Đang tải... (xem toàn văn)
Cây chanh dây có rất nhiều giá trị, là đối tượng khá dễ trồng nhưng lại khó nuôi cấy mô. Mặc dù có khá nhiều nghiên cứu nuôi cấy in vitro loài này nhưng chủ yếu dùng môi trường cơ bản MS. Tuy nhiên, sau khi thí nghiệm thực tế và tìm hiểu nhiều tài liệu về môi trường này nhận thấy nó chưa thực sự phù hợp với nuôi cấy mô cây chanh dây. Do đó tôi quyết định thay đổi sang môi trường WPM và thấy kết quả khá khả quan, hy vọng sẽ có thêm các nghiên cứu khác về môi trường WPM đối với cây chanh dây.
LỜI MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, người tiêu dùng có xu hướng chuyển từ nước có ga sang sử dụng loại nước trái tự nhiên nên nhu cầu nguồn nguyên liệu trái ngày tăng Trong số đó, nước ép chanh dây nhiều người ưa chuộng vị chua dễ chịu hương thơm lạ Hiện nay, chanh dây khơng biết đến với vai trò nước giải khát mà có nhiều giá trị cho ngành cơng nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa mĩ phẩm hoa đẹp với mục đích trồng làm cảnh Đây xem loại trồng cho thu nhập cao, ổn định lại trồng xen nhiều trồng có giá trị khác nên diện tích nhu cầu giống tăng nhanh Cây chanh dây trồng hạt, giâm hom nuôi cấy mô Trồng hạt phương pháp phổ biến, dễ dàng, thực người nông dân thiếu kinh nghiệm tốn nhiều thời gian, giống không đồng nhất, không giữ đặc tính mẹ lâu quả, giâm hom có ưu điểm thời gian nhân giống rút ngắn, sớm khó tạo nguồn giống bệnh, khó thu nguồn giống tốt số hom thu từ có hạn Do đó, phương pháp ni cấy mơ kĩ thuật định khắc phục nhược điểm tạo số lượng lớn giống bệnh, đồng đều, giữ đặc tính tốt mẹ, giảm giá thành so với giống nhập phù hợp với túi tiền người nơng dân Đó lý tiến hành đề tài “ Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro chanh dây tím (Passiflora edulis Sims.)” với mục tiêu nhằm nghiên cứu nhân giống in vitro chanh dây với hệ số nhân chồi cao, tạo tiền đề cho nghiên cứu sau đặc biệt tạo giống bệnh Nội dung nghiên cứu: Khảo sát nồng độ Javel kích thước mẫu lên hiệu khử trùng mẫu chồi chanh dây Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả tạo mô sẹo từ đoạn thân non chanh dây Khảo sát ảnh hưởng loại mơi trường nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên khả phát sinh chồi mẫu chồi chanh dây 1.1 Đặc điểm sinh học chanh dây 1.1.1 Vị trí phân loại Chanh dây tím có nguồn gốc từ Brazil, gọi với nhiều tên khác Passion fruit, chanh dây, mác mác, lạc tiên, trái mê ly Là loại trái có tiềm lớn cho ngành cơng nghiệp nước giải khát ưa chuộng nước giới (Phạm Quang Vũ 2008) Giới : Plantae Bộ : Malpighiales Họ : Passifloraceae Chi : Passiflora Loài : P edulis Tên khoa học: Passiflora edulis Sims Hình 1.1 Chanh dây 1.1.2 Đặc điểm sinh học a Đặc điểm hình thái Passiflora edulis Sims hay gọi chanh dây tím loại dây leo thân gỗ lâu năm, dài 15 – 20 m Lá có dạng ba thùy, màu xanh, dài khoảng 10 – 18 cm có cưa bao viền ngồi, phía mặt bóng láng, có màu xanh xám mờ hơn, cuống có màu đỏ vàng Hoa đơn, có mùi thơm, đường kính khoảng 4,5 cm có màu trắng ngà có màu xanh tím Hạt có dạng bẹt (một đầu nhọn đầu tròn), màu đen, kích thước nhỏ Bề mặt hạt rỗ có độ bóng định Quả chín có màu đỏ tía, trái dạng hình tròn hay hình bầu dục trứng, dài – cm, nặng 50 – 80 g (Phạm Quang Vũ 2008) b Đặc điểm sinh thái Hầu hết giống chanh dây tím trồng nước ta nhập từ Đài Loan Loại thích ánh nắng mặt trời, thích ứng với vùng có khí hậu mát mẻ, nhiệt độ trung bình 18 – 200C, độ cao trung bình 800 – 1000 m, có khả hoa đậu quanh năm, cho suất cao ổn định Cây cho thu hoạch từ – năm tùy khoảng cách trồng điều kiện chăm sóc Cây mọc