chồi, hoàn thiện cây con và trồng cây mô ra vườn ươm Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 30 mẫu cho mỗi lần Nhiệt độ trong phòng nuôi được duy trì ở mức 25 ± 2 °C.
Sơ đồ nghiên cứu nuôi cấy mô dòng Tràm năm gân
Dòng tuyển chọn dòng vô tính tràm năm gân Q15.38, Q15.013, Q16.427
(do Viện Cải thiện giống và Phát triển lâm sản cung cấp)
Khử trùng mẫu cấy
(xử lý Javel 0,5% với thời gian khác nhau)
Nhân nhanh chồi (tạo cụm chồi và kích thích tăng trưởng chồi)
(Xác định chất điều hoà sinh trưởng và ánh sáng)
Tạo rễ in vitro (Xác định nồng độ IBA)
Trồng cây mô ra vườn ươm (Xác định loại giá thể) 2.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Nghiên cứu được thực hiện qua các bước bao gồm tạo mẫu sạch, hình thành cụm chồi, kích thích tăng trưởng chồi, phát triển cây con hoàn chỉnh và cuối cùng là trồng cây mô ra vườn ươm Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, với mỗi lần có 30 mẫu Nhiệt độ trong phòng nuôi được duy trì ở mức 25 ± 2 °C.
Chọn mẫu chồi từ thân cây 2-3 tuổi đã được trẻ hóa khoảng 1-1,5 tháng trước khi lấy mẫu Đoạn chồi nên dài từ 7-10 cm, mập và có mắt ngủ ở nách lá Cần cắt bỏ lá và chỉ để lại cuống lá.
Khử trùng mẫu ngoài box cấy:
Mẫu cần được rửa dưới vòi nước chảy trong 5 phút và ngâm trong nước xà phòng loãng Sử dụng chổi lông mềm để cọ rửa mẫu, sau đó rửa sạch xà phòng dưới vòi nước chảy Cuối cùng, tráng mẫu 5 lần bằng nước cất và đựng trong bình có nắp xoáy đã được khử trùng qua nồi hấp vô trùng.
Khử trùng mẫu trong box cấy:
+ Mẫu được tiếp tục được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 2 - 3 phút
Lắc mẫu trong dung dịch Javen nồng độ 5% trong các khoảng thời gian 5, 10, 15 và 20 phút Sau khi hoàn tất, đổ bỏ dung dịch Javen và tiếp tục lắc mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần, mỗi lần kéo dài từ 3 đến 5 phút.
Sau khi khử trùng, sử dụng panh và kéo để loại bỏ những phần bị thâm do ngấm dung dịch Javen hoặc những đoạn mẫu quá già, sau đó cắt thành các đoạn dài 2 cm.
- 3 cm, có ít nhất 1 mắt ngủ, cắm phần gốc ngập 4 - 5 mm vào môi trường theo phương thẳng đứng
+ Môi trường tái sinh chồi Tràm năm gân: MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6 g/l, pH = 5,8
+ Chế độ ánh sáng: 10 - 15 ngày đầu che sáng hoàn toàn, khi mắt ngủ đã bắt đầu nảy chồi chuyển ra nuôi dưới ánh sáng 1.000 lux
- Theo dõi sự phát triển của chồi, loại bỏ mẫu nhiễm
Sau khoảng 25 - 30 ngày cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi, nếu chồi mới đạt chiều cao từ 1 cm trở lên, tiến hành cắt chồi và chuyển sang môi trường tạo cụm chồi.
- Thu thập số liệu: Sau 4 tuần, số mẫu sạch nảy chồi, mẫu sạch chết và số mẫu nhiễm
Nghiên cứu của Khuất Thị Hải Ninh và đồng tác giả (2015) cho thấy, trong quá trình nhân giống in vitro các dòng vô tính Q4.44 và Q23.21 của cây Tràm năm gân, giai đoạn tạo cụm chồi hiệu quả nhất sử dụng môi trường MS với nồng độ NH4NO3 giảm đi một nửa, kết hợp với 0,2 - 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA, 20 g/l đường sucrose, 10 g/l đường glucose, 6 g/l agar và pH điều chỉnh ở mức 5,8.
