NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRẠNG NGUYÊN (Euphorbia pulcherrima Willd.) Ngành

Và khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA thích hợp đến khả năng tạo chồi của cây Trạng nguyên in vitro, khảo sát ảnh hưởng của nồng độ GA3 thích hợp đến khả năng sinh trưởng của chồi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRẠNG NGUYÊN

(Euphorbia pulcherrima Willd.)

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ ĐIỆP

Niên khóa : 2005 – 2009

Tháng 8/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRẠNG NGUYÊN

(Euphorbia pulcherrima Willd.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

KS LÊ HỒNG THỦY TIÊN

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện

và động viên con trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các Thầy Cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô tại trường

đã luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi

- ThS Nguyễn Vũ Phong và KS Lê Hồng Thủy Tiên đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- KS Trần Ngọc Hùng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài

- KS Tô Thị Nhã Trầm cùng các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành khóa luận này

- Toàn thể các bạn trong lớp CNSH31 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong

suốt thời gian làm đề tài

Chân thành cảm ơn

Tháng 08 năm 2009 Nguyễn Thị Điệp

TÓM TẮT

Ở Việt Nam, nhu cầu mua Trạng nguyên dùng để trưng bày trang trí ngày càng tăng vànguồn Trạng nguyên tiêu thụ trong nước chủ yếu nhập khẩu từ nước ngoài nên giá mỗi cây Trạng nguyên rất cao Hơn nữa, Trạng nguyên sản xuất chủ yếu bằng phương pháp giâm cành mà cành giâm cần 6 – 8 tuần để phát triển rễ đầy đủ Phương pháp này tốn thời gian và hệ số nhân không cao Trong khi đó, phương pháp nuôi cây

mô cho hiệu quả cao hơn Nhằm bước đầu xây dựng quy trình vi nhân giống cây Trạng

nguyên nên đề nghị thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Trạng nguyên (Euphorbia pulcherrima Willd.)”

Đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Trạng nguyên (Euphorbia

pulcherrima Willd.)” được thực hiện từ tháng 02/2009 đến tháng 07/2009 tại Bộ môn

Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

Nội dung chính của đề tài là khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lý và nồng độ chất

khử trùng đến tỉ lệ sống của cây Trạng nguyên in vitro để tạo nguồn mẫu sạch làm

mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo Và khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA

thích hợp đến khả năng tạo chồi của cây Trạng nguyên in vitro, khảo sát ảnh hưởng

của nồng độ GA3 thích hợp đến khả năng sinh trưởng của chồi Trạng nguyên in vitro,

khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA thích hợp cho sự tạo rễ cây Trạng nguyên in

vitro, và tiến hành thuần hóa cây con Trạng nguyên ngoài vườn ươm

Từ kết quả thực nghiệm, thu được một số kết quả sau: Chồi Trạng nguyên được

vô trùng tốt nhất với tỉ lệ javel: nước là 1: 2 trong thời gian 15 phút, thu được tỷ lệ mẫu sạch cao nhất là 53,3% Môi trường thích hợp để nhân chồi là môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l, thu được số chồi cao nhất là 4,8 chồi/cụm Sau 4 tuần nuôi cấy, chuyển chồi sang môi trường MS bổ sung GA3 0,3 mg/l để kéo dài chồi và kết quả chồi có chiều cao tốt 3,2 cm/chồi Chồi ra rễ trong môi trường MS ½ (không có đường) bổ sung IBA 2 mg/l nhưng số chồi tạo rễ ít Tỉ lệ sống của cây con ngoài vườn ươm là 75%

iv

SUMMARY

In Vietnam, demanding of customers buy Poinsettias in order to decorate that is more and more And source of Poinsettias consume at home which majority import from other countries so the cost of Poinsettia is very expensive Moreover, Poinsettias are essential produced by cutting method but cuttings need 6 – 8 weeks to develop full roots This method waste time and not high coefficient of propagation Thus, we have

done this subject “The study of propagation in vitro Poinsettia (Euphorbia

pulcherrima Willd.)”

The thesis “The study of propagation in vitro Poinsettia (Euphorbia

pulcherrima Willd.)” was studied from 2/2009 to 7/2009 at the Department of

Biotechnology at Nong Lam University

The main point of subject is that we study the time and the concentration of Natri hypochlorit which affect poinsettia’s life And we study: The concentration of

BA and NAA affect creation of bud poinsettia, the concentration of GA3 affect growth

of poinsettia, the concentration of IBA affect creation of root poinsettia

Some results of this subject which we have gotten Such as axillary nodes are steriled with Natri hypochlorit 1: 2 from 15 to 20 minutes Next, suitable medium for bud proliferation is MS medium supplemented with BA 0,5 mg/l After 4 weeks, buds transferred to MS medium supplemented with GA3 0,3 mg/l in order to lengthen buds Buds created roots in MS ½ medium (without sugar) complemented IBA 2 mg/l Survival rate of plantlets in nursery garden is 75%

MỤC LỤC

Phần Trang

Lời cám ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây Trạng nguyên 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và lịch sử phát triển của Trạng nguyên 3

2.1.3 Mô tả cây Trạng nguyên 6

2.2 Cách trồng cây Trạng nguyên 7

2.3 Một số bệnh trên cây Trạng Nguyên 8

2.3.1 Các bệnh ở lá 8

2.3.2 Các bệnh ở rễ 9

2.4 Nhân giống cây trồng in vitro 10

2.4.1 Giới thiệu nhân giống in vitro 10

2.4.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 11

2.4.3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc nhân chồi 12

2.4.3.1 Khảo sát về chức năng của đỉnh sinh trưởng 13

2.4.3.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và tạo lại các dòng cây sạch bệnh 14