nhiều loại đất trừ đất sét đất cát, độ mùn 1% pH 5,5 – thích hợp (Phạm Quang Vũ 2008) 1.1.3 Bệnh chanh dây Có ba nguồn gây bệnh chanh dây virus, vi khuẩn nấm Tuy nhiên gây thiệt hại lớn hai loại bệnh virus sau: bệnh cứng trái (do virus PWV) bệnh quăn (do virus PLCV) Khi bị nhiễm hai bệnh chanh dây bị giảm suất nghiêm trọng, khả tạo chồi vươn đọt kém, hoa ít, trái nhỏ bị biến dạng, nặng dẫn đến chết Đặc biệt bệnh lây truyền nhanh qua trùng chích hút, dụng cụ làm vườn lại trị bệnh nên vườn nhiễm khả trắng cao, chí lây lan tồn khu vực trồng chanh dây gần (Rheinländer 2010) 1.1.4 Ứng dụng chanh dây Chanh dây chủ yếu dùng để sản xuất nước trái cây, dùng làm nước giải khát hàng ngày hay nước đóng chai Nước chanh dây có tác dụng bổ, mát, nhiệt, tiêu khát, an thần, nhuận tràng, lợi tiểu, có hương vị đặc biệt nên ưa chuộng Chanh dây dùng làm bánh, kẹo, mứt, kem, nước xốt Ngoài ra, rễ chanh dây có khả trị chứng ngủ, dùng điều trị bệnh đau bao tử, bệnh cao huyết áp, suy nhược thần kinh (Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ 2010) 1.1.5 Các phương pháp nhân giống chanh dây truyền thống a Nhân giống từ hạt Hạt chanh dây tươi gieo vào đất để bóng râm, tưới nước trì độ ẩm hàng ngày để hạt mọc mầm Khi đem cấy vào bịch hay vỉ ươm, cao 20 – 40 cm đem trồng vườn (Phạm Quang Vũ 2008) Ưu điểm: Kĩ thuật đơn giản, dễ làm; hệ số nhân giống cao; tuổi thọ cao; trồng hạt thường có khả thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh; rễ phát triển tốt Nhược điểm: Hạt giống nảy mầm chậm thất thường, từ nhiều tháng đến năm (Flavia Guzzo cộng sự, 2004); khó giữ đặc tính mẹ; hoa kết muộn (Đoàn Thị Phương Thảo 2010) b Nhân giống giâm hom Lựa chọn cành giâm cành bánh tẻ khỏe, không bị sâu bệnh hại, có đủ ánh sáng, cành khơng mang hoa quả, vừa ổn định sinh trưởng chưa lâu Địa điểm giâm cành nên thơng thống kín gió Ta nên cắt cành vào lúc trời khơng có nắng (sáng sớm chiều tối) Các đoạn thân chứa đốt, cắt bỏ phía cắm vào giá thể rễ, cần trì độ ẩm thường xuyên Đến có đủ rễ chồi tương đối cao (15 – 20 cm) đem trồng ngồi vườn (Phạm Quang Vũ 2008) Ưu điểm: Giữ đặc tính di truyền mẹ; hoa kết sớm; thời gian nhân giống nhanh Nhược điểm: Nhân giống giâm cành liên tục qua nhiều hệ dễ dẫn đến tượng thối hóa; chanh dây khơng chống chịu tốt với sâu bệnh, tuyến trùng bệnh rễ nấm (Phytophthora, Fursarium); lây lan mầm bệnh qua hệ (Đoàn Thị Phương Thảo 2010) c Cây chanh dây ghép Cây chanh dây vàng: Ưu điểm: Sinh trưởng nhanh, dễ gây giống, mọc mầm phụ gốc con, khả chịu hạn chống chịu sâu bệnh tốt Nhược điểm: Là lồi có hoa lưỡng tính thụ phấn chéo, phải nhờ ong thụ phấn thụ phấn nhân tạo bổ sung, hoa theo mùa nên suất khơng ổn định Trái to vỏ dày, cơm chua gắt, đồng thời hàm lượng dinh dưỡng thấp, khơng thơm tím Cây chanh dây tím: Ưu điểm: Là lồi có hoa lưỡng tính, tự thụ phấn được, hoa nhiều, quanh năm nên suất cao ổn định Giống chanh tím có trái to, vỏ mỏng, nhiều nước, có mùi thơm nồng (mùi thơm đặc biệt kết hợp nhiều loại trái mà ta tổng hợp nhân tạo), vị chua nhẹ, có hàm lượng dinh dưỡng cao Khi trồng nhanh trái chanh vàng Nhược điểm: Khó gây giống vàng, khả chịu hạn chống chịu sâu bệnh đặc biệt bệnh rễ Cây chanh dây ghép: Từ đặc điểm cây, hầu hết giống chanh thị trường chanh dây ghép Gốc ghép chanh dây vàng (gieo từ hạt) chồi ghép chanh dây tím Tác động gốc ghép chanh dây vàng làm cho màu sắc trái chanh tím đẹp hơn, kích cỡ trái to hơn, làm tăng giá trị thương phẩm Tuy nhiên khó để chọn chanh tím bệnh, suất ưu việt với số lượng lớn Hiện phương pháp nhân giống in vitro quan tâm nhằm