Cây chanh dây có rất nhiều giá trị, là đối tượng khá dễ trồng nhưng lại khó nuôi cấy mô. Mặc dù có khá nhiều nghiên cứu nuôi cấy in vitro loài này nhưng chủ yếu dùng môi trường cơ bản MS. Tuy nhiên, sau khi thí nghiệm thực tế và tìm hiểu nhiều tài liệu về môi trường này nhận thấy nó chưa thực sự phù hợp với nuôi cấy mô cây chanh dây. Do đó tôi quyết định thay đổi sang môi trường WPM và thấy kết quả khá khả quan, hy vọng sẽ có thêm các nghiên cứu khác về môi trường WPM đối với cây chanh dây.
Trang 1LỜI MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, người tiêu dùng đang có xu hướng chuyển từ nước ngọt có ga sang sử dụng các loại nước trái cây tự nhiên nên nhu cầu về nguồn nguyên liệu trái cây ngày càng tăng Trong số đó, nước ép chanh dây được rất nhiều người
ưa chuộng bởi vị chua ngọt dễ chịu và hương thơm lạ Hiện nay, chanh dây không chỉ được biết đến với vai trò là nước giải khát mà còn có nhiều giá trị cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa mĩ phẩm và hoa của nó cũng rất đẹp với mục đích trồng làm cảnh Đây được xem là loại cây trồng cho thu nhập cao, ổn định lại còn có thể trồng xen nhiều cây trồng có giá trị khác nên diện tích và nhu cầu về cây giống tăng nhanh
Cây chanh dây có thể trồng bằng hạt, giâm hom hoặc nuôi cấy mô Trồng bằng hạt là phương pháp phổ biến, dễ dàng, có thể được thực hiện được bởi cả những người nông dân thiếu kinh nghiệm nhưng tốn nhiều thời gian, cây giống không đồng nhất, không giữ được đặc tính của cây mẹ và lâu ra quả, còn giâm hom có ưu điểm là thời gian nhân giống được rút ngắn, ra quả sớm nhưng khó tạo được nguồn giống sạch bệnh, khó thu được nguồn giống tốt vì số hom thu được từ một cây có hạn Do đó, phương pháp nuôi cấy mô bằng những kĩ thuật nhất định có thể khắc phục được các nhược điểm trên và tạo ra được số lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng đều, giữ được các đặc tính tốt của cây mẹ, giảm giá thành so với giống nhập khẩu phù hợp hơn với
túi tiền của người nông dân Đó cũng là lý do chúng tôi tiến hành đề tài “ Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims.)” với
mục tiêu nhằm nghiên cứu nhân giống in vitro cây chanh dây với hệ số nhân chồi cao,
tạo tiền đề cho các nghiên cứu sau này đặc biệt là tạo giống sạch bệnh
Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát nồng độ Javel và kích thước mẫu lên hiệu quả khử trùng các mẫu chồi chanh dây
Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo từ
lá và đoạn thân non của cây chanh dây
Khảo sát ảnh hưởng của loại môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên khả năng phát sinh chồi của mẫu chồi chanh dây
Trang 21.1 Đặc điểm sinh học của cây chanh dây
1.1.1 Vị trí phân loại
Chanh dây tím có nguồn gốc từ Brazil, được gọi với nhiều tên khác nhau như Passion fruit, chanh dây, mác mác, lạc tiên, trái mê ly Là một trong những loại trái cây có tiềm năng lớn cho ngành công nghiệp nước giải khát rất được ưa chuộng ở trong nước và trên thế giới (Phạm Quang Vũ 2008)
Giới : Plantae
Bộ : Malpighiales
Họ : Passifloraceae
Chi : Passiflora
Loài : P edulis
Tên khoa học: Passiflora edulis Sims
1.1.2 Đặc điểm sinh học
a Đặc điểm hình thái
Passiflora edulis Sims hay còn gọi là chanh dây tím là một loại cây dây leo
thân gỗ lâu năm, nó có thể dài 15 – 20 m Lá có dạng ba thùy, màu xanh, dài khoảng