2.4.3.3 Sự tăng sinh của chồi nách khi nuôi cấy các đỉnh thân 14

2.4.4 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy 15

2.5 Phương pháp nhân giống Trạng nguyên 16

vi

2.5.1 Gieo hạt 16

2.5.2 Giâm cành 17

2.5.3 Nhân giống in vitro 17

2.5.3.1 Nghiên cứu trong nước 17

2.5.3.2 Nghiên cứu trên thế giới 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 20

3.2 Vật liệu 20

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 20

3.2.2 Môi trường nuôi cấy 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng 20

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA 21

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của GA3 23

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA 23

3.3.5 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm 24

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Thí nghiệm 1: Nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp 26

4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA 28

4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của GA3 lên khả năng sinh trưởng 32

4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ IBA và hàm lượng khoáng 36

4.5 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

Tài liệu tham khảo 40 Phụ lục

HgCl2 : Thủy ngân chlorite

IAA : -indol acetic acid

IBA : -indol butyric acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ javel và thời gian xử lý 21

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và NAA lên khả năng 22

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của GA3 23

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA 25

Bảng 4.1 Kết quả khử trùng đốt thân mang chồi ngủ sau 3 tuần nuôi cấy 26

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự gia tăng số chồi 28

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của GA3 lên sự phát triển chiều cao và số lá 33

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự hình thành rễ cây Trạng nguyên 36

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây Trạng nguyên 3

Hình 2.2 Oak Leaf giống nguyên thủy của các giống Trạng nguyên hiện nay 4

Hình 2.3 Giống Trạng nguyên Paul Mikkelsen 5

Hình 2.4 Các giống Trạng nguyên 5

Hình 2.5 Hoa Trạng nguyên 6

Hình 2.6 Hai dạng kiểu hình của giống Jolly Red 7

Hình 2.7 Hai kiểu lá theo kiểu nhánh Trạng nguyên 7

Hình 2.8 Bệnh mốc xám ở Trạng nguyên 8

Hình 2.9 Bệnh nấm mốc sương ở Trạng nguyên 9

Hình 2.10 Bệnh nấm vảy trên lá 9

Hình 2.11 Bệnh thối mục rễ 10

Hình 2.12 Cành giâm Trạng nguyên bị nấm Rhizoctonia solani 10

Hình 2.13 Sự phát sinh phôi sinh dưỡng in vitro cây Trạng nguyên 19

Hình 4.1 Chồi Trạng nguyên nẩy từ đốt thân mang chồi ngủ 27

Hình 4.2 Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi 31

Hình 4.3 Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự hình thành chồi 31

Hình 4.4 Chồi phát sinh ở môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l 32

Hình 4.5 Chồi Trạng nguyên 34

Hình 4.6 Ảnh hưởng của GA3 lên sự sinh trưởng của chồi Trạng nguyên 35

Hình 4.7 Rễ của cây Trạng nguyên tạo ra trên các môi trường tạo rễ 37

Hình 4.8 Cây Trạng nguyên trồng ngoài nhà lưới 38

Ở phương Tây, cứ gần đến mùa Giáng Sinh, bên cạnh những chậu thông xanh, những màn tuyết trắng xóa thì màu đỏ rực rỡ của Trạng nguyên cũng không thể thiếu

Và như vậy trong mùa Giáng Sinh, nhà nào cũng cố gắng có một cành Trạng nguyên treo trên tường hoặc bên cánh cửa, ngoài vườn như mong ước điều vui vẻ, may mắn sẽ đến với gia đình nhân dịp Giáng Sinh và năm mới

Ở Việt Nam, những năm gần đây Trạng nguyên giống lùn, lá đỏ trồng chậu đang rất được ưa chuộng dùng để trang trí đặc biệt là vào mùa giáng sinh và năm mới Nguồn Trạng nguyên tiêu thụ trong nước chủ yếu nhập khẩu từ nước ngoài: Thái Lan, Đài Loan

và Trung Quốc nên giá mỗi cây Trạng nguyên khá cao

Trạng nguyên được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp giâm cành Cành giâm cần 6 - 8 tuần để phát triển rễ đầy đủ Phương pháp này tốn thời gian và hệ số nhân không cao Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy mô cho hiệu quả cao hơn

Trạng nguyên là cây thích hợp với khí hậu Việt Nam, nhưng nghiên cứu về quá trình vi nhân giống Trạng nguyên ở Việt Nam còn hạn chế Nhằm bước đầu xây dựng quy trình vi nhân giống cây Trạng nguyên nên đề nghị thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy

trình nhân giống in vitro cây Trạng nguyên (Euphorbia pulcherrima Willd.)”

1.2 Yêu cầu

 Xác định thời gian xử lý và nồng độ chất khử trùng để tạo nguồn mẫu sạch ban đầu

 Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp đến khả năng tạo chồi của cây Trạng

nguyên in vitro

 Xác định nồng độ GA3 thích hợp đến khả năng sinh trưởng của chồi Trạng

nguyên in vitro

 Xác định nồng độ IBA thích hợp cho sự tạo rễ cây Trạng nguyên in vitro

 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm

1.3 Nội dung thực hiện

 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lý và nồng độ chất khử trùng đến tỉ lệ sống của

cây Trạng nguyên in vitro

 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự nhân chồi, sinh trưởng và

khả năng tạo rễ của cây Trạng nguyên in vitro

 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Trạng nguyên

2.1.2 Nguồn gốc và lịch sử phát triển của Trạng nguyên

Theo D Michael Benson và ctv (2001), Trạng nguyên là cây bản địa ở Mexico và

có nguồn gốc ở vùng gần Taxco ngày nay Trước khi người Châu Âu đến Mexico, những người ở Aztec ở trung tâm Mexico đã trồng loài cây này và gọi nó là Cuetlaxochitl Vì màu sắc rực rỡ, người da đỏ coi Trạng nguyên là biểu tượng của sự trong sạch Người da đỏ sử dụng lá bắc Trạng nguyên làm thuốc nhuộm màu tím đỏ và dùng nhựa cây để làm thuốc trị sốt