Kế thừa kết quả nghiên cứu này, giai đoạn tạo cụm chồi cho các dòng Q15.38, Q15.013, Q16.427 tiếp tục sử dụng môi trường MS* (nồng độ
Nghiên cứu điều chỉnh công thức dinh dưỡng cho cây trồng bằng cách giảm 1/2 lượng NH4NO3 so với công thức MS, bổ sung 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA, cùng với 20 g/l đường sucrose, 10 g/l đường glucose và 6 g/l agar, với pH = 5,8 Thí nghiệm mở rộng thang nồng độ BAP được thực hiện với các mức 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 và 1 mg/l.
Chế độ ánh sáng: 1.000 lux trong cả chu kỳ nuôi
Thu thập số liệu: Sau 4 tuần nuôi cấy về số mẫu tạo cụm chồi, số chồi/cụm, chiều cao chồi
2.4.1.3 Kích thích tăng trưởng chồi a) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng kích thích tăng trưởng chồi
Sử dụng công thức tốt nhất ở thí nghiệm tạo cụm chồi tiếp tục điều chỉnh hàm lượng Kinetin 0,1 - 0,5 mg/l
Môi trường MS* bổ sung 20 g/l đường sucrose + 10 g/l đường glucose +
6 g/l agar, pH = 5,8 Ánh sáng được sử dụng là 1.000 lux trong suốt chu kỳ nuôi b) Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng kích thích tăng trưởng chồi
Nghiên cứu tiếp tục tập trung vào ảnh hưởng của ánh sáng đối với khả năng phát triển chồi, sử dụng công thức thí nghiệm tối ưu trong thí nghiệm kích thích tăng trưởng chồi.
AS1: Cường độ chiếu sáng 2.000 lux trong 1 chu kỳ nuôi;
AS2: Cường độ chiếu sáng 1.000 lux trong 1 chu kỳ nuôi;
AS3: Che tối hoàn toàn trong 1 tuần đầu sau khi cấy chuyển 1 tuần sau đó chiếu sáng ở cường độ 1.000 lux
Thu thập số liệu: Sau 3 tuần nuôi cấy về chiều cao chồi, số chồi hữu hiệu (chồi có chiều cao 2 - 3 cm) và đặc điểm chồi
2.4.1.4 Kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Chọn chồi khỏe mạnh, xanh, mập, cứng cáp với ít nhất 2 đốt lá và chiều cao từ 2 - 2,5 cm để cấy chuyển sang môi trường ra rễ Môi trường này bao gồm Tràm năm gân MS*, 20 g/l đường sucrose, 10 g/l đường glucose, 6 g/l agar, pH = 5,8, và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA với nồng độ 0,5; 1; 1,5 và 2 mg/l Chế độ ánh sáng cần duy trì ở mức 1.000 lux trong suốt chu kỳ nuôi.
Thu thập số liệu: Số liệu thu thập sau 3 tuần nuôi cấy gồm: Số chồi ra rễ, số rễ/cây và chiều dài rễ
2.4.1.5 Huấn luyện và ra ngôi
Cây mô đã được ra rễ trong bình và huấn luyện dưới ánh sáng tán xạ trong 2 tuần Sau đó, cần rửa sạch agar, cắt bớt rễ nếu quá dài, và ngâm trong dung dịch Viben C nồng độ 3% hoặc các dung dịch chống nấm khác trong khoảng 3 - 5 phút.