tạo nguồn giống bệnh, chất lượng cao (Đoàn Thị Phương Thảo 2010; Phạm Quang Vũ 2008) 1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Dựa tính tồn tế bào khả phân hóa, phản phân hóa chúng mà người ta tái sinh từ tế bào hay mẫu mơ Q trình bao gồm bước: Bước 0: Chọn lọc chuẩn bị mẹ: cần phải bệnh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trưởng mạnh Bước 1: Nuôi cấy khởi động: giai đoạn khử trùng (thường hóa chất) đưa mẫu vào ni cấy in vitro Bước 2: Nhân nhanh: chuyển mẫu vào mơi trường có hàm lượng Cytokinin cao để tái sinh thật nhiều chồi Bước 3: Tạo in vitro hoàn chỉnh: tách chồi riêng cấy vào mơi trường tạo rễ có hàm lượng Auxin cao Bước 4: Thích ứng in vitro ngồi điều kiện tự nhiên (Phan Xuân Huyên 2016; Bùi Thị Ngọc Tuyến 2011, trích dẫn Nguyễn Quang Thạch cộng 2009) 1.2.2 Kĩ thuật nhân giống in vitro số vấn đề liên quan a Nuôi cấy tạo chồi bất định Đỉnh chồi bất định phát tiển trực tiếp mẫu vật gián tiếp từ mơ sẹo, mà mơ sẹo hình thành bề mặt vết cắt mẫu vật (đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, nhánh củ,…) Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu tế bào nhu mô nằm biểu bì phía bề mặt thân; số tế bào trở thành mô phân sinh túi nhỏ gọi thể phân sinh phát triển Các thể phân sinh có nguồn gốc từ tế bào đơn, nhiên chiều hướng phản ứng thực vật tùy thuộc vào nồng độ phytohormon (Lê Văn Hồng 2008) b Ni cấy thông qua giai đoạn tạo mô sẹo Mô sẹo phát triển khơng theo quy luật có khả biệt hóa thành rễ, chồi phơi để hình thành hoàn chỉnh Hai điều kiện cho tạo mô sẹo non phần non trưởng thành dễ cho mô sẹo điều kiện nuôi cấy in vitro, tác dụng auxin (2,4 – D; NAA, ) áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Nguyễn Thị Quý Cơ cộng 2014) Tế bào mô sẹo cấy chuyền nhiều lần không ổn định mặt di truyền nên người ta thường sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh (Trịnh Thị Lan Anh 2015) c Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình vơ mẫu Tình trạng mẹ: Nên chọn chăm sóc tốt, giai đoạn sinh trưởng mạnh, khơng có triệu chứng sâu bệnh Thời gian lấy mẫu: Các yếu tố bên nhiệt độ, độ dài ngày, tình trạng nước cây,… ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng carbohydrate, protein dự trữ chất điều hòa sinh trưởng mơ Tùy thuộc mẹ trồng tự nhiên đồng hay chăm sóc nhà kính mà lấy mẫu ni cấy theo mùa lấy mẫu quanh năm Phẩm chất mẫu cấy: Cần lưu ý số đặc tính sau: - Các vị trí thực vật mặt đất các vị trí đất - Mẫu nhỏ nhiễm giảm mức độ sống sót sau khử trùng - Mơ bên nhiễm mơ bên ngồi Tuổi mẫu cấy: Vị trí cành phía thường non vị trí cành phía trên, mẫu cấy non thường có khả tái sinh cao mẫu già Sự vô trùng: Nuôi cấy mô kĩ thuật nuôi cấy cần điều kiện vô trùng, khử trùng mẫu cấy cần lưu ý: - Hóa chất khử trùng: Khơng độc với mẫu người thao tác, có hiệu loại vi sinh vật phạm vi rộng - Nồng độ chất khử trùng thời gian khử trùng: Nếu nồng độ cao, thời gian khử trùng dài mẫu bị tổn thương chết Còn nồng độ thấp, thời gian khử trùng q ngắn khơng diệt vi sinh vật (Nguyễn Bảo Toàn 2004) 1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan chanh dây Nghiên cứu tạo mô sẹo: Năm 2014, Carvalho cộng nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ Passiflora gibertii NE Brown mơi trường ½ MS bổ sung mg/l BA + 5% nước dừa nuôi cấy 30 ngày Nghiên cứu cho thấy mẫu để tối ngồi ánh sáng có khả tạo mô sẹo mẫu để tối có khả bật chồi Năm 2016, Jardim Rosa cộng nuôi cấy rễ Passiflora suberosa L 15 ngày tuổi Sau 35 ngày mô sẹo hình thành ni cấy mơi trường MS + mg/l NAA + mg/l BA Ożarowski (2011) nuôi cấy