Năm 1825, Joel Roberts Poinsett (1779 – 1851) là người đầu tiên giới thiệu Trạng nguyên ở nước Mỹ Ông là đại sứ đầu tiên của nước Mỹ đến Mexico, ông đi thăm Taxco

và thấy những cây Trạng nguyên trồng ở gần đồi núi Sau đó, ông bắt đầu nhân giống, gửi tặng cho bạn bè và các nhà làm vườn, trong đó có John Bartram ở Philadelphia Bartram cung cấp Trạng nguyên cho Robert Buist, người bán cây Trạng nguyên đầu tiên trên thị trường Tên Poinsettia là tên tiếng anh của cây Trạng nguyên được đặt để tưởng nhớ Joel Roberts Poinsett

Kỷ nguyên hiện đại của nhân giống Trạng nguyên bắt đầu bằng sự có mặt của

giống Oak Leaf Năm 1923, giống này được bà Enterman trồng ở Jersey City, New

Jersey Từ năm 1923 đến đầu năm 1960, tất cả những giống Trạng nguyên chủ yếu trên

thị trường đều xuất phát từ chọn lọc hoặc từ những biến dị của giống Oak Leaf

Hình 2.2 Oak Leaf giống nguyên thủy

của các giống Trạng nguyên hiện nay (http://www.apsnet.org/)

Giữa những năm 1950, các tổ chức đã bắt đầu nhân giống Trạng nguyên gồm có

đại học bang Pennsylvania, đại học Maryland, trung tâm nghiên cứu USDA tại

Beltsville, Maryland và một số công ty trồng cây như Azalealand ở Lincoln, Nebraska;

Paul Ecke Ranch ở Encinitas California; Mikkelsen,s ở Ashtabula, Ohio; Zieger Brother

ở Hamburg, Đức; Thormod Hegg và Son ở Reistad, Na Uy

Giáo sư Robert N Stewart, ngành nghiên cứu nông học ở Belsville, Maryland, đã

nghiên cứu di truyền của Trạng nguyên để tách ra những đặc tính mong muốn như thân

cứng chắc, lá bắc lớn hơn, nhiều màu sắc mới lạ và kéo dài chất lượng lá bắc Ông cũng

tập trung xác định tính chất của các giống Trạng nguyên đột biến Các nghiên cứu của

ông đã giúp ích rất nhiều cho các nhà lai tạo giống Trạng nguyên

Năm 1963, một kỷ nguyên mới của Trạng nguyên lại mở ra khi giống Paul

Mikkelsen xuất hiện trên thị trường Giống này có thân chắc, kéo dài được chất lượng

của lá bắc, cung cấp cho thị trường giống có thời gian tồn tại kéo dài hơn của lá bắc

Năm 1964, giống Annette Hegga Red có mặt ở Na Uy Sau đó, một loạt Trạng nguyên

đột biến của giống này được tạo ra Các giống Hegg được coi là một loài mới hoàn toàn

trên thị trường vì nó có thể cho ra 5 – 8 cành hoa từ một nhánh và nó có thể nhân giống

rất dễ dàng

4

Hình 2.3 Giống Trạng nguyên Paul

Mikkelsen ( http://www.apsnet.org/)

Năm 1988, thị trường Trạng nguyên có thêm giống Eckespoint® Lilo Đó là giống Trạng nguyên lá sẫm đầu tiên, ra hoa sớm và kéo dài được chất lượng của lá bắc Giống này đòi hỏi kỹ thuật chăm sóc riêng để đảm bảo ra nhánh tốt

Năm 1992, giống Eckespoint® Freedom™ xuất hiện Nó có những đặc tính tốt nhất của Eckespoint® Lilo khi cho ra nhiều nhánh hơn, thích hợp với yêu cầu của khách hàng Thêm cuộc cách mạng cuối cùng của sự xuất hiện giống Trạng nguyên mới, đó là giống Eckespoint® Winter Rose™ Dark Red vào năm 1998 Đó là giống đầu tiên trong nhóm lá xoăn, có lá bắc bẻ cong, đỏ đậm, lá xanh đậm và cong

Hình 2.4 Các giống Trạng nguyên (a) Giống Trạng nguyên

Winter Rose đầu tiên có lá cong; (b) Giống Trạng nguyên Plum

Pudding đầu tiên có lá bắc màu tím (http://www.apsnet.org/)

Ngày nay, Trạng nguyên được tìm thấy với nhiều màu sắc và kích cỡ, từ cây mini cho đến những cây cao, lớn Trạng nguyên không chỉ là cây hoa nổi tiếng trong mùa Giáng Sinh mà còn là cây trồng chậu bán chạy nhất nước Mỹ, với hơn 65 triệu cây được bán trên cả nước năm 2000

2.1.3 Mô tả cây Trạng nguyên

Trạng nguyên là loài cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ, thông thường cao 0,6 đến 4 m, phân cành nhánh nhiều Lá ở thân dạng bầu dài, chia thùy, cuống mập, lá màu xanh đậm, bóng, gân nổi rõ, có răng cưa màu lục sẫm dài 7 – 16 cm Các lá trên cùng còn gọi là lá bắc, có màu đỏ lửa, hồng hay trắng và thường bị nhầm lẫn là hoa Hoa thực sự là các cấu trúc nhỏ màu vàng, tìm thấy ở trung tâm của các cụm lá Các giống Trạng nguyên cũng được tạo ra với các lá bắc màu cam, vàng nhạt, kem hay cẩm thạch