Từng cây được cấy trực tiếp vào bầu; kích thước túi bầu 7 x 12 cm hoặc 8 x 12 cm, dán đáy, đục lỗ xung quanh
GT1: 100% là đất tầng B sàng kỹ;
GT2: 30% xơ dừa + 70% đất tầng B sàng kỹ;
GT3: 30% trấu hun và 70% đất tầng B sàng kỹ
Sau 3 tháng thu thập số liệu, tỷ lệ cây sống, chiều cao cây và chất lượng cây được đánh giá như sau: Chất lượng tốt khi ngọn chính phát triển tốt, lá xanh và thân mập; chất lượng trung bình khi ngọn chính phát triển tốt, lá xanh nhưng thân mảnh; chất lượng xấu khi lá vàng và thân mảnh.
2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu
* Tính toán các chỉ tiêu thu thập:
+ Tỷ lệ mẫu sạch (%) Số mẫu sạch x 100 Tổng số mẫu cấy
+Hệ số nhân chồi (lần) Số chồi tạo thành x 100 Tổng số mẫu cấy
+ Tỷ lệ ra rễ (%) Số chồi ra rễ x 100 Tổng số mẫu cấy
* Tính toán các đặc trưng mẫu bằng công thức sau:
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS và phần mềm Excel
So sánh các công thức thí nghiệm dựa trên tiêu chuẩn tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ mẫu nảy chồi, tỉ lệ chồi ra rễ và tỉ lệ cây sống ngoài vườn ươm thông qua phương pháp kiểm định khi bình phương ( 2) giúp xác định hiệu quả và độ tin cậy của từng công thức Việc áp dụng tiêu chí này cho phép đánh giá chính xác sự khác biệt giữa các công thức, từ đó tối ưu hóa quy trình nhân giống và phát triển cây trồng.
Nếu Sig (xác suất của 2 ) nhỏ hơn 0,05 các chỉ tiêu quan sát có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
Nếu Sig (xác suất của 2 ) lớn hơn 0,05 các chỉ tiêu quan sát không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
Bài viết này so sánh các công thức thí nghiệm liên quan đến chiều dài chồi, hệ số nhân chồi, chiều dài rễ, số lượng rễ trên mỗi cây và chiều cao cây bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố Thông qua phân tích này, chúng ta có thể đánh giá sự khác biệt và ảnh hưởng của các yếu tố đến sự phát triển của cây trồng.
Nếu Sig (xác suất của F) nhỏ hơn 0,05 các chỉ tiêu sinh trưởng có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
Nếu Sig (xác suất của F) lớn hơn 0,05 các chỉ tiêu sinh trưởng không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
Số liệu đã thu thập được xử lý bằng phần mềm SPSS (Nguyễn Hải Tuất và Nguyễn Trọng Bình, 2005) và phần mềm Excel
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi
Kết quả nhân giống in vitro các dòng vô tính Tràm năm gân (Q4.44 và Q23.21) cho thấy, trong giai đoạn nhân chồi, việc sử dụng 0,2 mg/l Kinetin kết hợp với 0,1 mg/l NAA và các nồng độ BAP khác nhau (0,3; 0,5; 1 và 2 mg/l) đã ảnh hưởng đến sự phát triển chồi Cụ thể, nồng độ BAP lớn hơn 1 mg/l dẫn đến hạn chế phát triển chiều cao của chồi (Khuất Thị Hải Ninh et al., 2015) Do đó, trong nghiên cứu tạo cụm chồi cho các dòng Q15.38, Q15.013 và Q16.427, các nồng độ BAP từ 0,1 mg/l đến 1 mg/l được tiếp tục áp dụng.