tạo mô sẹo từ lát mỏng Passiflora edulis Sims môi trường MS + 16 mg/l 2,4 – D + mg/l BA, ủ tối, mơ sẹo hình thành sau 30 ngày Như vậy, nghiên cứu sử dụng môi trường MS ½ MS bổ sung BA, NAA 2,4 – D (để tối, nguồn mẫu rễ lá) thời gian để tạo mô sẹo dài (30 – 35 ngày) cần nghiên cứu thêm môi trường khác, đồng thời khảo sát khả tạo mô sẹo phận khác nhằm tạo mô sẹo tốt, rút ngắn thời gian Nghiên cứu bật chồi: Năm 2010, Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ tạo cụm chồi Passiflora edulis Sims từ đoạn thân mang chồi nách (có nguồn gốc in vitro) môi trường MS + 0,5 mg/l BA lượng chồi thu (3,95 chồi/mẫu) Năm 2014, Junghans cộng tiến hành tách chồi Passiflora edulis Sims năm tuổi với kích thước khác (1; 0,5 0,25 cm) nuôi cấy môi trường MS + mg/l BA Sau 60 ngày nuôi cấy, mẫu không tạo thêm chồi mà cao thêm chút so với mẫu ban đầu (lần lượt 1,5; 0,86 0,52 cm) Năm 2011, Garcia cộng nghiên cứu tạo cụm chồi Passiflora suberosa L từ đoạn cắt môi trường MSM + mg/l BA, sau 60 ngày số lượng chồi thu cao (9,33 ± 1,4 chồi/mẫu) môi trường MS + mg/l BA lượng chồi thu (5,6 ± 2,5 chồi/mẫu) Cây chanh dây dạng dây leo thân gỗ, nghiên cứu cho thấy môi trường MS (thường dùng cho thân thảo) chưa thực thích hợp cho ni cấy đối tượng Do cần nghiên cứu loại mơi trường khác nhằm tìm mơi trường phù hợp với chanh dây Ngoài ra, Monteiro cộng (2000) phát thiếu hụt dinh dưỡng chanh dây vàng Passiflora edulis Sims f flavicarpa Deg nuôi cấy môi trường MS + mg/l gibberellic acid, chủ yếu Fe Ca (ngồi thiếu Cu, Mg, S), mẫu có triệu chứng ngộ độc Cl (ngồi B) Khi chuyển vào môi trường MSM, triệu chứng thiếu hụt ngộ độc giảm đáng kể Trong phạm vi tài liệu tham khảo được, môi trường sử dụng nhiều MS hiệu không cao; số nghiên cứu sử dụng môi trường MSM cho hiệu tốt nhiều; nhiên chưa có nghiên cứu nuôi cấy mô chanh dây môi trường WPM Sau phân tích thành phần mơi trường WPM, chúng tơi nhận thấy mơi trường có lượng Ca, Cu cao lượng Cl thấp môi trường MS nên phù hợp cho ni cấy mơ chanh dây 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Địa điểm thời gian thực Phòng Ni cấy mô tế bào thực vật, trường Đại học Đà Lạt, từ tháng 11 năm 2016 đến tháng năm 2017 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Để tiến hành thí nghiệm chọn đọt chanh dây Passiflora edulis Sims (khoảng - 1,5 năm tuổi) thu huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng để làm vật liệu nghiên cứu 2.1.3 Dụng cụ dùng thí nghiệm - Tủ lạnh - Bịch nilon (7 x 14 cm) - Tủ sấy - Pipet (1 ml, ml) - Tủ cấy vô trùng - Bình tam giác (250 ml, 500 ml) - Nồi hấp tiệt trùng - Ống đong (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml) - Máy đo pH - Cân - Đèn cồn, dao cấy, pank dụng cụ khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu mẫu Mẫu sử dụng đọt chanh dây lấy từ khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, khơng bị tổn thương khơng có dấu hiệu sâu bệnh 2.2.2 Môi trường nuôi cấy Mơi trường sử dụng MS WPM có bổ sung: - Đường: 20 g/l - Agar: 6,5 g/l - Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 – D, BA, NAA - pH môi trườnỉ lệ mẫu bật chồi = Số mẫu bật chồi x 100% Tổng số mẫu Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng 2,4 – D lên khả tạo mô sẹo từ đoạn thân non chanh dây Mục đích: Tìm mơi trường có nồng độ 2,4 – D phù hợp cho tạo mô sẹo từ mẫu chanh dây 10 Tiến hành: Các mẫu đoạn thân non khử trùng thí nghiệm 1, cấy vào mơi trường (đặt úp), để tối, theo dõi thu số liệu Mơi trường sử dụng WPM có bổ sung 2,4 – D với nồng độ thay đổi: 0; 2; 4; mg/l kí hiệu bảng 2.2 Bảng 2.2 Bố trí