Hiện nay, người ta biết chính xác có 109 thứ Trạng nguyên, nhưng theo kết quả một

số cuộc điều tra thì khoảng 69% người Mỹ thích Trạng nguyên hoa đỏ, 7% thích loại hoa trắng và 14% thích hoa hồng (Poinsettia pages, The university of Illinois Extension)

Hoa Trạng nguyên là một cụm hoa, có màu hơi xanh và có dạng hình chén gọi là cyathia Mỗi cyathium là một cụm hoa chứa hoa đực và hoa cái đơn tính, không có cánh hoa Hoa đực rất khó thấy và biến đổi thành một nhị hoa đơn, màu đỏ Trong khi đó, hoa cái có một nhụy đơn trên một cuống nhỏ Bầu nhụy ẩn bên trong cyathium Mép của cyathium có một tuyến mật hoa màu vàng, để thu hút các loài thụ phấn (họ Đại kích, 2000)

b a

Hình 2.5 Hoa Trạng nguyên (a) A: Cyathium ở giữa gồm nhiều cụm hoa màu vàng xanh; (b) B: một cyathium hình tách C: tuyến mật hoa màu vàng để hấp dẫn côn trùng D: những hoa đực là cụm các nhị đơn, màu đỏ

(http://waynesword.palomar.edu/trmar98b.htm)

6

Về kiểu hình, theo Ing-Minh Lee (2000), có hai dạng kiểu hình của các giống Trạng nguyên được bán trên thị trường là kiểu nhánh hạn chế và kiểu nhánh tự do Kiểu nhánh hạn chế có ưu thế ngọn, có vài chồi nách và lá bắc Kiểu nhánh tự do có ưu thế ngọn giảm, nhiều chồi nách và lá bắc

Hình 2.6 Hai dạng kiểu hình của giống Jolly Red: kiểu nhánh

hạn chế (trái) và kiểu nhánh tự do (phải) (http:// apsnet.org/

education/ feature/ poinsettia/)

Hình 2.7 Hai kiểu lá theo kiểu nhánh Trạng

nguyên: lá của cây nhánh hạn chế (trái) và lá của cây nhánh tự do (phải) (http://apsnet.org/)

2.2 Cách trồng cây Trạng nguyên

 Điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, nước và dinh dưỡng

Cây Trạng nguyên là thực vật cận nhiệt đới, trồng nhiều ở Sydney, Australia Cây phát triển tốt ở nhiệt độ ban ngày là 21oC Cây phát triển không tốt thường bị héo, tàn lụi khi nhiệt độ ban đêm xuống dưới 10oC Trạng nguyên là thực vật ngắn ngày nên chỉ cần nhận ánh sáng 8 – 10 h/ngày Nên giữ cây trong tối từ 5h chiều đến 8h sáng và cây nhận ánh sáng từ 8h sáng đến 5h chiều Tưới nước cho cây khi giá thể hơi khô, tùy theo độ tuổi của cây mà ta có chế độ tưới nước riêng, không đặt cây nơi có nguồn nước bẩn hoặc cống hầm Thường xuyên cung cấp chất dinh dưỡng cho cây định kỳ sau 2 - 3 tuần Bón

phân cho cây sau mùa ra hoa và trong giai đoạn cây đang ra hoa thì không bón phân cho cây (Peg McMahon, Đại học Ohio)

 Cách làm cho cây Trạng nguyên ra hoa trở lại

Vào đầu tháng 4, cắt tỉa cành Trạng nguyên cách mặt đất khoảng 7 – 16 cm Tưới nước thường xuyên cho cây và bón phân sau 2 – 3 tuần, đặt cây trong nắng trên 17oC Đến đầu tháng 7, tiến hành cắt tỉa để điều khiển chiều cao của cây và tạo dáng cho cây, cắt 4 – 5 lá/cành để kích thích cây tạo ra nhiều nhánh hơn Giữa tháng 8, cắt tỉa thêm lần nữa Vào tháng 9, thay giá thể cho cây như than bùn, rêu, đất xốp miễn sao chứa nhiều chất dinh dưỡng và rút nước tốt Lúc này nên đặt cây trong nhà lưới có nhiệt độ từ 19 –

23oC và tưới nước thường xuyên cho cây Đến đầu tháng 10, để cây hoàn toàn trong tối

14 h/ngày kéo dài 8 – 10 tuần để kích thích cây ra hoa Cây sẽ ra hoa trong suốt mùa Giáng sinh, thời gian ra hoa tùy thuộc vào từng cây (Poinsettia Care in the Home, Paul Ecke Ranch )

2.3 Một số bệnh trên cây Trạng nguyên

2.3.1 Các bệnh ở lá cây Trạng nguyên

 Bệnh mốc xám: do nấm Botrytis cinerea gây ra Nấm Botrytis cinerea tạo ra

nhiều bào tử dễ dàng phát tán ra không khí Bệnh mốc xám có những mảng bám màu nâu trên lá cây Trạng nguyên dẫn đến lá bắc dễ bị cháy Bệnh gây ra ảnh hưởng đến vẻ đẹp của cây Các thuốc diệt nấm gồm chlorothalonil, fenhexamid, fludioxonil có thể bảo

vệ lá cây

b a

 Bệnh nấm mốc sương: do nấm Oidium sp gây ra Bệnh xuất hiện một tập đoàn

nấm màu trắng không những ảnh hưởng đến lá cây mà còn ảnh hưởng đến lá bắc, cây không thể bán được

b a

Hình 2.9 Bệnh nấm mốc sương ở Trạng nguyên (a) Gây ra

trên lá; (b) Gây ra trên hoa và lá bắc (http://www.apsnet.org/)

