DAI HOC HUE
TRUONG DAI HOC KHOA HOC KHOA SINH HOC
BAO CAO TONG KET
DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC SINH VIEN NAM 2019
Ten a tai: “BUOC DAU NGHIEN CUU
NHAN GIONG IN VITRO CAY HO TIEU
(Piper nigrum L.) GIONG SRILANKA”
Cán bộ cố vẫn khoa hoc : PGS TS TRUONG THỊ BÍCH PHƯỢNG Chủ nhiệm đề tài : LE THI TINH
TRAN VAN THAO TRAN NGOC PHUOC NGUYEN MINH THANH
Hué, 03/2019
Trang 2
LOI CAM DOAN
Chúng tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề tài này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các thong tin, tài liệu trích dẫn trong báo cáo đã được ghi rõ nguôn gôc
Trang 3
LOI CAM ON
Với lòng kinh trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin duoc bày tỏ lời cảm
_ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Bộ môn Sinh học Ứng dụng trường Đại học Khoa học - Đại học Huế đã tạo mọi điễu kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tôi trong quả trình học tập và hoàn thành đê tài
Đặc biệt, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS.Trương Thi
Bích Phượng đã trực tiếp hướng dân tận tình, theo sát chúng tôi trong suốt quá trình từ khi nhận thực hiện đề tài cho đến khi hoàn thành
Xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Đức Tuấn cùng các anh chị e1n ở phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học Ứng dụng đã quan tâm giúp đỡ
Cuối cùng, chúng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và các anh chị bạn
Trang 4MUC LUC
MO DAU uessscosssccsssccsneccenssccsscsssssessssccssvssssssosssesssesscsnesssssscssnesssnessanecsansesssesesses 1
1 Ly do chon dé tai mm 1
2 Muc tiéu nghién À0 000057 2
3 Đối tượng nghiên cứu -. - 2: +2++2t+2xt+xtertsrersrkrrkrrkrrrkerkerrereerkd 3
4 Phạm vi nghiên CỨU - 5< 4 S4 3 13 9191100110101 x4 3
5 Phương pháp nghiên CỨU . - «c2 22391999 9131438211412 3
6 Bố cục báo cáo -s++22xt kg HH HH0 re 3
Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU .-. °-c<- 5< se ss=ssessessee 4
1.1 Công nghệ nuôi cấy mô thực vật -. - + + ++x+erverxerrsererkd 4 L.1.1 Khai ni@m e — 4 1.1.2 Các giai đoạn nuôi cây mô tế bào thực vật -s-scscce- 4
1.1.3 Vai trò của môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô tế bào
100100101757 6
1.1.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cây mô tế bào 0500117077 7 1.1.5 Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cay mô tế bào thực vật 8
1.2 Giới thiệu chung về cây hỗ tiêu . - -55c5c+cccSzc+rterxerresrrervree 11
1.2.1 Ngudn gédc va phan b6 cccccsessecssessessesseesecseestecsecnecneenseneeneeessentens 12 1.2.2 Hinh thai hoc — 12
1.2.3 Sinh thái, sinh trưởng và phát triển -. - -s2c+ccsrxsrcxee 14
1.2.4 Công dụng của hồ tiêu -. + 2c>t+ztztrererrerrrkrrrrrrriee 14
1.2.5 Các phương pháp nhân giống hồ tiêu -5-55+©5<csres 15
1.2.6 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hỗ tiêu . -ccscccrrrreee 16
1.3 Tinh hinh nghién ciru nhan gidng in vitro cay hồ tiêu - 19
CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
Trang 52.2 Phuong phap nghién ctru seccesuscssuccsseessecessecssesesusessecssuecssisesseessesssseesseten 26
2.2.1 Điều kiện và môi trường nuôi cấy .- -s-csccxeczecrecrxee 26
2.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu ban GAU coecccececcscsesesscscsescccsesececececscseevevsceees 27 -2.2.3 Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi sec se cevszrsrsesesesee 28 2.2.4 Nghiên cứu khả năng tạo callus từ nguồn mẫu vật i7 vifro 28
2.2.5 Nghiên cứu khả năng tạo rễ của chỗi ir vifro -: 28
2.2.6 Xử lí số liệu thống kê ¿2-2 5zS++ctrEEEEEkEEEEkrrrrrrrrree 28 Chương 3: KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30
3.1 Giai đoạn tạo vật liệu ban đầu -¿ - s sec ckreevEreesrrxree 30
3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu -. - +2 30
3.1.2 Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi -55-5ss5csecxeee 35
3.2 Nghiên cứu khả năng nhân chồi -2- 2 s©xcxe+zecrxrrxerseee 43
3.2.1 Ảnh hưởng của BAP én kha nang nhan chéi in vitro cây hồ tiêu
trên môi trường \MMS - - HH HH HT TH kg 44
3.2.2 Ảnh hưởng của BAP kết hợp IBA lên khả năng nhân chỗi in vitro
cây hỗ tiêu trên môi trường MS -5-5++cxcrsktkrtkrrrrrrrrrerrieo 46