10 – 18 cm có các răng cưa bao viền ngoài, phía trên mặt lá bóng láng, ở dưới thì có màu xanh xám và mờ hơn, cuống có màu đỏ hơi vàng Hoa đơn, có mùi thơm, đường kính khoảng 4,5 cm có màu trắng ngà và ở giữa thì có màu xanh tím Hạt có dạng bẹt (một đầu nhọn và một đầu tròn), màu đen, kích thước khá nhỏ Bề mặt hạt hơi rỗ nhưng có độ bóng nhất định Quả chín có màu đỏ tía, trái dạng hình tròn hay hình bầu dục như quả trứng, dài 5 – 8 cm, nặng 50 – 80 g (Phạm Quang Vũ 2008)
b Đặc điểm sinh thái
Hầu hết giống chanh dây tím trồng ở nước ta đều nhập từ Đài Loan Loại cây này rất thích ánh nắng mặt trời, thích ứng với các vùng có khí hậu mát mẻ, nhiệt độ trung bình 18 – 200C, độ cao trung bình 800 – 1000 m, có khả năng ra hoa và đậu quả quanh năm, cho năng suất rất cao và ổn định Cây cho thu hoạch từ 3 – 5 năm tùy khoảng cách trồng và điều kiện chăm sóc
Cây mọc được trên nhiều loại đất trừ đất sét hoặc đất cát, độ mùn trên 1% và
pH 5,5 – 6 là thích hợp nhất (Phạm Quang Vũ 2008)
1.1.3 Bệnh trên cây chanh dây
Có ba nguồn gây bệnh chính trên cây chanh dây là do virus, vi khuẩn và nấm Tuy nhiên gây thiệt hại lớn nhất là hai loại bệnh do virus sau: bệnh cứng trái (do virus PWV) và bệnh quăn lá (do virus PLCV) Khi bị nhiễm hai bệnh này cây chanh dây
Hình 1.1 Chanh dây
Trang 3bị giảm năng suất nghiêm trọng, khả năng tạo chồi và vươn đọt kém, ra hoa ít, trái nhỏ và bị biến dạng, nếu nặng có thể dẫn đến chết cây Đặc biệt bệnh lây truyền rất nhanh qua côn trùng chích hút, dụng cụ làm vườn lại không thể trị bệnh nên nếu vườn nào đã nhiễm thì khả năng mất trắng là rất cao, thậm chí còn lây lan toàn bộ khu vực trồng chanh dây gần đó (Rheinländer 2010)
1.1.4 Ứng dụng của chanh dây
Chanh dây chủ yếu được dùng để sản xuất nước trái cây, dùng làm nước giải khát hàng ngày hay nước đóng chai Nước chanh dây có tác dụng bổ, mát, thanh nhiệt, tiêu khát, an thần, nhuận tràng, lợi tiểu, có hương vị đặc biệt nên rất được ưa chuộng Chanh dây còn được dùng khi làm bánh, kẹo, mứt, kem, nước xốt Ngoài ra, rễ và lá chanh dây có khả năng trị chứng mất ngủ, lá có thể dùng trong điều trị bệnh đau bao
tử, bệnh cao huyết áp, suy nhược thần kinh (Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ 2010)
1.1.5 Các phương pháp nhân giống chanh dây truyền thống
a Nhân giống từ hạt
Hạt chanh dây tươi được gieo vào đất và để trong bóng râm, tưới nước duy trì
độ ẩm hàng ngày để hạt mọc mầm Khi cây con ra lá đem cấy vào bịch hay vỉ ươm, cây cao 20 – 40 cm có thể đem trồng ngoài vườn (Phạm Quang Vũ 2008)
Ưu điểm: Kĩ thuật đơn giản, dễ làm; hệ số nhân giống cao; tuổi thọ cao; cây trồng bằng hạt thường có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh; bộ rễ phát triển tốt
Nhược điểm: Hạt giống nảy mầm chậm và thất thường, có thể mất từ nhiều tháng đến 2 năm (Flavia Guzzo và cộng sự, 2004); khó giữ được những đặc tính của cây mẹ; ra hoa kết quả muộn (Đoàn Thị Phương Thảo 2010)
b Nhân giống bằng giâm hom
Lựa chọn các cành giâm là cành bánh tẻ khỏe, không bị sâu bệnh hại, có đủ ánh sáng, cành không mang hoa quả, vừa ổn định sinh trưởng chưa lâu Địa điểm giâm cành nên thông thoáng nhưng kín gió Ta nên cắt cành vào lúc trời không có nắng (sáng sớm hoặc chiều tối) Các đoạn thân chứa ít nhất 3 đốt, cắt bỏ các lá phía dưới và cắm vào giá thể ra rễ, cần duy trì độ ẩm thường xuyên Đến khi cây có đủ rễ