Nếu người trồng kiểm tra cẩn thận thì dấu hiệu bệnh ban đầu sẽ phát hiện ra và xử

lý bằng thuốc diệt nấm như là triflumizole, và myclobutanil

 Bệnh nấm vảy ở Trạng nguyên: do nấm Sphaceloma poinsettiae gây ra Bệnh có

vết loát chỉ xuất hiện trên cây Trạng nguyên Bệnh ảnh hưởng đến lá và thân của cây Nấm nhỏ gây tổn thương quanh trên phiến lá và thông thường xuất hiện trên gân lá hoặc

ở bên gân lá nơi chúng thường kết thành nhóm, có màu hơi trắng đến nâu ở giữa và thường có loan quầng màu vàng

Trạng nguyên có dấu hiệu bị nhiễm bệnh sẽ được loại bỏ, còn lại sẽ xử lý bằng thuốc diệt nấm Tránh tưới nước quá ẩm ướt cho cây để giảm cơ hội tấn công của bệnh nấm vảy

2.3.2 Các bệnh ở rễ

 Bệnh thối mục rễ gây ra bởi nấm Pythium Nấm thường tấn công vào rễ của cành

giâm làm cây rủ xuống và chết nhanh Rễ những cành giâm có màu nâu và sũng nước Những mô sẹo và rễ mới tại đó cũng trở thành màu nâu Trạng nguyên nhiễm bệnh phát

triển còi cọc, thường héo rũ khi nhiệt độ cao trong ngày

Thuốc diệt nấm và tác nhân sinh học thường được dùng trị bệnh thối mục rễ Các

chất sinh học chiết xuất từ các loài Trichoderma, Bacillus, Gliocladium, và

Streptomyces, có thể sử dụng phòng bệnh, trị bệnh cho cây Một số thuốc diệt nấm như

mefenoxam/metalaxyl, propamocarb và etridiazole được sử dụng để trị bệnh

10

Hình 2.11 Bệnh thối mục rễ ở Trạng nguyên (a) Cây Trạng

nguyên bị bệnh; (b) Rễ Trạng nguyên có màu nâu tối và sũng nước

b

a

 Bệnh héo rũ gốc mốc trắng gây ra bởi nấm Rhizoctonia solani là bệnh nguy hiểm

ảnh hưởng đến quá trình nhân giống cây Trạng nguyên Triệu chứng ban đầu của bệnh

là những tổn thương nhỏ thường phát triển ở gốc cây bề mặt của rễ

Hình 2.12 Cành giâm Trạng nguyên bị nấm

Rhizoctonia solani (http://www.apsnet.org/)

Những vết thương có thể phát triển trên một cành giâm đơn lẻ Nếu cành giâm mới bị nhiễm thì lan rộng nhanh chống đến thân và cây ngã sau 5 – 7 ngày Cành giâm

khi nhân giống được một tuần hoặc hơn thì kháng lại R solani tốt hơn Vùng nhiễm

bệnh trên lá có màu nâu và lấm tấm nhựa mủ màu trắng Những lá bị nhiễm nhanh chống lan truyền và lan đến rễ, dẫn đến bệnh thối rễ mốc trắng phát triển (D Michael Benson và ctv, 2001)

2.4 Nhân giống cây trồng in vitro

2.4.1 Giới thiệu nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi

cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ Trước kia người ta dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích sau

 Tạo một quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát được

 Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được

 Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy mô phân sinh ngọn

 Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học (Dương Công Kiên, 2002)

2.4.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt

được khi trải qua các giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro

Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy

in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân,

ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ

từ mô nuôi cấy

 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá

trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong

thực tiễn sản xuất

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống

hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng,

ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

2.4.3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc chồi thân

Theo Dương Công Kiên (2002), việc cấy đỉnh sinh trưởng cần phải thực hiện đối với việc nuôi cấy vùng nhô lên của chồi ngọn hoặc cấy đỉnh sinh trưởng khi có vài lá non đầu tiên Nhưng việc cấy đỉnh sinh trưởng sẽ trở nên không chuyên biệt một khi nó được thực hiện đối với các bộ phận của thực vật có chiều dài trên 500 µm và 1 mm Như vậy, việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sự nuôi cấy chồi chỉ định một cách không xác định đầu ngoài của nhánh thân cây Trong mỗi trường hợp, chúng ta cần phải xác định kích thước của phần thực vật được đặt nuôi cấy

12

Sự nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc chồi thân được thực hiện trong 3 mục đích khác nhau, để phục vụ cho việc nghiên cứu ứng dụng

2.4.3.1 Khảo sát về chức năng của đỉnh sinh trưởng

Việc cấy đỉnh sinh trưởng đã trở thành một phương pháp lựa chọn để tạo trở lại các dòng cây sạch bệnh Morel va Martin (1952, 1955) là những người đầu tiên thu được sự tái sinh các cây sạch bệnh (cây thược dược và khoai tây) từ các dòng cây bị nhiễm virus Những bộ phận được nuôi cấy (có đường kính khoảng 200 µm) ngoài vùng nhô lên của chồi, có chứa một vài lá nguyên thủy Các công trình nghiên cứu này đã:

 Làm nổi bậc khả năng là các đỉnh sinh trưởng tái sinh thành cây hoàn chỉnh, khả năng này xuất hiện như một đặc tính tổng quát giữa các thực vật bậc cao

