Bài viết nghiên cứu khả năng loại bỏ mầm bệnh nội sinh trong mẫu cấy hồ tiêu bởi sử dụng một số chất kháng sinh, ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với đến sự hình thành chồi, tái sinh chồi, cây từ mô sẹo ở các đốt cấy cũng như sử dụng kỹ thuật Elisa để xác định giống sạch virut trong nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu.
27(3): 39-45 Tạp chí Sinh học 9-2005 Bớc đầu nghiên cứu nhân giống in vitro số giống Hồ tiêu (Piper nigrum L.) virut ĐOàN THị áI THUYềN, THáI XUÂN DU, Đỗ ĐĂNG GIáP Viện Sinh học nhiệt đới NGUYễN TĂNG TÔN Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam Trong năm gần đây, việc tăng diện tích trồng hồ tiêu ạt đ dẫn tới tình trạng hồ tiêu bị bệnh, có bệnh virut gây Kết điều tra tình hình bệnh virut hồ tiêu số tỉnh miền Đông Nam Bộ cho thấy có 42-93% vờn hồ tiêu có triệu chứng nhiễm virut biểu nh đốm hoa lá, nhăn phiến lá, xoăn mép lá, tóp ngọn, lùn dị dạng, [3, 6] Virut đợc phát mẫu hồ tiêu virut ToMV (tobacco mosaic virus), PVX (potato virus X), PVY (potato virus Y) vµ CMV (cucumber mosaic virus) [2, 3] Đ có số công trình nghiên cứu nhân giống hồ tiêu kháng bệnh Phytophthora kỹ thuật tái sinh chồi từ nuôi cấy rễ, đoạn thân, cuống mảnh Piper columbrinum L.; tái sinh từ phôi sôma, đỉnh sinh trởng Piper nigrum cv Karimunda, Panniyur-1; từ nuôi cấy mô sẹo Piper longum L [1, 4, 5, 7] nh−ng ch−a cã công trình nghiên cứu Việt Nam nhân giống hồ tiêu virut Nội dung báo nghiên cứu khả loại bỏ mầm bƯnh néi sinh mÉu cÊy hå tiªu bëi sư dụng số chất kháng sinh; ảnh hởng chất điều hòa sinh trởng thực vật đến hình thành chồi, tái sinh chồi, từ mô sẹo đốt cấy nh sử dụng kỹ thuật ELISA để xác định giống virut nhân giống in vitro số giống hồ tiêu (Piper nigrum L.) đợc trồng tỉnh miền Nam Việt Nam I PHƯƠNG PHáp nghiên cứu Các giống hồ tiêu đợc nghiên cứu giống đợc trồng phổ biến tỉnh miền Đông Nam Bộ Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cung cấp, gồm giống: Vinh Linh (Việt Nam); Lada Belangtoeng (Inđônêxia); Karimunda (ấn Độ) Cây hồ tiêu đợc trồng bầu đất vờn ơm Viện Sinh học nhiệt đới Sau 2-3 tuần, chồi non Cắt chồi có chiều dài từ 2-3cm cành có từ 5-6 đốt Các chồi đợc rửa sát trùng cồn 700 Mẫu cấy đợc khử trùng bề mặt dung dịch tẩy javel khoảng 30-40 phút 0,1% HgCl2-10 phút kết hợp với sử dụng chất kháng sinh 0,5% xêfotaxin từ 1-24 Các chồi non vô trùng đợc nuôi cấy môi trờng Murashige and Skoog, 1962 (MS) có bổ sung 6-benzylaminopurin-BA (0-5,0 mg/l), indole-3-butyric axit-IBA (0-1,0 mg/l) hc thidiazuron-TDZ (0-0,22 mg/l) để tạo chồi Để nghiên cứu tái sinh chåi tõ m« sĐo, chóng t«i bỉ sung BA (0-10 mg/l), IBA (0,5 mg/l) vµ kinetin (0,5 mg/l) vµo môi trờng nuôi cấy Đối với môi trờng tạo rễ, sử dụng chồi lớn dài 3-4cm có từ 2-3 cặp cấy môi trờng