nghiệm thức cho thí nghiệm tạo mô sẹo Nghiệm Loại Nồng độ 2,4 – D Nghiệm Loại Nồng độ 2,4 – D thức mẫu (mg/l) thức mẫu (mg/l) DL0 DT0 DL1 DT1 Đoạn DL2 DT2 Lá non thân non DL3 DT3 DL4 DT4 Mỗi nghiệm thức khảo sát với 30 mẫu, lặp lại lần lấy số liệu trung bình Thời gian theo dõi: tuần Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ tạo mô sẹo, tỉ lệ mô sẹo xốp, tỉ lệ mô sẹo kích thước mơ sẹo Tỉ lệ tạo mơ sẹo = Tỉ lệ mô sẹo xốp + Tỉ lệ mô sẹo Tỉ lệ mô sẹo xốp = Tỉ lệ mô sẹo = Tổng số mô sẹo xốp x 100% Tổng số mô sẹo Tổng số mô sẹo x 100% Tổng số mơ sẹo Kích thước mơ sẹo: Đo theo đường kính, đa số khối mơ sẹo có hình cầu 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016 SPSS Statistics 20 11 3.1 Khảo sát nồng độ chất khử trùng kích thước mẫu lên hiệu khử trùng Tác dụng diệt khuẩn dung dịch Javel hypochlorous acid (HOCl) ion OCl- Đây chất khử trùng phổ biến, giá rẻ, an toàn dễ sử dụng (Nguyễn Bảo Toàn 2004) Sau tuần nuôi cấy môi trường WPM không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật: mẫu đoạn thân non không nhiễm, tỉ lệ sống 100% nồng độ Javel Các mẫu chồi thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ Javel kích thước mẫu lên hiệu khử trùng mẫu chồi chanh dây Nồng độ Javel (%) Kích thước (mm) Nghiệm Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu thức nhiễm (%) sống (%) chết (%) Chồi J1 32,22b 67,78b 0,00a Nhỏ b ab 1,5 J2 25,56 73,33 1,11ab (2 x 4) J3 10a 84,44a 5,56d J4 71,11f 28,89e 0,00a Lớn 1,5 J5 56,67de 43,33cd 0,00a (8 x 12) J6 46,67cd 50cd 3,33bcd Chồi nách N1 45,56c 54,44c 0,00a Nhỏ 1,5 N2 32,22b 65,56b 2,22abc (1 x 2) N3 11,11a 83,33a 5,56d N4 74,44f 25,56e 0,00a Lớn 1,5 N5 60,00e 40,00d 0,00a (8 x 12) cd cd N6 48,89 46,67 4,44cd Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với P = 0,05 phép thử Duncan Kết từ bảng 3.1 cho thấy kích thước mẫu nhỏ nồng độ Javel tăng hiệu khử trùng cao sức sống mẫu lại giảm Điều phù hợp với quy luật tác dụng chất khử trùng Do chồi nách lộ ngồi mơi trường, không lớp bảo vệ chồi nên có tỉ lệ nhiễm cao Vì nguồn mẫu thu giai đoạn mùa khô (tháng 11/2016 – 1/2017) nên hiệu khử trùng tương đối cao Nghiệm thức cho hiệu khử trùng cao (J3, N3) sử dụng Javel nồng độ 2%, kích thước mẫu nhỏ Sau khử trùng mẫu xanh, cấy vào môi trường đa phần mẫu sống Nhưng nồng độ xuất mẫu chết, khơng nên tăng nồng độ chất khử trùng lên thêm nữa, ảnh hưởng đến sức sống khả phát triển mẫu Các mẫu kích thước nhỏ có tỉ lệ nhiễm thấp đồng thời khả sống khơng mẫu có kích thước lớn Do chúng tơi chọn mẫu nghiệm thức J3 12 N3 (sử dụng dung dịch Javel nồng độ 2% 10 phút, cắt mẫu với kích thước nhỏ) làm nguyên liệu cho thí nghiệm 3.2 Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường nồng độ BA lên khả phát sinh chồi mẫu chồi chanh dây Sau tháng nuôi cấy tất mẫu chồi nách không bật chồi, mẫu chồi có bật chồi (khoảng nồng độ BA mg/l mg/l), không đồng nên chưa đủ liệu để thống kê tỉ lệ bật chồi số lượng chồi/mẫu tiêu đặt So với môi trường MS, môi trường WPM có lượng Ca, Cu cao lượng Cl thấp nên phù hợp cho nuôi cấy mơ chanh dây Theo số nghiên cứu BA NAA loại chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho ni cấy mơ chanh dây Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ (2010) tạo chồi từ đoạn thân mang chồi nách (tách từ in vitro) môi trường MS + 0,5 mg/l BA Năm 2016, Jardim Rosa cộng nuôi cấy rễ Passiflora suberosa L 15 ngày tuổi Sau 35 ngày mơ sẹo hình thành ni cấy môi trường MS + mg/l NAA + mg/l BA Các mô sẹo chuyển vào môi trường MS + mg/l BA, chồi phát sinh sau 35 ngày nuôi cấy Bảng 3.2 Khả