 Đồng thời công trình này cũng mang lại các kết quả thực tiễn là khả năng các mô sinh trưởng dường như không bị nhiễm bệnh virus trong bối cảnh mà môi trường xung quanh mô bị nhiễm bệnh

Một giai đoạn thứ 2 của việc cấy đỉnh sinh trưởng trong mục đích nhân giống vô tính đã được lưu ý do các quan sát của Morel trên các loài lan Đỉnh sinh trưởng của lan cymbidium, được tách rời khỏi cây mẹ và được cấy trong ống nghiệm thì đỉnh này sẽ tái sinh thành một dạng protocorme, có cấu trúc phát triển một cách bình thường bởi phôi sau khi nảy mầm Protocorme là một củ nhỏ có tổ chức, có khả năng sinh ra nhiều điểm tăng trưởng bất định, các điểm tăng trưởng bất định này có thể tạo ra nhiều protocorme mới hoặc phát triển thành chồi non có lá

Giai đoạn thứ ba trong lịch sử nhân giống là việc cấy chồi thân đã được hiệu chỉnh bằng các kỹ thuật khá chính xác, các kỹ thuật này sẽ tạo nên sự thuận lợi trong việc nhân giống đỉnh sinh trưởng ở nách thân hoặc bất định và cho phép thực hiện nhân giống với một tỉ lệ cao trên các loài cây khác nhau

Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc chồi thân dường như là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm có thể phổ biến một cách dễ dàng nhất, cũng như chắc chắn nhất để thu được các cây con giống hệt nhau, ngoại trừ các sự đột biến mà chúng ta không mong muốn

2.4.3.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và tạo lại các dòng cây sạch bệnh

Trong một cây bị nhiễm bệnh, sự phân phối các virus dường như rất thay đổi, tùy theo cơ quan của cây, chúng có các hệ số về nồng độ virus rất rõ rệt ở các cơ quan này Nhiều nhận định khác nhau cho biết rằng đỉnh sinh trưởng của một cây bị bệnh, thực tế

có thể không bị nhiễm virus Việc truyền bệnh virus không xảy ra bởi hạt Từ các công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô trên rễ cây cà chua, White (1934) đã thành công trong việc cấy các rễ bị nhiễm do một loại virus gọi là mosaique trên cây thuốc lá Trong lúc cấy truyền các phần đoạn của rễ có chiều dài khoảng 1 mm, gần đầu ngoài của đỉnh rễ, White đã thu được các dòng cây không bị nhiễm virus

Sự cấy đỉnh sinh trưởng là một kỹ thuật giâm cành trong ống nghiệm Các giai đoạn khác nhau của sự nuôi cấy được hệ thống hóa trong bốn giai đoạn, các cây lâu năm

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

 Cây lấy lại sự tăng trưởng và chức năng sinh trưởng bình thường của đỉnh sinh trưởng

 Sự ra rễ của chồi non

 Trồng cây con vào chậu

2.4.3.3 Sự tăng sinh của các chồi nách khi nuôi cấy các đỉnh thân

Sự nhân giống in vitro các chồi nách một cách liên tiếp từ sự nuôi cấy đỉnh thân

tỏ ra ứng dụng được trên phần đông các loại thân thảo và nhiều loại cây lâu năm

Adams (1972) đã quan sát lần đầu tiên và thấy rằng, khi cho thêm chất cytokinin vào môi trường cấy sẽ tạo nên nhiều chồi non Dưới tác dụng của nồng độ cytokinin khá đậm đặc, người ta có thể quan sát được sự bành trướng lan dần của sự sinh tạo chồi Đầu tiên các chồi nách phát triển ở vị trí bình thường , ở nách các lá, kế đó nó phát triển ở nách trống của các lá Cuối cùng, các chồi có thể được tái tạo từ các mô sẹo ở dưới đáy Đây là sự phát triển chồi nách liên tiếp trên sự thức dậy của đỉnh ngọn và sự tái tạo các chồi bất định

Sự phát triển chồi nách và sự tái tạo các chồi bất định có thể được duy trì bằng sự cấy truyền hoặc gián đoạn bởi sự hủy bỏ chất cytokinin trong môi trường cấy Sự sinh chồi nách mạnh mẽ đi kèm theo sự tạo hình thái đặc biệt của thực vật Sự tăng trưởng của các chồi bị hạn chế, các lá thì nguyên vẹn như là lá của các cây con còn bé, sự phát triển của phiến lá bị thu hẹp lại (Dương Công Kiên, 2002)

14

2.4.4 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy

Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường (Bùi Trang Việt, 2000)

 Chất kích thích sinh trưởng auxin:

Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra

rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu Sự kéo dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi Hiệu ứng auxin giảm khi nồng

độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao Trong sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất định phát sinh từ các cơ quan dinh dưỡng thì hiệu quả của auxin rất đặc trưng Có thể xem auxin là hocmon hình thành rễ Nếu trong môi trường chỉ cho chất điều hòa sinh trưởng là auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ mà thôi Còn nếu muốn tạo chồi để có cây hoàn chỉnh thì phải bổ sung vào môi trường chất tạo chồi là cytokinin (Hoàng Minh Tấn, 2004)

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động

kéo dài trong đó có NAA Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm

một vị trí quan trọng, hai tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ (Trần Văn Minh, 2004)

Auxin chẳng những kích thích sự tăng trưởng của chồi non mà còn khởi phát cho

sự tạo mới Ở nồng độ thấp và thường dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vượt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Hoàng Minh Tấn, 2004)

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như: Indol acetic acid (IAA); naphthyl acetic acid (NAA); 2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D); indol butyric acid (IBA)

 Chất kích thích sinh trưởng cytokinin:

Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ (Dương Công Kiên, 2002)