và chồi tương đối cao (15 – 20 cm) thì có thể đem trồng ngoài vườn (Phạm Quang
Vũ 2008)
Ưu điểm: Giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ; ra hoa kết quả sớm; thời gian nhân giống nhanh
Nhược điểm: Nhân giống bằng giâm cành liên tục qua nhiều thế hệ dễ dẫn đến hiện tượng thoái hóa; cây chanh dây không chống chịu tốt với sâu bệnh, nhất là tuyến
Trang 4trùng và bệnh về rễ do nấm (Phytophthora, Fursarium); có thể lây lan mầm bệnh
qua các thế hệ (Đoàn Thị Phương Thảo 2010)
c Cây chanh dây ghép
Cây chanh dây vàng:
Ưu điểm: Sinh trưởng nhanh, dễ gây giống, ít mọc mầm phụ ở gốc cây con, khả năng chịu hạn và chống chịu sâu bệnh tốt
Nhược điểm: Là loài có hoa lưỡng tính nhưng thụ phấn chéo, phải nhờ ong thụ phấn hoặc thụ phấn nhân tạo bổ sung, ra hoa theo mùa nên năng suất không ổn định Trái to nhưng vỏ dày, ít cơm và chua gắt, đồng thời hàm lượng dinh dưỡng thấp, không thơm bằng cây tím
Cây chanh dây tím:
Ưu điểm: Là loài có hoa lưỡng tính, tự thụ phấn được, ra hoa quả nhiều, quanh năm nên năng suất cao và ổn định Giống chanh tím hiện nay có trái to, vỏ mỏng, nhiều nước, có mùi thơm nồng (mùi thơm đặc biệt như kết hợp của nhiều loại trái cây
mà ta không thể tổng hợp nhân tạo), vị chua nhẹ, có hàm lượng dinh dưỡng cao Khi trồng nhanh ra trái hơn cây chanh vàng
Nhược điểm: Khó gây giống hơn cây vàng, khả năng chịu hạn và chống chịu sâu bệnh kém đặc biệt là các bệnh về rễ
Cây chanh dây ghép:
Từ những đặc điểm trên của từng cây, hiện nay hầu hết các giống chanh trên thị trường đều là chanh dây ghép Gốc ghép là cây chanh dây vàng (gieo từ hạt) còn chồi ghép là cây chanh dây tím Tác động của gốc ghép chanh dây vàng còn làm cho màu sắc trái chanh tím đẹp hơn, kích cỡ trái to hơn, làm tăng giá trị thương phẩm Tuy nhiên rất khó để chọn được các cây chanh tím sạch bệnh, năng suất ưu việt với
số lượng lớn
Hiện nay phương pháp nhân giống in vitro cũng đang rất được quan tâm nhằm
tạo ra nguồn giống sạch bệnh, chất lượng cao (Đoàn Thị Phương Thảo 2010; Phạm Quang Vũ 2008)
1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực vật Dựa trên tính toàn năng của tế bào và khả năng phân hóa, phản phân hóa của chúng
mà người ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay một mẫu mô nào đó Quá trình này bao gồm các bước:
Trang 5Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: các cây này cần phải sạch bệnh, đặc
biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh
Bước 1: Nuôi cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng (thường bằng hóa chất)
đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro
Bước 2: Nhân nhanh: chuyển mẫu vào môi trường có hàm lượng Cytokinin
cao hơn để tái sinh thật nhiều chồi
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: tách các chồi riêng ra và cấy vào môi
trường tạo rễ có hàm lượng Auxin cao hơn
Bước 4: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên (Phan Xuân Huyên
2016; Bùi Thị Ngọc Tuyến 2011, trích dẫn trong Nguyễn Quang Thạch và cộng sự 2009)
1.2.2 Kĩ thuật nhân giống in vitro và một số vấn đề liên quan
a Nuôi cấy tạo chồi bất định
Đỉnh chồi bất định mới có thể phát tiển trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp
từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật (đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, nhánh củ,…)