phát sinh chồi mẫu chồi sau tháng nuôi cấy Nồng độ BA Tỉ lệ bật chồi (%) (tổng (mg/l) lần) (*) 0 WPM + 0,2 30 mg/l NAA 13,33 0 MS + 0,2 mg/l 10 NAA 3,33 (*) Mỗi nghiệm thức khảo sát với 10 mẫu, lặp lại lần Nghiệm thức BW0 BW1 BW2 BW3 BW4 BM0 BM1 BM2 BM3 BM4 Mơi trường Bảng 3.2 cho thấy mơi trường WPM có khả bật chồi tốt môi trường MS, mẫu chồi sau tháng (hình 3.1b) to so với ban đầu (hình 3.1a) tạo cụm chồi Tuy nhiên thí nghiệm này, số lượng mẫu tạo cụm chồi ít, khơng đồng số nguyên nhân sau: - Mẫu sử dụng nuôi cấy già (1,5 năm tuổi), mà chanh dây, độ tuổi mẫu quan trọng Nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô chanh dây sử dụng mẫu non Jardim Rosa cộng (2016) dùng mẫu 15 ngày tuổi, Silva cộng (2011) dùng mẫu 30 ngày tuổi mẫu có nguồn gốc từ in 13 vitro nghiên cứu Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ (2010) nên nồng độ BA sử dụng thấp (1 – mg/l) thời gian tạo cụm chồi ngắn (1 – tháng) - Chưa đủ thời gian để tạo cụm chồi hình A (phụ lục), mơ sẹo phải tháng bật chồi Năm 2014, Junghans cộng tiến hành tách chồi Passiflora edulis Sims năm tuổi với chiều cao khác (1; 0,5 0,25 cm) nuôi cấy môi trường MS + mg/l BA Sau tháng nuôi cấy, mẫu không tạo thêm chồi mà cao thêm chút so với mẫu ban đầu (lần lượt 1,5; 0,86 0,52 cm) Trong thí nghiệm xuất mẫu bật chồi sử dụng môi trường WPM nồng độ BA (4 - mg/l) cao so với nghiên cứu - Sự khác biệt giống chanh dây: Trong phạm vi tài liệu tham khảo được, giống chanh dây tím Passiflora edulis Sims thường cho hiệu bật chồi hơn, thời gian nuôi cấy dài nồng độ chất điều hòa sinh trưởng sử dụng cao giống khác Kết luận: Môi trường WPM bổ sung BA nồng độ từ - mg/l + 0,2 mg/l NAA có khả phát sinh chồi từ mẫu chồi chanh dây a b Hình 3.1 Mẫu chồi chanh dây sau tháng nuôi cấy môi trường WPM bổ sung mg/l BA + 0,2 mg/l NAA 3.3 Khảo sát ảnh hưởng 2,4 – D lên khả tạo mô sẹo từ đoạn thân non chanh dây Sau tuần ni cấy, mẫu bắt đầu có tượng cong lên, phình to hai đầu gân lá; mẫu thân bắt đầu phình to lên Sau tuần ni cấy, mơ sẹo hình thành tăng nhanh kích thước vị trí phình to trước Sự tạo mơ sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô cấy auxin Thông thường 2,4 D NAA thường sử dụng làm nguồn auxin ngoại sinh cho hình thành mơ sẹo lồi thực vật Ngồi ra, việc cảm ứng tạo mơ sẹo thường đòi hỏi kết hợp auxin cytokinin (Nguyễn Thị Quý Cơ, 2014) Nhưng thí nghiệm này, 14 chanh dây cần loại auxin 2,4 – D có khả tạo mô sẹo thời gian ngắn (2 tuần) Thời gian nhanh nhiều so với nghiên cứu Jardim Rosa cộng (2016) nuôi cấy tạo mô sẹo từ rễ Passiflora suberosa L môi trường MS + 30 g/l succrose + mg/l NAA + mg/l BA, sau tuần mô sẹo hình thành Nồng độ 2,4 – D thấp hơn, thời gian ngắn so với nghiên cứu Ożarowski (2011) nuôi cấy tạo mô sẹo từ lát mỏng Passiflora edulis Sims môi trường MS + 16 mg/l 2,4 – D + mg/l BA, ủ tối, mơ sẹo hình thành sau 30 ngày Điều chứng tỏ môi trường WPM phù hợp với chanh dây môi trường MS Kết sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng 2,4 – D lên khả tạo mô sẹo từ đoạn thân non chanh dây Nghiệm thức Mẫu mô 2,4 - D (mg/l) Tỉ lệ tạo Tỉ lệ mô mô sẹo sẹo xốp (%) (%) Tỉ lệ mơ sẹo (%) Kích thước mơ sẹo (*) DL0 0,00g 0,00a 0,00f Không tạo mô sẹo DL1 8,89f 8,89b 0,00f Nhỏ 37,78e 37,78cd 0,00f Nhỏ DL3 62,22d 32,22c 30,00d Lớn DL4 88,89b 7,78b 81,11b Lớn DT0 DT1 0,00g 81,11c 0,00a 77,78e 0,00f 3,33f Không tạo mô sẹo Nhỏ 96,67a 77,78e 18,89e Nhỏ 100,00a 43,33d 56,67c Lớn DL2 DT2 DT3 Lá non Đoạn thân non DT4 100,00a 0,00a 100,00a Lớn Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với P = 0,05 phép