MS có khoáng đa lợng giảm nửa bổ sung axit-1-napthalen axêtic NAA (0,2-0,5 mg/l) than hoạt tính Tất mẫu cấy đợc đặt điều kiện phòng nuôi cấy nhiệt độ 27oC-29oC, cờng độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng: 12-14 giờ/ngày Để kiểm tra mẫu virut, giống hồ tiêu đợc giám định kỹ thuật ELISA trớc sau nuôi cấy in vitro loại virut ToMV, PVX, PVY CMV 39 ii kết thảo luận Sử dụng chất kháng sinh trình khử trùng mẫu cấy Hồ tiêu lâu năm, có nhiều mầm bệnh nội sinh nh nấm, khuẩn nằm bên mô Bởi vậy, vấn đề quan trọng cần giải nuôi cấy in vitro hồ tiêu phải loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh nội sinh Các phơng pháp khử trùng bề mặt thông thờng không thành công việc khử trùng hồ tiêu Nguyên liệu ban đầu chồi hình thành giống đợc trồng cách ly nhµ l−íi vµ phun thc trõ nÊm bƯnh, ® qua kiĨm tra virut Qua thùc nghiƯm cho thÊy mẫu qua xử lý sử dụng chất có khả diệt mầm bệnh bề mặt cao nh− 0,1-1%HgCl2 (tõ 5-10 phót), mÉu cÊy vÉn bÞ nhiễm trở lại sau thời gian nuôi cấy Do ®ã, nÕu chØ sư dơng c¸c chÊt khư trïng bỊ mặt nh nớc tẩy javel HgCl2, không cho kết khả quan; toàn mẫu bị nhiễm sau thời gian dài nuôi cấy Để mẫu đợc vô trùng hoàn toàn, đ kết hợp sử dụng số chất kháng sinh nh: penixillin, streptomyxin xêfotaxin Trong đó, xêfotaxin vừa có tác dụng diệt khuẩn, nấm bên vừa diệt đợc mầm bệnh néi sinh mÉu cÊy C¸c b−íc khư trïng mÉu cấy lần lợt đợc thực nh sau: mẫu sau sát trùng cồn 70%, đợc xử lý nớc tẩy javel (10%)-15 phút Sau ngâm dung dịch 0,1% HgCl210 phút Bớc lắc dung dịch 0,5% xêfotaxin máy lắc từ 1-24 Sau bớc, mẫu đợc rửa lần nớc cất vô trùng Tuy nhiên, mẫu đ qua khử trùng sau 2045 ngày bị tái nhiễm trở lại vị trí tiếp xúc với môi trờng nuôi cấy mầm bệnh nội sinh mẫu Để làm giảm tái nhiễm khuẩn mẫu cấy, bổ sung 0,5% xêfotaxin môi trờng nuôi cấy ban đầu Sau đó, cấy truyền mẫu qua môi trờng chất kháng sinh để tạo chồi Nh vậy, mẫu chồi non phát sinh từ mẫu vô trùng khả tái nhiễm trở lại Với phơng pháp khử trùng mẫu trên, chúng 40 nhận đợc 25-30% số mẫu hoàn toàn mầm bệnh nội sinh ảnh hởng vị trí đốt cấy chất điều hoà sinh trởng thực vật (ĐHSTTV) lên khả hình thành chồi hồ tiêu Sau đợc vô trùng 20 ngày, đốt hồ tiêu bắt đầu đâm chồi Chồi dài 5-6cm đợc cắt thành đốt dài khoảng 2cm Mỗi đốt mang cặp đợc cấy môi trờng MS có bổ sung chất ĐHSTTV khác Sau 3-4 tuần nuôi cấy, từ nách xuất chồi Qua theo dõi ảnh hởng vị trí đốt cấy lên khả hình thành chồi, nhận thấy có khác biệt rõ rệt khả loại đốt đốt ngọn, hầu nh không xuất chồi mới, nồng độ BA cao (5 mg/l) Đốt đốt gốc dễ dàng tạo chồi hơn, số chồi hình thành tới 4-6 chồi/đốt (bảng 1) Trong đó, tạo chồi đốt gốc nhiều so với đốt đốt Khi nghiên cứu ảnh hởng tổ hợp chất ĐHSTTV, nhận thấy, môi trờng bổ sung BA, khả tạo chồi thấp tất đốt cÊy ThËm