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển Các thể phân sinh này có nguồn gốc từ các tế bào đơn, tuy nhiên chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormon (Lê Văn Hoàng 2008)
b Nuôi cấy thông qua giai đoạn tạo mô sẹo
Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh Hai điều kiện căn bản cho sự tạo
mô sẹo là cây non và phần non cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi
cấy in vitro, dưới tác dụng của auxin (2,4 – D; NAA, ) được áp dụng riêng rẽ hay
phối hợp với cytokinin (Nguyễn Thị Quý Cơ và cộng sự 2014)
Tế bào mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền nên người ta thường sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây (Trịnh Thị Lan Anh 2015)
c Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vô mẫu
Tình trạng của cây mẹ: Nên chọn các cây được chăm sóc tốt, đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh, không có triệu chứng sâu bệnh
Thời gian lấy mẫu: Các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ dài ngày, tình trạng nước trong cây,… ảnh hưởng rất nhiều đến hàm lượng carbohydrate, protein dự trữ
và các chất điều hòa sinh trưởng trong mô cây Tùy thuộc cây mẹ được trồng tự nhiên
Trang 6ngoài đồng hay được chăm sóc trong nhà kính mà có thể lấy mẫu nuôi cấy theo mùa hoặc lấy mẫu quanh năm
Phẩm chất mẫu cấy: Cần lưu ý một số đặc tính sau:
- Các vị trí thực vật ở trên mặt đất sẽ sạch hơn các các vị trí dưới đất
- Mẫu càng nhỏ càng ít nhiễm nhưng sẽ giảm mức độ sống sót sau khi khử trùng
- Mô bên trong ít nhiễm hơn mô bên ngoài
Tuổi của mẫu cấy: Vị trí cành ở phía dưới thường non hơn vị trí cành ở phía trên, mẫu cấy còn non thường có khả năng tái sinh cao hơn các mẫu già
Sự vô trùng: Nuôi cấy mô là một kĩ thuật nuôi cấy cần điều kiện vô trùng, khi khử trùng mẫu cấy cần lưu ý:
- Hóa chất khử trùng: Không độc với mẫu và người thao tác, có hiệu quả loại các vi sinh vật trong phạm vi rộng
- Nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng: Nếu nồng độ quá cao, thời gian khử trùng dài mẫu có thể bị tổn thương và chết Còn nếu nồng độ quá thấp, thời gian khử trùng quá ngắn thì không diệt được vi sinh vật (Nguyễn Bảo Toàn 2004)
1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan trên cây chanh dây
Nghiên cứu tạo mô sẹo: Năm 2014, Carvalho và cộng sự đã nghiên cứu sự
cảm ứng tạo mô sẹo từ lá của cây Passiflora gibertii NE Brown trong môi trường ½
MS bổ sung 2 mg/l BA + 5% nước dừa nuôi cấy trong 30 ngày Nghiên cứu đã cho thấy các mẫu để ở trong tối và ngoài ánh sáng đều có khả năng tạo mô sẹo nhưng các mẫu để trong tối mới có khả năng bật chồi Năm 2016, Jardim Rosa và cộng sự đã
nuôi cấy rễ của cây Passiflora suberosa L 15 ngày tuổi Sau 35 ngày mô sẹo được
hình thành khi nuôi cấy trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA Ożarowski
(2011) cũng nuôi cấy tạo mô sẹo từ các lát lá mỏng cây Passiflora edulis Sims trên
môi trường MS + 16 mg/l 2,4 – D + 1 mg/l BA, ủ trong tối, mô sẹo được hình thành sau 30 ngày Như vậy, cả 3 nghiên cứu trên đều sử dụng môi trường MS hoặc ½ MS
bổ sung BA, NAA và 2,4 – D (để trong tối, nguồn mẫu là rễ và lá) nhưng thời gian
để tạo mô sẹo khá dài (30 – 35 ngày) do đó cần nghiên cứu thêm các môi trường khác, đồng thời khảo sát khả năng tạo mô sẹo trên các bộ phận khác của cây nhằm tạo được