Các chồi được hình thành trong giai đoạn tạo mẫu sạch đã được cấy chuyển sang môi trường MS, kèm theo các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau Mục tiêu là nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi và tăng trưởng chồi, với kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Khả năng tạo cụm chồi của Q15.38; Q15.013 và Q16.427 trong môi trường MS* bổ sung 0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + (0,1 -
1,0 mg/l BAP) ( sau 4 tuần nuôi cấy )
Các dòng Tràm năm gân
Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi
Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi TB (%)
Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi
(Ghi chú: TB: Trung bình)
Dữ liệu từ bảng 3.2 cho thấy sự khác biệt trong khả năng tạo cụm chồi giữa các dòng vô tính Tràm năm gân Dòng Q15.38 thể hiện sự sinh trưởng tốt nhất với hệ số nhân chồi đạt từ 2,4 đến 6,7 lần và chiều cao chồi từ 0,61 đến 2,55 cm Theo sau là dòng Q16.427 với hệ số nhân chồi từ 1,7 đến 5,2 lần và chiều cao chồi từ 0,76 đến 2,75 cm Cuối cùng, dòng Q15.013 có hệ số nhân chồi từ 1,5 đến 3,5 lần và chiều cao chồi từ 0,57 đến 2,84 cm.
Dòng Q15.38, trong môi trường nuôi cấy giữ nguyên 0,2 mg/l Kinetin
Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung 0,1 mg/l NAA cùng với BAP ở nồng độ từ 0,1 - 1 mg/l có ảnh hưởng rõ rệt đến việc tạo cụm chồi Cụ thể, khi bổ sung ≤ 0,5 mg/l BAP, chiều cao chồi tăng từ 1,8 - 2,55 cm, tuy nhiên hệ số nhân chồi chỉ đạt 2,4 - 3,8 lần Ngược lại, với nồng độ BAP ≥ 0,7 mg/l, mặc dù chiều cao chồi giảm xuống còn 0,61 - 1,56 cm, nhưng hệ số nhân chồi lại tăng lên đáng kể, đạt từ 3,8 - 6,7 lần.
Công thức 0,7 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA với 100% mẫu đẻ chồi, hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,7 lần, chiều cao chồi trung bình đạt 1,55 cm
Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng Q15.013 và Q16.427 có hệ số nhân cao nhất trong môi trường tạo cụm chồi với 0,7 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin và 0,1 mg/l NAA Cụ thể, dòng Q15.013 đạt hệ số nhân 3,5 lần và chiều cao chồi 1,15 cm, trong khi dòng Q16.427 đạt hệ số nhân 5,2 lần và chiều cao chồi 1,21 cm.
So sánh kết quả nhân chồi giữa các dòng Q4.44 và Q23.21 cho thấy môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi và kích thích tăng trưởng là MS* kết hợp với (0,2 - 0,5) mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin và 0,1 mg/l NAA.
Nghiên cứu cho thấy rằng các dòng Q15.38, Q15.013 và Q16.427 cần được nuôi cấy trong môi trường MS* kết hợp với 0,7 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin và 0,1 mg/l NAA để tăng hệ số nhân chồi hiệu quả.
Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và cường độ ánh sáng đến khả năng kích thích tăng trưởng nhân nhanh thể chồi
3.3.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh thể chồi
Từ kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi cho thấy môi trường 0,7 mg/l BAP
Sử dụng 0,2 mg/l Kinetin kết hợp với 0,1 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi khá cao, tuy nhiên chồi chưa phát triển mạnh về chiều cao Do đó, cần tiếp tục duy trì 0,7 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA, đồng thời điều chỉnh nồng độ Kinetin trong khoảng 0,1 - 0,5 mg/l để kích thích sự phát triển nhanh chóng của chồi Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Khả năng tăng trưởng chồi của Q15.38; Q15.013 và Q16.427 trong môi trường MS* bổ sung 0,7mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1 - 0,5 mg/l) Kinetin (sau 3 tuần nuôi cấy )
Các dòng Tràm năm gân
Tỷ lệ chồi hữu hiệu
Tỷ lệ chồi hữu hiệu TB (%)
Chiều cao chồi TB (cm)
Tỷ lệ chồi hữu hiệu
(Ghi chú: TB: Trung bình.)
Trong môi trường nuôi cấy với nồng độ cố định 0,7 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA, việc điều chỉnh nồng độ kinetin từ 0,1 đến 0,5 mg/l đã tác động rõ rệt đến khả năng kích thích tăng trưởng chồi.