Sự sinh trưởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ) Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với auxin Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào

và định hướng tế bào trong con đường phân hoá (Trần Văn Minh, 2004)

Cytokinin bao gồm các nhóm chất: 6-Benzylaaminopurin (BAP); kinetin (Ki); zeatin (Z); thidiazuron (TDZ)

 Chất kích thích sinh trưởng gibberellin:

Hiệu quả rõ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều cao của thân, chiều dài của cành, rễ, sự kéo dài của lóng cây hòa thảo Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của gibberellin lên sự dãn theo chiều dọc của tế bào Trong sản xuất, nếu muốn tăng chiều cao, tăng sinh khối, người ta có thể

xử lý gibberellin.Gibberellin kích thích sự nảy mầm của hạt, củ nên nó có tác dụng đặc trưng trong việc phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của chúng Gibberellin có hiệu quả kích thích sự ra hoa, phân hóa giới tính đực, hình thành quả và tạo quả không hạt Ngoài ra, gibberellin có ảnh hưởng điều chỉnh lên một số quá trình trao đổi chất và hoạt động sinh

lý của cây (Hoàng Minh Tấn, 2004)

2.5 Phương pháp nhân giống Trạng nguyên

2.5.1 Gieo hạt

Nhược điểm của phương pháp gieo hạt là các hạt mất khả năng phát triển bình

thường sau khi tồn trữ (Yogesh T Jasrai và ctv, 2003)

16

2.5.2 Giâm cành

Giâm cành là phương pháp phổ biến nhất trong nhân giống truyền thống Trạng

nguyên Cành giâm ra rễ sau khoảng 21 đến 25 ngày giâm Trong điều kiện giâm, cành giâm sẽ tạo mô sẹo trắng, mỏng bao xung quanh chỗ cắt Khoảng một tuần sau đó rễ sẽ

xuất hiện

Những ngày đầu cành giâm được đặt trong bóng râm Sau đó, chuyển dần ra sáng, nhưng không được để dưới ánh sáng cao Trong 10 ngày đầu không cần bón phân Bắt đầu bón phân khi những rễ đầu tiên xuất hiện (Nguyễn Thị Hồng Vân, 2007)

2.5.3 Nhân giống in vitro

2.5.3.1 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu xây dựng quy trình vi nhân giống Trạng nguyên (Nguyễn Thị Hồng Vân, 2007) đã nuôi cấy chồi ngọn và đốt thân trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l

để tạo cụm chồi Sau 4 tuần nuôi cấy, chuyển mô sẹo đặc sang môi trường MS bổ sung

BA 0,5 mg/l, nuôi cấy trong điều kiện lỏng để tăng trưởng cụm chồi, thí nghiệm đạt được

43,33 chồi/cụm Nuôi cấy lớp cắt ngang lóng thân và lá in vitro trên môi trường MS bổ

sung BA ở hai nồng độ 0,8 – 1,0 mg/l và NAA ở các nồng độ 0,0 – 0,1 – 0,3 mg/l (đối với lóng thân); BA ở hai nồng độ 0,8 – 1,0 mg/l và NAA ở hai nồng độ 0,1 – 0,3 mg/l (đối với mẫu lá) Sau 4 tuần nuôi cấy, mô sẹo hình thành trên mô cấy Nuôi mô sẹo trên môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l kích thích sự hình thành phôi Phôi trưởng thành trên môi trường MS và MS bổ sung BA 0,5 mg/l Chồi tạo rễ trên môi trường MS 1/3 Tỉ

lệ sống sót của cây con ngoài vườn ươm là 60%

Nghiên cứu sự phát sinh phôi sinh dưỡng trên cây Trạng nguyên (Quách Thị Hải

Bình và ctv, 2008) đã nuôi cấy lớp cắt ngang lóng thân, lá và cuống lá in vitro trên môi

trường MS bổ sung BA 0,2 mg/l và NAA 1 mg/l (đối với mẫu lóng thân); BA 0,2 mg/l và NAA 0,5 mg/l (đối với mẫu lá và cuống lá) Sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo hình thành trên mẫu cấy Phôi sinh dưỡng xuất hiện khi nuôi cấy các mô sẹo này trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l kết hợp với 10 g/l mannitol và 1 g/l peptone Phôi sinh dưỡng nảy mầm bình thường trên môi trường MS Tiến hành nuôi cấy lỏng lắc mô sẹo lóng thân trên môi trường MS bổ sung BA 0,2 mg/l và NAA 1 mg/l Sau 12 ngày nuôi cấy, dịch huyền phù được lọc qua lưới lọc kích thước 500 µm Sau 4 tuần nuôi cấy, dịch lọc nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,1 mg/l kết hợp với 10 g/l mannitol và 1 g/l peptone xuất hiện

các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi Phôi sinh dưỡng hình thành khi chuyển các cụm

mô sẹo này sang môi trường MS bán rắn

Như vậy, các nghiên cứu trong nước vẫn chưa tạo được cây Trạng nguyên in vitro

hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất để tạo nguồn giống cây ban đầu đáp ứng yêu cầu cây giống phụ vụ cho nhu cầu sản xuất

2.5.3.2 Nghiên cứu trên thế giới

Nuôi cấy dịch huyền phù phôi sinh dưỡng cây Trạng nguyên (Preil và Beck, 1991) Chồi đỉnh (0,5 mm) được nuôi cấy trên môi trường MS agar bổ sung CPA 0,2 mg/l và BA 0,2 mg/l Sau 2 – 3 tuần nuôi cấy, chuyển mô sẹo sang bình erlen để nuôi cấy lỏng trên môi trường MS cùng nồng độ với tốc độ lắc 90 vòng/phút Phôi hình thành trên môi trường MS lỏng chứa CPA 0,2 mg/l và BA 0,2 mg/l Bổ sung thêm NAA 0,2 mg/l sẽ cho kết quả tốt hơn Phôi hình cầu được tách ra và đặt trên giấy lọc trong môi trường MS chứa BA 0,05 mg/l Phôi nảy mầm trên môi trường MS