chÝ víi nång ®é BA cao (> mg/l) TDZ nồng độ 0,02-0,22 mg/l, chồi hình thành so với công thức có bổ sung NAA IBA Không phải nồng độ xytokinin auxin cao định tạo chồi mẫu cấy mà tỷ lệ thích hợp xytokinin/auxin làm tăng khả tạo chồi hồ tiêu Trong thí nghiệm, nhận thấy nồng độ BA = mg/l, IBA = 0,5 mg/l số chồi đợc hình thành đốt đốt gốc cao Điều chứng tỏ, bổ sung lợng xytokinin auxin thích hợp, làm tăng rõ rệt số chồi hình thành đốt cấy Khi bổ sung thêm NAA IBA môi trờng tạo chồi với nồng độ 0,5-1,0 mg/l làm tăng khả hình thành mô sẹo gốc cấy nồng độ auxin (NAA, IBA) cao ( 1,0 mg/l), mô sẹo nhiều ức chế hình thành chồi mẫu cấy (bảng 1) Tuy nhiên, nhận thấy có khác biệt tính chất mô sẹo hình thành từ hai loại auxin này, mô sẹo hình thành từ môi trờng có IBA có màu vàng nhạt, cứng dễ phát sinh chồi bất định so với mô sẹo đợc hình thành môi trờng bổ sung NAA có màu trắng, xốp Bảng Khả tạo chồi từ đốt cấy nghiệm thức Số lợng chồi mức độ mô sẹo hình thành Xytokinin (mg/l) Auxin (mg/l) BA 2,0 TDZ (mg/l) Đốt Đốt §èt gèc Chåi M« sĐo Chåi M« sĐo Chåi M« sÑo IBA - 1-2 - - 2,0 0,5 1-2 - 4-5 + 5-6 ++ 2,0 1,0 - + 2-3 +++ 5,0 - - - 5,0 0,5 + + + 5,0 1,0 + - - +++ NAA 2,0 0,25 + + + 2,0 0,5 ++ 1-2 ++ 0-1 ++ 2,0 0,1 ++ +++ +++ 0,02 - 1-2 - 2-3 - 0,20 - 2-3 - 3-4 - Ghi chó: Mức độ hình thành mô sẹo: -: không hình thành; +: ít; ++: trung bình; +++: nhiều ảnh hởng chất ĐHSTTV lên khả biệt hoá chồi từ mô sẹo hoàn chỉnh (bảng 2) Các mô sẹo hình thành từ nuôi cấy đốt thân đợc dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu khả biệt hoá chồi từ mô sẹo hồ tiêu Trong thực nghiệm tạo rễ cho hồ tiêu, sư dơng m«i tr−êng 1/2 MS cã bỉ sung NAA (0,1-1,0 mg/l) IBA (0,5-1,0 mg/l) thí nghiệm có bổ sung NAA, sau 15 ngày nuôi cấy cho thấy: môi trờng có nồng độ NAA thấp (0,1-0,2 mg/l) rễ hình thành khoảng 2-3 rễ/chồi; với nồng độ NAA cao (0,5-1,0 mg/l) số rễ hình thành rÊt nhiỊu, tõ 10-15 rƠ/chåi, nhiªn rƠ th−êng rÊt ngắn, phát triển dới gốc chồi hình thành khối mô sẹo Nồng độ NAA cao, khối mô sẹo nhiều gây ức chế phát triển rễ Đối với môi trờng có IBA, tạo rễ xảy ra, số lợng rễ nhng rễ phát triển mạnh so với môi trờng có NAA Tuy nhiên, Philip V P et al (1992) đ sử dụng môi trờng 1/2 MS có chứa nồng độ NAA cao (1 mg/l) để tạo rễ gièng hå tiªu Panniyur-1, Karimunda Nh− vËy, sù rƠ hồ tiêu in Qua thí nghiệm biệt hoá chồi từ mô sẹo, nhận thấy tính chất mô sẹo có phản ứng khác chất ĐHSTTV hồ tiêu Môi trờng MS cã bæ sung BA (5 mg/l), Kin (0,5 mg/l) IBA (0,5 mg/l) thích hợp cho khả biệt hoá chồi từ mô sẹo tổ hợp môi trờng này, tỷ lệ mô sẹo tạo chồi số chồi mẫu cấy lớn (10,3 chồi/mẫu) Môi trờng với nồng độ BA cao (>5 mg/l) bổ sung TDZ gây ức chế khả biệt hoá chồi từ mô sẹo; số chồi đợc hình thành nhng tỷ lệ chồi bị dị dạng lớn chồi phát