Công thức 0,3 mg/l Kinetin, 0,7 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA mang lại kết quả tối ưu trong việc nhân nhanh chồi và kích thích tăng trưởng chồi cho dòng Q15.38 và Q16.427 Tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 86,7% và 88,9%, hệ số nhân chồi lần lượt là 6,7 và 5,4, trong khi chiều cao chồi đạt 2,67 cm.
Dòng Q15.013 với công thức 0,4 mg/l Kinetin, 0,7 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA mang lại kết quả tối ưu, đạt tỷ lệ chồi hữu hiệu 84,4%, hệ số nhân chồi 3,7 lần và chiều cao chồi 2,96 cm.
3.3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi Ánh sáng có vai trò và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của cây Mức độ chiếu sáng, cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của cây trồng
Sử dụng môi trường nhân chồi MS + 0,7 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA tốt nhất cho dòng Q15.38 và dòng Q16.427, môi trường chồi
MS + 0,7 mg/l BAP + 0,4 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA cho dòng Q15.013 để tiếp tục thử nghiệm ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tăng trưởng chồi
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi các dòng Q15.38; Q15.013 và Q16.427 ( sau 3 tuần nuôi cấy)
Các dòng Tràm năm gân
Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu
TB (cm) Đặc điểm chồi
Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu
TB (cm) Đặc điểm chồi
Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu
TB (cm) Đặc điểm chồi
Chồi hơi vàng, mảnh 74,4 2,31 Chồi hơi vàng, mảnh
Ghi chú: TB: Trung bình,
AS1: Cường độ chiếu sáng 2.000 lux trong chu kỳ nuôi,
AS2: Cường độ chiếu sáng 1.000 lux trong cả chu kỳ nuôi,
AS3: Che tối hoàn toàn trong 1 tuần đầu sau khi cấy, sau đó chiếu sáng ở cường độ 1.000 lux thời gian nuôi còn lại
Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong khả năng phát triển chồi của các dòng nghiên cứu, theo số liệu từ bảng 3.4 Cụ thể, chế độ chiếu sáng AS1 với cường độ 2.000 lux trong suốt chu kỳ nuôi đã dẫn đến hiện tượng vàng mảnh ở chồi và sự sinh trưởng kém, với chiều cao chồi chỉ đạt từ 2,14 đến 2,31 cm và tỷ lệ chồi hữu hiệu thấp, chỉ từ 65,6% đến 74,4%.
Khi cường độ ánh sáng quá mạnh, cấu trúc của bộ máy quang hợp bị tổn thương, dẫn đến sự phá hủy hệ thống sắc tố Điều này gây ức chế phản ứng sáng và quá trình photphoryl hóa quang hóa, đồng thời cũng ảnh hưởng đến các phản ứng tối do protein bị biến tính Kết quả là các chồi trở nên vàng mảnh và sinh trưởng kém.
Chế độ ánh sáng AS3, với việc che tối hoàn toàn trong tuần đầu sau khi cấy và chiếu sáng ở cường độ 1.000 lux trong thời gian còn lại, không phù hợp cho sự sinh trưởng của chồi, khi chiều cao chồi chỉ đạt 1,84 - 1,96 cm và tỷ lệ chồi hữu hiệu thấp, từ 55,6 - 64,4% Trong quá trình che sáng, đã xuất hiện hiện tượng chồi bị chết, điều này cho thấy thí nghiệm nhằm kích thích kéo dài chồi trong giai đoạn đầu không đạt hiệu quả mong muốn, mặc dù phương pháp này đã thành công trong nhân giống in vitro đối với bạch đàn Sự xuất hiện chồi chết ở Tràm năm gân có thể được giải thích bởi đặc tính di truyền của loài, khi ánh sáng quá yếu dẫn đến cường độ quang hợp thấp, không đủ để bù đắp cho lượng chất bị phân hủy do hô hấp.