thử Duncan (*) Mẫu thân: Kích thước nhỏ: ≤ mm Mẫu lá: Kích thước nhỏ: ≤ 0,5 mm Kích thước lớn: > mm Kích thước lớn: > 0,5 mm Tỉ lệ tạo mô sẹo thay đổi tùy thuộc vào nồng độ 2,4 – D bổ sung vào môi trường Khi nồng độ 2,4 – D tăng tỉ lệ tạo mô sẹo tăng lên, nồng độ 2,4 – D cao gây ảnh hưởng ức chế (Lê Thị Hồng 2012) 2,4 – D có tác động mạnh đến q trình phản biệt hóa kích thích hình thành mơ sẹo Trong q trình phát sinh mơ sẹo thường xuất hai loại tế bào: tế bào xốp, có khơng bào to, nhân nhỏ tế bào chất lỗng (mơ sẹo trong); tế bào có khơng bào nhỏ, nhân to tế bào 15 chất đậm đặc (mơ sẹo xốp) Dạng mơ sẹo thường có khả tái sinh cao (Trịnh Thị Lan Anh 2015) A B mm Hình 3.2 Mơ sẹo từ đoạn thân non chanh dây A: Mô sẹo xốp B: Mô sẹo B B A A mm Hình 3.3 Mơ sẹo từ non chanh dây A: Mô sẹo xốp B: Mô sẹo 16 Tỉ lệ tạo mô sẹo tăng dần theo tăng nồng độ 2,4 – D Theo bảng 3.3, môi trường WPM không bổ sung 2,4 – D (DL0, DT0) mẫu xanh, khơng có khả tạo mô sẹo hai loại mẫu cấy Còn nghiệm thức có bổ sung 2,4 – D có khả tạo mơ sẹo Trong đó, nghiệm thức DT4 cho tỉ lệ 100% mô sẹo kích thước mơ sẹo lớn Ở nghiệm thức DL4 cho tỉ lệ tạo mô sẹo cao (81,11%), chất lượng tốt mô sẹo hình thành gân nên kích thước mô sẹo không lớn mẫu thân, tổng lượng mô sẹo thu Chúng tơi cấy mơ sẹo nghiệm thức DT4 vào môi trường WPM bổ sung BA nồng độ từ – mg/l + 0,2 mg/l NAA, cụm chồi hình thành sau tháng ni cấy (hình A – phụ lục) số lượng mẫu ít, khơng đồng nên chưa đủ liệu để thống kê Kết bảng 3.3 cho thấy mẫu thân có tỉ lệ tạo mơ cao hơn, kích thước lớn mẫu nên chúng tơi chọn nghiệm thức DT4 (môi trường WPM bổ sung mg/l 2,4 – D) nghiệm thức tạo mô sẹo tốt sau tuần ni cấy, sẹo có khả bật chồi 17 I KẾT LUẬN Từ kết thu được, đến kết luận sau: - Sử dụng Javel nồng độ 2% 10 phút, cắt mẫu với kích thước nhỏ (chồi x mm, chồi nách x mm) hiệu cho việc khử trùng mẫu chồi chanh dây - Môi trường WPM bổ sung BA nồng độ từ - mg/l + 0,2 mg/l NAA; 20 g/l succrose; 6,5 g/l agar pH = 6,2 có khả phát sinh chồi từ mẫu chồi chanh dây - Môi trường WPM bổ sung mg/l 2,4 – D, 20 g/l succrose, 6,5 g/l agar pH = 6,2 tốt cho tạo mô sẹo từ đoạn thân non II KIẾN NGHỊ Trong q trình thực đề tài tơi có số kiến nghị sau: - Cần khảo sát nồng độ BA kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin khác nhằm tìm mơi trường tốt nhất, độ tuổi mẹ để rút ngắn thời gian cho phát sinh chồi từ chồi ngọn, chồi nách mô sẹo chanh dây - Cần khảo sát nồng độ AgNO3 bổ sung vào môi trường giai đoạn phát sinh chồi để tăng khả kéo dài chuyển sang môi trường kéo dài thân 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trịnh Thị Lan Anh 2015, Nghiên cứu hình thành tế bào đơn lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) ứng dụng nhân giống, Luận án tiến sĩ sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Quý Cơ, Trần Văn Tiến, Võ Thị Bạch Mai, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hải Sơn 2014, Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo chồi long não (Cinnamomum camphora (L.) Sieb.) ni cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 12, 7:1034-1041 Lê Văn Hoàng 2008, Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Lê Thị Hồng 2012, Khảo sát khả nhân giống hoa anh thảo (Cyclamen persium) từ cuống thân củ phát sinh từ rễ hoa anh thảo in vitro, Khóa luận tốt nghiệp Đại học nghành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Đà Lạt Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ 2010, Nghiên cứu nhân giống vơ tính in vitro chanh dây (Passiflora edulis Sims.) sử dụng đoạn thân mang chồi