mô sẹo tốt, rút ngắn thời gian
Nghiên cứu bật chồi: Năm 2010, Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ đã tạo được cụm chồi cây Passiflora edulis Sims từ đoạn thân mang chồi nách (có nguồn gốc cây in vitro) trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA nhưng lượng chồi thu được ít
(3,95 chồi/mẫu) Năm 2014, Junghans và cộng sự đã tiến hành tách các chồi ngọn cây
Passiflora edulis Sims 1 năm tuổi với kích thước khác nhau (1; 0,5 và 0,25 cm) nuôi
cấy trên môi trường MS + 1 mg/l BA Sau 60 ngày nuôi cấy, các mẫu không tạo thêm
Trang 7chồi mà chỉ cao thêm một chút so với mẫu ban đầu (lần lượt là 1,5; 0,86 và 0,52 cm)
Năm 2011, Garcia và cộng sự đã nghiên cứu tạo cụm chồi cây Passiflora suberosa
L từ đoạn cắt lá trên môi trường MSM + 5 mg/l BA, sau 60 ngày số lượng chồi thu được cao (9,33 ± 1,4 chồi/mẫu) trong khi trên môi trường MS + 5 mg/l BA lượng chồi thu được ít hơn (5,6 ± 2,5 chồi/mẫu) Cây chanh dây là một dạng dây leo thân
gỗ, các nghiên cứu trên cho thấy môi trường MS (thường dùng cho cây thân thảo) chưa thực sự thích hợp cho nuôi cấy đối tượng này Do đó cần nghiên cứu trên các loại môi trường khác nhằm tìm ra môi trường phù hợp với cây chanh dây
Ngoài ra, Monteiro và cộng sự (2000) đã phát hiện sự thiếu hụt dinh dưỡng ở
cây chanh dây vàng Passiflora edulis Sims f flavicarpa Deg khi nuôi cấy trên môi
trường MS + 1 mg/l gibberellic acid, chủ yếu là Fe và Ca (ngoài ra còn thiếu Cu,
Mg, S), mẫu có triệu chứng ngộ độc có thể do Cl (ngoài ra còn do B) Khi chuyển vào môi trường MSM, các triệu chứng thiếu hụt và ngộ độc cũng giảm đáng kể Trong phạm vi các tài liệu tham khảo được, môi trường sử dụng nhiều nhất là MS nhưng hiệu quả đều không cao; một số ít nghiên cứu sử dụng môi trường MSM cho hiệu quả tốt hơn nhiều; tuy nhiên chưa có nghiên cứu nuôi cấy mô chanh dây trên môi trường WPM Sau khi phân tích thành phần môi trường WPM, chúng tôi nhận thấy môi trường này cũng có lượng Ca, Cu cao hơn và lượng Cl thấp hơn môi trường MS nên
có thể sẽ phù hợp cho nuôi cấy mô cây chanh dây hơn
Trang 82.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, trường Đại học Đà Lạt, từ tháng 11 năm
2016 đến tháng 5 năm 2017
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Để tiến hành thí nghiệm tôi chọn các đọt chanh dây Passiflora edulis Sims
(khoảng 1 - 1,5 năm tuổi) thu ở huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng để làm vật liệu nghiên cứu
2.1.3 Dụng cụ dùng trong thí nghiệm
- Tủ lạnh
- Tủ sấy
- Tủ cấy vô trùng
- Nồi hấp tiệt trùng
- Máy đo pH
- Cân
- Bịch nilon (7 x 14 cm)
- Pipet (1 ml, 2 ml)
- Bình tam giác (250 ml, 500 ml)
- Ống đong (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml,
1000 ml, 2000 ml)
- Đèn cồn, dao cấy, pank và các dụng cụ khác
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp thu mẫu
Mẫu sử dụng là các đọt chanh dây lấy từ những cây khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, không bị tổn thương và không có dấu hiệu của sâu bệnh
2.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng là MS và WPM có bổ sung:
- Đường: 20 g/l
- Agar: 6,5 g/l
- Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 – D, BA, NAA
- pH của môi trường được điều chỉnh về 6,2 bằng NaOH 1N Môi trường được hấp khử trùng trong nồi hấp ở 1210C, 1 atm, 20 phút
- Sử dụng bịch môi trường có kích thước 7 x 14 cm (1 mẫu/bịch)