Chế độ ánh sáng AS2 với cường độ chiếu sáng 1.000 lux trong suốt chu kỳ nuôi là tối ưu nhất để thúc đẩy sự tăng trưởng của chồi, mang lại tỷ lệ chồi hữu hiệu cao.
83,3 - 90%, chiều cao chồi chỉ 2,75 - 2,86 cm)
Hình 3.2 Dòng Q15.38 (hình A), Q15.013 (hình B) và dòng Q16.427 (hình
C) với chế độ ánh sáng 1.000 lux trong cả chu kỳ nuôi
Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Chồi cao từ 2 - 2,5 cm được chuyển sang môi trường tạo cây con hoàn chỉnh, sử dụng môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau (bảng 3.5).
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro
Các dòng Tràm năm gân
Tỷ lệ chồi ra rễ TB
Số lượng rễ TB/ cây (cái)
Tỷ lệ chồi ra rễ TB (%)
Số lượng rễ TB/ cây (cái)
Tỷ lệ chồi ra rễ TB (%)
Số lượng rễ TB/ cây (cái)
Ghi chú: TB: Trung bình
Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy tỷ lệ ra rễ của dòng vô tính khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 - 2 mg/l có sự biến động lớn giữa các thí nghiệm Hiệu quả ra rễ tăng dần khi nồng độ NAA từ 0,5 - 1,5 mg/l, với tỷ lệ ra rễ, chiều dài rễ và số lượng rễ đều cải thiện Tuy nhiên, khi nồng độ NAA đạt 2 mg/l, hiệu quả ra rễ giảm rõ rệt Cả ba dòng nghiên cứu cho thấy công thức 1,5 mg/l NAA mang lại hiệu quả tốt nhất, với 100% chồi ra rễ, số lượng rễ đạt 2,4 - 3,8 rễ/cây và chiều dài rễ từ 1,8 - 2,2 cm, kích thước này rất phù hợp cho giai đoạn ra ngôi cây con ở vườn ươm.
Kết quả so sánh cho thấy tỷ lệ ra rễ của các dòng Q4.44 và Q23.21 trong môi trường bổ sung 0,3 - 0,5 mg/l NAA đạt trên 90%, với chất lượng rễ tốt (Khuất Thị Hải Ninh, 2015)[10].
Sử dụng NAA với nồng độ 1,5 mg/l mang lại hiệu quả rõ rệt cho các dòng cây Q15.38, Q15.013 và Q16.427, với tỷ lệ ra rễ đạt 100% và chất lượng rễ tốt, bao gồm rễ mập, trắng và khỏe.
Hình 3.3 Cây in vitro hoàn chỉnh các dòng Q15.38, Q15.013 và Q16.427
(từ trái qua phải) trên môi trường MS * + 1,5 mg/l NAA
Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây mô giai đoạn vườn ươm
Cây mô được huấn luyện dưới ánh sáng tán xạ trong 2 tuần trước khi cấy ra vườn ươm Sau đó, những cây con in vitro có bộ rễ phát triển hoàn chỉnh và cứng cáp sẽ được rửa sạch agar bám trên rễ Cây sau đó được trồng trong ba loại giá thể khác nhau: GT1 (100% đất tầng B sàng kỹ), GT2 (30% xơ dừa và 70% đất), và GT3 (70% đất tầng B sàng kỹ + 30% trấu hun) Kết quả chi tiết được thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây invitro các dòng Tràm năm gân ở vườn ươm (sau 3 tháng ra ngôi)
Các dòng Tràm năm gân
Tỷ lệ cây sống TB
Chiều cao cây TB (cm)
GT1 93,33 11,98 xấu 91,11 12,25 xấu 91,11 11,75 xấu GT2 96,67 19,87 TB 93,33 18,84 TB 94,44 17,94 TB
Ghi chú: TB: Trung bình
Kết quả đánh giá sinh trưởng của các dòng vô tính Tràm năm gân sau 3 tháng trồng cho thấy tỷ lệ cây sống cao (trên 91%) và không có sự khác biệt giữa các công thức thí nghiệm (sig > 0,05) Tuy nhiên, có sự khác biệt về chất lượng cây con và sinh trưởng chiều cao cây giữa các loại giá thể (sig < 0,05) Cả 3 dòng vô tính đều sinh trưởng kém trên giá thể GT1 100% đất tầng B, với chiều cao trung bình chỉ đạt 11,75 - 12,25 cm và chất lượng cây kém Ngược lại, cây sinh trưởng tốt hơn trên giá thể GT2 30% xơ dừa và 70% đất tầng B, với chiều cao cây đạt từ 17,94 cm.