3.2.3 Ảnh hưởng của 2,5 mg/I BAP kết hợp 0,5 mg/1 IBA và than hoạt
tính lên khả năng nhân chồi in vitro cay hé tiêu trên môi trường MS 48 3.3 NUOi Cay ta0 CallUS cccceecescessesssssessessesseeseesessesscssssecsecsesseesessseneeseeseeneens 50 3.3.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và BAP đến khả năng tạo callus từ lá 51
3.3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và BAP đến khả năng tạo callus từ cuống lá 53 3.4 Ta na .Ốố.ỐốỐỐ.ố.ố.ố 55 3.4.1 Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ của chỗi in vitro trén méi trường MS cọ HH nh 00 000 00104 55 3.4.2 Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ của chỗi in vitro trén môi trường 1⁄2 ÌMS cọ HT nh H090 0 57
3.4.3 Ảnh hưởng của 0,3 mg/1 NAA kết hợp than hoạt tính lên khả năng
Trang 8DANH MUC BANG BIEU Bảng 3.1 | Hiệu quả khử trùng bằng HgC1; 0,1% đối với đoạn mắt 30 đôt
Bảng 3.2 | Hiệu quả khử trùng bằng HgC]; 0,1% kết hợp với NaOCl | 32
5% đối với đoạn mắt đốt
Bảng 3.3 | Hiệu quả khử trùng băng HgC]; 0,1% kết hợp với NaOCI | 34
5% đối với hạt tiêu chín
Bảng 3.4 | Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh chỗi của đoạn | 36 mắt đôt tự nhiên
Bảng 3.5 | Ảnh hưởng của Kin lên khả năng nảy chổi của hạt 38 Bảng 3.6 | Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nảy chỗi của hạt 40
Bảng 3.7 | Ảnh hưởng của TDZ lên khả năng nảy chồi của hạt 42
Bang 3.8 | Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chỗi cây hồ tiêu | 44 Bang 3.9 | Ảnh hưởng của BAP kết hợp 0,5 mg/1IBA lên khả năng | 46
nhân chồi cây hồ tiêu
Bảng 3.10 | Ảnh hưởng của 2,5 mg/1 BAP kết hợp 0,5 mg/IIBAvà | 48
than hoạt tính lên khả năng nhân chỗi cây hô tiêu
Trang 9DANH MUC HINH VE Hình 2.1 | Cây Hồ tiêu tự nhiên (Piper nigrum L.) giống Srilankal 26 ngoài tự nhiên
Hình 2.2 | Sơ đồ bố trí quy trình thí nghiệm 29
Hinh 3.1 | Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung| 31
dịch HgCl; 0,1% đến đoạn mắt đốt cây hô tiêu
Hình3.2 | Biểu đồ anh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung| 32
dịch HgCl; 0,1% kết hợp với NaOCIl 5% trong 5 phút
đến đoạn mắt đốt cây hỗ tiêu
Hình 3.3 | Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung| 34 dịch HgCl; 0,1% kết hợp với NaOCl 5% trong 5 phút đến hạt chín cây hồ tiêu Hình 3.4 | Chi tái sinh từ đoạn mắt đốt trên môi trường MS bé| 37 sung 1 mg/l BAP Hinh 3.5 | Chéi in vitro hinh thành từ hạt trên môi trường MS b6| 39 sung 1,5 mg/l Kin Hinh 3.6 | Chỗi in viro hình thành từ hạt trên môi trường MS bồi 41 sung 1,0 mg/l BAP Hình 3.7 | Chéi in vitro hinh thành từ hạt trên môi trường MS bổ| 43 sung 0,15 mg/l TDZ
Hinh 3.8 | Cum chổi in vi/o trên môi trường MS bổ sung BAP| 45
sau 8 tuần nuôi cấy
Hình 3.9 Ì Cụm chỗi in vio trên môi trường MS bồ sung tổ hợp| 47 BAP và 0,5 mg/1 IBA sau 8 tuần nuôi cây
Hình 3.10 | Cum chdi in vitro trén méi truong MS bé sung tô hợp 50 2,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA va than hoạt tính sau 8 tuần nuôi cây
Hình 3.11 | Callus hình thành từ lá hồ tiêu trên môi trường MS bổ|_ 52 sung 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4-D
Trang 10
cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka
Hinh 3.12 | Callus hinh thanh tir cuéng 14 hé tiéu trén mdi truéng| 54 MS b6 sung 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4-D Hình 3.13 | Rễ tạo thành trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l| 56 NAA Hình 3.14 | Rễ tạo thành trên môi trường 1⁄2 MS bổ sung 0,3 mg/l} 58 NAA
Hình 3.15 | Rễ tạo thành trên môi trường 1⁄2 MS bổ sung 0,3 mg/1| 60
NAA +0,1 g/1 than hoạt tính
Hình 3.16 | Sơ đồ kết quả quy trình bước đầu nhân giống iw viro| 61
Trang 11MO DAU
1 Ly do chon dé tai
Trong hơn 1000 loài thuộc chi Piper, hồ tiêu (Piper nigrum L.) là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao Hạt tiêu là một loại gia vị được yêu thích trên toàn thế giới và được mệnh danh là vua của các loại g1a vi, c6 vi nóng cay và mùi thơm vô cùng hấp dẫn nên trở thành nhu cầu không thể thiếu trong chế biến thực phẩm [38], [47] Ngoài ra, trong hạt tiêu còn chứa rất nhiều hợp chất quan trọng có thể được sử dụng trong y học, làm chất chống côn trùng, bọ ve và đặc biệt là chế biến nước hoa [28]