nách, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam), Tập 8, 3:379385 Phan Xuân Huyên 2016, Bài giảng tóm tắt sinh trưởng phát triển thực vật, Trường Đại học Đà Lạt Đoàn Thị Phương Thảo 2010, Nghiên cứu sản xuất đồ uống hỗn hợp Bí ngơ Chanh dây đóng chai, Đồ án nghiên cứu trường Đại học Nha Trang Nguyễn Bảo Tồn 2004, Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, Trường đại học Cần Thơ Bùi Thị Ngọc Tuyến 2011, Khảo sát quy trình nhân giống hoa chng (Sinningia speciosa), Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Đà Lạt Phạm Quang Vũ 2008, Nghiên cứu tạo cụm chồi tạo rễ điều kiện in vitro chanh dây (Passiflora edulis Sims.), Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, trường Đại học Khoa học Huế 19 Tài liệu tiếng Anh Carvalho MAdF, Paiva R, Stein VC, Herrera RC, Porto JMP, Vargas DP & Alves E 2014, ‘Induction and morpho-ultrastructural analysis of organogenic calli of a wild passionfruit, Brazilian Archives of Biology and Technology, 57:851-859 Garcia R, Pacheco G, Falcao E, Borges G, Mansur E 2011, Influence of type of explant, plant growth regeneration, salt composition of basal medium, and light on callogenesis and regeneration in Passiflora suberosa (Passifloraceae), Plant Cell Tiss Org, 106:47-54 Guzzo F, Ceoldo S, Andreetta F, Levi M 2004, In vitro culture from mature seeds of Passiflora species Sci Argic (Piracicaba, Braz), v.61, 1:108-113 Jardim Rosa YB, Monte Bello CC & Dornelas MC 2016, In vitro organogenesis and efficient plant regeneration froom root explants of Passiflora suberosa L (Passifloraceae), In vitro Cell Dev Biol Plant, 52:64-71 Junghans TG, Andrade SRMd, Simões KdS, Caldas CdS, Souza AdS, Ledo CAdS 2014, In vitro culture of shoot apices from juvenile and adult yellow passion fruit plants Rev Bras Ciênc Agrár Recife, v9, 3:353-358 Monteiro ACBdA, Higashi EN, Goncëalves AN , and Rodriguez APM 2000, A novel approach for the definition of the inorganic medium components for micropropagation of yellow passionfruit (Passiflora edulis Sims f flavicarpa Deg.), In Vitro Cell Dev Biol Plant, 36:527-531 Ożarowski M 2011, Influence of the physico-chemical factors, plant growth regulators, elicitors and type of explants on callus cultures of medicinal climbers of Passiflora L., Herba Pol, 57:58-75 Prammanee S, Thumjamras S, Chiemsombat P, Pipattanawong N 2011, Eficient shoot regeneration from direct apical meristem tissue to produce virus – free purple passion fruit plants, Crop Protection, 30:1425-1429 Rheinländer, PA 2010, Field guide to common diseases and disorders of passion fruit in New Zealand, Plant & Food Research Mt Albert, Auckland, New Zealand Silva CVd, Oliveira LSd, Loriato VAP, Silva LCd, Campos JMSd, Viccini LF, Oliveira EJd, Otoni WC 2011, Organogenesis from root explants of commercial populations of Passiflora edulis Sims and a wild passionfruit species, P cincinnata Masters Plant Cell Tiss Organ Cult, 107:407-416 20 ... Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Đà Lạt Phạm Quang Vũ 2008, Nghiên cứu tạo cụm chồi tạo rễ điều kiện in vitro chanh dây (Passiflora edulis Sims.), Luận văn. .. cuống thân củ phát sinh từ rễ hoa anh thảo in vitro, Khóa luận tốt nghiệp Đại học nghành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Đà Lạt Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ 2010, Nghiên cứu nhân giống... trường WPM bổ sung mg/l 2,4 – D) nghiệm thức tạo mô sẹo tốt sau tuần ni cấy, sẹo có khả bật chồi 17 I KẾT LUẬN Từ kết thu được, đến kết luận sau: - Sử dụng Javel nồng độ 2% 10 phút, cắt mẫu với