Chiều cao trung bình của cây ở công thức GT1 chỉ đạt 19,87 cm với chất lượng trung bình Ngược lại, công thức GT3 với 30% trấu hun và 70% đất cho chiều cao trung bình từ 21,67 - 25,49 cm, cho thấy sự sinh trưởng vượt trội gấp 2 lần so với GT1 Cây trồng theo công thức GT3 có chất lượng tốt hơn, với lá xanh, mập và ngọn chính phát triển khỏe mạnh.
Giá thể có thành phần trấu hun giúp cho đất tơi xốp giúp cây phát triển tốt hơn so với giá thể 100% đất hoặc trộn xơ dừa
Dòng Q13.38 trên giá thể GT3
Dòng Q15.013 trên giá thể GT3
Dòng Q16.427 trên giá thể GT3
Dòng Q13.38 trên giá thể GT1
Dòng Q16.427 trên giá thể GT1
Hình 3.4 Cây mô các dòng vô tính Tràm năm gân sau 3 tháng trồng ở giai đoạn vườn ươm trên giá thể GT3 (GT3 70% đất tầng B sàng kỹ +
30% trấu hun) và GT1 (GT1 100% là đất tầng B sàng kỹ
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Kết luận a) Kỹ thuật khử trùng tạo mẫu sạch Tràm năm gân
Để tạo mẫu sạch cho các dòng Tràm năm gân, cần khử trùng mẫu chồi bằng dung dịch Javen 5% trong thời gian 10 phút Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi đạt từ 44,44% đến 64,4% Đồng thời, môi trường tạo cụm chồi cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Môi trường tối ưu cho việc tạo cụm chồi của dòng Tràm năm gân bao gồm MS* với nồng độ 0,7 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA, 20 g/l đường sucrose, 10 g/l đường glucose, và 6 g/l Agar, pH = 5,8 Môi trường này đạt tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi 100%, với số chồi trung bình mỗi cụm dao động từ 3,5 đến 6,7 chồi.
Công thức dinh dưỡng gồm 0,3 mg/l Kinetin, 0,7 mg/l BAP, 0,1 mg/l NAA, 20 g/l đường sucrose, 10 g/l đường glucose, 6 g/l agar và pH 5,8 đã cho kết quả khả quan trong việc nhân nhanh chồi và kích thích tăng trưởng chồi cho dòng Q15.38 và Q16.427, với tỷ lệ chồi hữu hiệu lần lượt đạt 86,7% và 88,9%, hệ số nhân chồi đạt 6,7 và 5,4 lần, cùng chiều cao chồi đạt 2,67 cm và 2,73 cm Đối với dòng Q15.013, công thức tối ưu là 0,4 mg/l Kinetin, 0,7 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA.
Nghiên cứu cho thấy công thức dinh dưỡng tối ưu gồm 20 g/l đường sucrose, 10 g/l đường glucose và 6 g/l agar với pH 5,8 mang lại kết quả tốt nhất sau 3 tuần nuôi cấy, với tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 84,4%, hệ số nhân chồi đạt 3,7 lần và chiều cao chồi đạt 2,96 cm.