triển cấy truyền qua môi trờng tạo Tạo rễ 41 vitro thích hợp m«i tr−êng 1/2MS cã bỉ sung NAA (0,1-0,2 mg/l) Kiểm tra giống hồ tiêu virut kỹ thuật ELISA Để xác định giống hồ tiêu hoàn toàn virut, đ tiến hành lấy mẫu kiểm tra kỹ thuật ELISA giai đoạn: trớc đa vào nuôi cấy, giai đoạn nhân chồi in vitro sau đa vờn ơm Kết xác định giống virut đợc trình bày bảng Bảng Khả biệt hoá chồi từ mô sẹo hồ tiêu nghiệm thøc Xytokinin Auxin TDZ (mg/l) (mg/l) (mg/l) % mÉu t¹o chåi Sè chåi/mÉu NhËn xÐt BA Kin IBA 0 2,0 0,5 0,5 56,3 3,6 3,0 0,5 0,5 100 9,7 - Tạo nhiều chồi từ mô sẹo - Chồi phát triển hoàn chỉnh, chồi lớn môi trờng khác - Tái tạo chồi nhiều từ mẫu mô sẹo lần cấy truyền 5,0 0,5 0,5 100 10,3 - Mô sẹo bị hoá nâu chết - Mô sẹo tạo nhiều chồi mới, chồi phát triển thành chồi hoàn chỉnh nhiều - Khả tạo chồi lần cấy truyền cđa mÉu m« sĐo cao 10,0 0,5 0,5 5,7 0,8 - Mô sẹo bị hoá nâu chết nhiều - Có thể tạo chồi nhng khả phát triĨn thµnh chåi hoµn chØnh rÊt thÊp 0,5 47,1 2,0 - Tạo chồi yếu - Mô sẹo bị hoá nâu chết 1,0 48,3 2,6 - Chồi bị dị dạng thân 1,5 52,2 1,5 - Tạo chồi từ mô sẹo, nhng không phát triển thành chåi hoµn chØnh III KÕT LN Sư dơng chÊt kháng sinh xêfotaxin (0,5%) kết hợp với phơng pháp khử trùng bề mặt, loại bỏ đợc nguồn 42 - Không hình thành chồi từ mô sẹo, mẫu cấy hoá nâu chết - Nhiều mô sẹo bị hoá nâu, khả biệt hoá chồi - Một số mẫu tạo thể chồi, nhng không phát triển đợc thành chồi hoàn chỉnh lây nhiễm bên mà có tác dụng diệt đợc mầm bệnh nội sinh bên mẫu hồ tiêu M«i tr−êng MS cã bỉ sung BA = 2,0 mg/l, IBA = 0,5 mg/l thích hợp cho trình tạo chồi từ đốt hồ tiêu, khả tạo chồi đốt gần gèc cµng cao Sư dơng kü tht ELISA lµ cần thiết để xác định giống virut quy trình nhân giống in vitro hồ tiêu Khả hình thành chồi từ mô sẹo tốt m«i tr−êng MS cã BA = 5,0 mg/l, IBA = 0,5 mg/l Kin = 0,5 mg/l Cây hồ tiêu dễ dàng tạo rễ môi trờng 1/2 MS cã bỉ sung NAA ë nång ®é thÊp (0,1-0,2 mg/l) Bảng Xác định giống virut PVX, PVY, CMV, ToMV b»ng kü thuËt ELISA Tªn gièng PVX PVY CMV ToMV OD KL OD KL OD KL OD KL Tr−íc nuôi cấy Vĩnh linh Lada Tiêu gốc ghép 0,160 0,146 0,151 - 0,304 0,297 0,291 - 0,364 0,329 0,281 - 0,145 0,153 0,130 - Chåi c©y in vitro VÜnh linh Lada Karimunda Tiªu gèc ghÐp 0,143 0,114 0,144 0,146 - 0,296 0,301 0,337 0,246 - 0,240 0,251 0,241 0,285 - 0,121 0,121 0,145 0,139 - Cây tháng tuổi vờn ơm Vĩnh linh Lada Karimunda Tiêu gốc ghÐp 0,152 0,161 0,152 0,148 - 0,339 0,359 0,321 0,297 - 0,299 0,337 0,350 0,237 0,143 0,140 0,145 0,135 - §èi chøng 1,200 + 1,706 + 0,539 + 0,566 + Ghi chó: OD: trÞ sè OD; KL: kÕt ln; -: virut; + : có virut TàI liệu tham kh¶o Bhat S., Chandel K P S., Malik S K., 1995: Plant Cell Rep., 14: 398-402 Bysov A S., 2001: Virus and viral diseases of black pepper (Piper nigrum L.) in