Nghiên cứu vi nhân giống Trạng nguyên từ chồi ngọn và đốt thân (Shyamal K Roy và M Ali Jinnah, 2001), đã tiến hành nuôi cấy chồi ngọn và đốt thân trong môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l, Kn 0,5 mg/l và 15% nước dừa, mẫu cấy phát triển chồi Bổ sung 100 mg/l casein hydrosylate vào môi trường giúp kéo dài chồi Chồi ra rễ trong môi trường MS ½ bổ sung IBA 1,0 mg/l và IAA 0,5 mg/l Tỷ lệ sống của cây con ngoài vườn ươm là 85% Sau 6 tháng, các cây này ra hoa

Nghiên cứu vi nhân giống Trạng nguyên qua con đường phát sinh phôi sinh dưỡng (Yogesh T Jasrai và ctv (2003) Đốt thân mang chồi ngủ được nuôi cấy trên môi trường

MS bổ sung 2iP 9,8 µM và NAA 2,69 µM cho cảm ứng tạo mô sẹo màu hồng có khả năng sinh phôi Nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 2iP 9,8 µM và NAA 0,54 µM kích thích sự trưởng thành của phôi Phôi trưởng thành nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 2iP 9,8 µM và NAA 4,03 µM Khi chuyển mô sẹo có khả năng sinh phôi sang môi trường MS lỏng bổ sung 2iP 9,8 µM và NAA 0,54 µM, phôi già yếu và chết Cây con chuyển ra vườn ươm được trồng trong giá thể perlite: đất (1: 3), che bằng nilon và tưới bằng dung dịch MS 1/4 Cách một giờ, phun sương nước cất để giữ ẩm Quan sát có 87% cây con phát triển bình thường, không có biến dị hình thái

Nghiên cứu sự phát sinh phôi sinh dưỡng in vitro cây Trạng nguyên (J L Clarke và

ctv, 2008) Đốt thân dày 1 – 1,5 mm được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP 0,2 mg/l và CPA 0,2 mg/l và 30 g/l đường từ 8 – 10 ngày, cho cảm ứng tạo mô sẹo Nuôi

18

cấy mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,3 mg/l và 2iP 0,15 mg/l và 30 g/l đường để kích thích khả năng phát sinh phôi sinh dưỡng Và phôi sinh dưỡng xuất hiện sau

12 tuần được chuyển sang môi trường MS có bổ sung BAP 0,05 mg/l và 30 g/l đường, kích thích sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng Phôi trưởng thành tạo rễ và cây con trên môi trường MS½ có bổ sung IAA 2 mg/l và 20 g/l đường Cây con chuyển ra vườn ươm trồng ở nhiệt độ 22oC

d

c

b

a

Hình 2.13 Sự phát sinh phôi sinh dưỡng in

vitro cây Trạng nguyên (a) Phôi hình cầu

xuất hiện từ cụm mô sẹo (theo mũi tên); (b) Phôi hình tử diệp; (c) Cây con phát triển từ phôi sinh dưỡng; (d) Cây con ngoài vườn ươm

(theo J L Clarke và ctv, 2008)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 02 năm 2009 đến tháng 07 năm 2009, tại Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

3.2 Vật liệu

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm

Giống Trạng nguyên lùn đỏ, được mua tại cửa hàng hoa tươi trên đường Trường Chinh, quận Tân Bình, Tp Hồ Chí Minh

3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường dinh dưỡng khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962), MS ½ (là môi trường MS có thành phần đa lượng giảm đi một nửa)

Bổ sung thêm các thành phần: Đường sucrose: 30 g/l; Agar (Hải Phòng): 8 g/l; Các chất điều hòa tăng trưởng tùy theo từng thí nghiệm: BA (Benzyl adenine), NAA (Naphthyl acetic acid), IBA (Indol butyric acid),GA3 (Gibberellin acid)

Môi trường được chỉnh pH = 5,7 ± 0,1 (chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N) Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 121oC và áp suất 1 atm trong thời gian 25 phút GA3 được bổ sung vào môi trường sau khi hấp khử trùng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng mẫu cấy

20

mẫu với cồn 70o trong 30 giây, lắc mẫu với vitamin C trong 15 phút, sau đó lắc mẫu với dung dịch javel 480 chlor được pha loãng với nước cất theo các nồng độ khác nhau với thời gian xử lý khác nhau Sau các bước khử trùng phải rửa lại bằng nước cất đã được hấp khử trùng ở autoclave 3 – 5 lần, cắt bỏ những phần bị ăn mòn rồi cấy vào môi trường MS

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, gồm 6 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và ở mỗi lẫn lặp lại cấy 10 mẫu, mỗi mẫu cấy vào một ống nghiệm Tổng số mẫu thực hiện trong thí nghiệm này là

Tỷ lệ mẫu sạch (%): (Tổng số mẫu sạch / tổng số mẫu cấy) × 100

Tỷ lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / tổng số mẫu cấy) × 100

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên khả năng

nhân chồi của cây Trạng nguyên in vitro

Mục đích: Xác định nồng độ kết hợp của BA và NAA thích hợp lên quá trình

nhân chồi Trạng nguyên Nhân nhanh số lượng chồi Trạng nguyên in vitro tạo ra số

lượng lớn để làm nguồn mẫu cấy cho thí nghiệm tiếp theo