Hiện nay, ở nước ta ngoài những giống tiêu thông thường như tiêu Vĩnh
Linh, Phú Quốc, Di Linh thì tiêu Srilanka là giống mới được nhiều hộ trồng
tiêu lựa chọn Tiêu Srilanka có xuất xứ từ đảo quốc Srilanka được trồng nhiều ở khu vực phía Bắc Thái Lan đã du nhập vào Việt Nam và được trồng tại một số khu vực các tỉnh Tây Nguyên (Đăk Lăk, Đăk Nông, Gia Lai, Lâm Đồng ) và các tỉnh khác (Bình Phước, Bà Rịa Vũng Tàu ) cho năng suất rất cao
vượt trội hơn gấp khoảng hai lần so với các giống tiêu trong nước Tiêu Srilanka là giống tiêu có khả năng chống sâu bệnh tốt, sức đề kháng mạnh, bộ
rễ khỏe nên khả năng chống chịu với sự thay đổi thời tiết rất cao Đặc biệt năng suất từ 10 - 12 kg/trụ trong một năm, gấp khoảng 1,5 lần so với các giống tiêu thông thường [50] Tuy nhiên, hiện nay việc nhân giống tiêu tại Việt Nam băng các biện pháp nhân giống thông thường như nhân giống bằng hạt, giâm cành cho hệ số nhân thấp mà cây con không đồng nhất, và cho năng suất-không cao như cây mẹ nhập khâu Vì vậy đa phần giống tiêu Srilanka
được các hộ trồng tiêu sử dụng để trồng là giống nhập khẩu với giá tiền rất
cao từ 80.000 - 100.000 đồng/bầu vào năm 2017, hiện nay thì còn khoảng 30.000 - 50.000 đồng/bầu tại trung tâm cây giống vườn ươm Lafarm viện
Trang 12Trước thực trạng trên thì nuôi cây mô thực vật là một giải pháp đem lại hiệu quả thiết thực để nhân giống cây hồ tiêu Srilanka đáp ứng một số lượng giống lớn, nhanh chóng và sạch bệnh, ồn định di truyền cho thế hệ sau, đảm bảo _ chất lượng cây giống tốt, đồng đều như cây mẹ đã được chọn lọc [2], [14]
Trong những năm gần đây, hướng nghiên cứu nhân giống in vi#o cây hồ tiêu đã được rất nhiều nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới quan tâm: Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh phôi soma cây tiêu (Piper nigrum L.) (Bùi Thị Tường Thu và cs, 2007) [25], nghiên cứu sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy lát mỏng tế bào lá ở cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) (Dé Đăng Giáp và
cs, 2009) [6], nuôi cấy mô cây tiêu từ các bộ phận thân, lá và đỉnh chồi
(Hussain và cs, 2001) [35], nghiên cứu sự hình thành callus cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) (Dipali M Wankhade, 2014) [33], nuôi cây mô phân sinh để tái sinh nhanh cây tiêu đen (Piper nigrum L.) (Umadevi va cs, 2015) [48] Tuy nhiên, hiện nay chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào về nhân giống cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vifro cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giống Srilanka”
2 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung: Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân giống i vi/ro cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka
Mục tiêu cu thé:
- Xác định chất khử trùng ứng với nồng độ và thời gian xử lý thích hợp
cho tỷ lệ mẫu sống cao
- Xác định môi trường tối ưu cho tạo chồi in viro cây hồ tiêu (Piper
nigrum L.) giéng Srilanka
- X4ec dinh méi truéng téi uu cho nhan chdi in vitro cây hồ tiêu (Piper
Trang 13- Xác định môi trường tối ưu cho qua trinh tao callus tir mau in vitro cay ho tiéu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka
- Xác định môi trường tối ưu cho qua trinh tao ré in vio cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka
3 Đối tượng nghiên cứu
Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giống Srilanka thuộc:
+ Chi: Piper + Ho: Piperaceae + Bộ: Piperales 4 Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học Ứng dụng, khoa Sinh học, Đại học Khoa hoc Hué
Thời gian: Tháng 1/2018 đến tháng 12/2018
5 Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát thực nghiệm: Mẫu vật được cấy lên các môi trường đinh dưỡng
có bố sung các chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác nhau để thăm
do khả năng tạo chéi, tao cum chdi, tao callus, tao ré cia chi in vitro
Xử lý thống kê: Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và phan tich Duncan’s test bang phan mém SSPS 16.0 với mức xác suất có ý
nghĩa p < 0,05 6 Bồ cục báo cáo
Mở đầu
Nội dung
- Chương 1: Tổng quan tài liệu
- Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Kết luận và kiến nghị