condition of closed ground and tropical, subtropical agrocenoses The theasis for obtaining PhD degree Kyiv National Univercity, Kyiv Đoàn T A T, Thái X D cs., 1999-2000: Bớc đầu nghiên cứu chuần đoán bệnh virus Hồ tiêu (Piper nigrum L.) số tỉnh miền Đông Nam Bộ Tuyển tập Công trình nghiên cứu KHCN., 189-195 Joseph B., Joseph D., 1996: Plant Cell Tiss Org., 41(1): 87-90 Kellar S M., Krishnamurthy K., 1998: Plant Cell Rep., 17(9): 721-725 Nguyen T T., Boico A L et al., 2001: Virus and viral disease of black Ppepper (Piper nigrum L.) in South East of Viet Nam III Intenational Conference “Bioresoeuri and Viruses”, Kyiv, Ucraina Philip V P et al., 1992: Plant Cell Rep., 12: 41-44 43 Hình Nhân giống in vitro hồ tiêu (Piper nigrum L.) virút Nuôi cấy đỉnh sinh trởng; Biệt hoá chồi từ mô sẹo; Tạo cụm chồi từ đốt thân; Cây hoàn chØnh cÊy tõ cơm chåi; C©y in vitro sau tuần vờn ơm 44 PRELIMINARY STUDY on the MICROPROPAGATION IN VITRO OF BLACK PEPPER (Piper nigrum L.) doan thi thuyen, thai xuan du, dang giap, nguyen tang ton SUmmary The plant regeneration from the single node or the callus culture of black pepper (Piper nigrum L.) was described Various combinations of media, growth regulators and explant sterization were compared Problems, probably caused by endogenous pathogens associated with tissue exudated, often occurred during the establishment of culture The method to sterilize the black pepper plants using antibiotic agent such as cefotaxin was described For the shoot initiation and the establishment, the optimal concentration of black pepper growth was BA 2mg/l, IBA 0.5 mg/l The high concentrations of BA (5-10 mg/l) had no effect on the shoot regeneration from callus and the development of lateral branches The MS medium containing BA 5.0 mg/l, Kin 0.5 mg/l and IBA 0.5 mg/l was the best medium for the subsequent growth and the shoot regeneration from callus under the current condition Shoots were rooted on 1/2 MS medium containing NAA 0.1-0.2 mg/l In vitro plants were then transferred to pots in the nursery house After 8-10 weeks, the plants with height of 20-25 cm were transferred to field for testing Ngµy nhËn bµi: 20-10-2004 45 ... cho trình tạo chồi từ đốt hồ tiêu, khả tạo chồi đốt gần gốc cao Sử dụng kỹ thuật ELISA cần thiết để xác định giống virut quy trình nhân giống in vitro hồ tiêu Khả hình thành chồi từ mô sẹo tốt... vitro hồ tiêu (Piper nigrum L.) virút Nuôi cấy đỉnh sinh trởng; Biệt hoá chồi từ mô sẹo; Tạo cụm chồi từ đốt thân; Cây hoàn chỉnh cấy từ cụm chồi; Cây in vitro sau tuần vờn ơm 44 PRELIMINARY... số mẫu hoàn toàn mầm bệnh nội sinh ảnh hởng vị trí đốt cấy chất điều hoà sinh trởng thực vật (ĐHSTTV) lên khả hình thành chồi hồ tiêu Sau đợc vô trùng 20 ngày, đốt hồ tiêu bắt đầu đâm chồi Chồi