2.2.3 Điều kiện nuôi cấy
Ánh sáng: Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày bằng đèn huỳnh quang trắng cường độ 40 µmol.m2.s-1
Trang 9Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 20C
2.2.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất khử trùng và kích thước mẫu
Mục đích: Nhằm xác định kích thước mẫu và nồng độ chất khử trùng (Javel)
phù hợp để tạo nguồn mẫu ban đầu phục vụ quá trình thí nghiệm
Tiến hành: Khử trùng mẫu: các mẫu cấy (lá, chồi) được rửa bằng xà phòng và
nước máy Trong điều kiện vô trùng, tráng sơ mẫu bằng cồn 700 (30 giây), rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần Sau đó ngâm và lắc nhẹ mẫu 10 phút trong dung dịch Javel (nồng độ 1; 1,5; 2%) có bổ sung thêm 2 giọt Tween-80 Khi khử trùng cần cho mẫu cấy ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn, mẫu được rửa lại 5 lần bằng nước vô
trùng Mẫu cấy sau khi khử trùng xong sẽ được cắt lại theo kích thước đã đặt ra, đồng
thời loại bỏ những phần bị hoại tử bởi Javel Sau đó cấy vào môi trường WPM không
bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, theo dõi và thu số liệu
Lá: cắt bỏ viền, cắt nhỏ thành các mảnh hình chữ nhật 2 x 5 mm (hình 2.1e) Đoạn thân non: cắt thành từng lát mỏng 1 mm (hình 2.1c)
Tách lấy chồi ngọn và chồi nách với kích thước lớn và nhỏ (hình 2.1b và hình 2.1g), được kí hiệu như bảng 2.1
Bảng 2.1 Bố trí nghiệm thức cho thí nghiệm khử mẫu chồi chanh dây
Nồng độ
Javel (%)
Nghiệm thức
Loại mẫu
Kích thước (mm)
Nghiệm thức
Loại mẫu
Kích thước (mm)
Chồi ngọn
Nhỏ (2 x 4)
N1
Chồi nách
Nhỏ (1 x 2)
Lớn (8 x 12)
N4
Lớn (8 x 12)
Mỗi nghiệm thức khảo sát với 30 mẫu, lặp lại 3 lần, lấy số liệu trung bình Thời gian theo dõi: 2 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu chết và tỉ lệ mẫu sống
Tỉ lệ mẫu nhiễm = Số mẫu nhiễm
Tổng số mẫu x 100%
Tỉ lệ mẫu chết = Số mẫu chết
Tổng số mẫu x 100%
Trang 10Hình 2.1 Mẫu chanh dây sử dụng trong nghiên cứu
Trong đó: a - đọt chanh ban đầu; b - chồi ngọn; c - đoạn thân non (giữa lá thứ 2 và
3 tính từ ngọn); d - lá non (lá thứ 3 tính từ ngọn); e - mẫu lá sau khi cắt; f - đoạn
thân mang chồi nách; g - chồi nách
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại môi trường và nồng độ BA lên khả năng phát sinh chồi của mẫu chồi chanh
Mục đích: Tìm ra loại môi trường và nồng độ BA thích hợp cho khả năng phát
sinh chồi của mẫu chồi chanh dây
Tiến hành: Các bước khử trùng giống thí nghiệm 1, cắt mẫu (kích thước nhỏ)
như hình 2.1b và 2.1g, cấy vào môi trường, theo dõi và thu số liệu
Mẫu được cấy vào các môi trường MS và WPM có bổ sung 0,2 mg/l NAA và
BA với nồng độ thay đổi: 0; 2; 4; 6 và 8 mg/l
Các mẫu chồi ngọn trong môi trường MS và WPM được kí hiệu lần lượt từ
BM0 BM4; BW0 BW4
Các mẫu chồi nách trong môi trường MS và WPM được kí hiệu lần lượt từ
BM5 BM9; BW5 BW9
Mỗi nghiệm thức khảo sát với 10 mẫu, lặp lại 3 lần, lấy số liệu trung bình Thời gian theo dõi: 8 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu bật chồi, số chồi/mẫu
Tỉ lệ mẫu bật chồi = Số mẫu bật chồi
Tổng số mẫu x 100%
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 – D lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và đoạn thân non của cây chanh dây
Mục đích: Tìm ra môi trường có nồng độ 2,4 – D phù hợp cho sự tạo mô sẹo
từ mẫu chanh dây
c
b
a
d
e