Trong giai đoạn nhân nhanh, các bình chồi nên được đặt dưới ánh sáng 1.000 lux trong suốt chu kỳ nuôi để đạt hiệu quả tối ưu cho sự phát triển chồi Kết quả cho thấy tỷ lệ chồi hữu hiệu cao từ 83,3 - 90% với chiều cao chồi đạt từ 2,75 - 2,86 cm sau 3 tuần nuôi cấy.
Môi trường ra rễ cho dòng Tràm năm gân bao gồm MS* + 1,5 mg/l NAA + 20 g/l đường sucrose + 10 g/l đường glucose + 6 g/l Agar, với pH = 5,8, đã đạt tỷ lệ chồi ra rễ 100% Số rễ mỗi chồi dao động từ 2,4 đến 3,8, và chiều dài rễ đạt từ 1,7 đến 2,2 cm sau 3 tuần nuôi cấy.
Giá thể gồm 30% trấu hun và 70% đất tầng B là lựa chọn lý tưởng cho việc nhân giống các dòng vô tính Tràm năm gân Tỷ lệ cây sống đạt trên 95%, với chiều cao cây từ 21,67 đến 25,49 cm, cho thấy cây phát triển khỏe mạnh và có chất lượng tốt sau 3 tháng trồng tại vườn ươm.
Các thí nghiệm về nồng độ chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến việc tạo chồi, nhân chồi và ra rễ còn hạn chế, do đó cần nghiên cứu thêm các công thức khác nhằm nâng cao tỉ lệ bật chồi, hệ số nhân, tỷ lệ ra rễ và số lượng rễ ở chồi Tràm năm gân Hiện tại, đề tài chưa có điều kiện để mở rộng nghiên cứu các dòng vô tính Tràm năm gân đã được công nhận.
Chưa có điều kiện để nghiên cứu thêm các công thức giá thể trồng cây con in vitro khác
Tiếp tục nghiên cứu tìm ra công thức phù hợp nhất để nâng cao hệ số nhân chồi, số lượng và chất lượng rễ cho loài Tràm năm gân
Nghiên cứu về các dòng vô tính Tràm năm gân hứa hẹn sẽ tiếp tục được mở rộng Các nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào giai đoạn vườn ươm, đặc biệt là trong việc cải thiện chế độ chăm sóc cây và khám phá các loại giá thể khác nhau.
1 Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học
2 Mai Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh và Trần Văn Minh (2013), Nhân giống cây
Tràm trà (Melaleuca alternifolia) nhập nội từ Úc bằng kỹ thuật nuôi cấy chồi đỉnh Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học Toàn quốc 2013
3 Phùng Thị Hằng, Nguyễn Bảo Toàn (2011), “Nhân giống cây Tràm (Melaleuca cajuputi powell) bằng phương pháp nuôi cấy mô”, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (2011:20b), tr 89-96
4 Đinh Thị Huyền (2006), Nghiên cứu nhân giống Vù Hương (Cinamomum balansae H.LEC) và Tràm trà (Melaleca alternifornia) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, Khoá luận tốt nghiệp, Trường Đại học lâm nghiệp
5 Lê Đình Khả (2009), Báo cáo tham quan khảo sát về trồng và chưng cất tinh dầu tràm tại Australia Viện Cải thiện giống và Phát triển lâm sản
6 Lê Đình Khả, Hà Thị Kim Thoa, Nguyễn Thị Thanh Hường, K Pinyopusarerk, (2011), Nghiên cứu chọn giống tràm trà có năng suất và chất lượng tinh dầu cao tại Ba Vì (Tạp chí Khoa học và Công nghệ Bộ
Nông nghiệp và Phát tiển nông thôn, ISSN-7020, Chuyên đề Giống cây trồng vật nuôi, Tập 1, tháng 6, trang 196-205)
7 Lê Đình Khả (2012), Nghiên cứu chọn giống, kỹ thuật gây trồng và chế biến tràm có năng suất và chất lượng tinh dầu cao Báo cáo tổng kết đề tài giai đoạn 1 (2008-2012)