nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa ban (bauhinia variegata l.)

Hiện nay việc ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất đang được phổ biến tại Việt Nam và việc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng triệt để, nhằm nhân nhanh các

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐOÀN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOA BAN

(BAUHINIA VARIEGATA L.)

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, năm 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực chưa từng được công bố trong một công trình khoa học nào

Tác giả Đoàn Tiến Dũng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này

Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – K , Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Đoàn Tiến Dũng

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các từ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY HOA BAN (Bauhinia variegata L.) 3

3

1.1.2 Chi Bauhinia 9

1.1.3 Vai trò của Ban đối với đời sống 10

1.2 IN VITRO 10 1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thức vật 10

1.2.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

IN VITRO 16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới 16

1.3.2 Nhân giống cây thân gỗ bằng phương pháp in vitro ở Việt Nam 18

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

21

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

21

2.1.3 Phạm vi nghiên cứu 22

2.1.4 Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu 22

22

2.2.1 Giai doạn tạo mẫu vô trùng 24

2.2.2 Giai đoạn nhân nhanh 24

2.2.3 Giai đoạn cây hoàn chỉnh 28

Chương 3: 32

32

IN VITRO CÂY BAN 33

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của k 33

36

IN VITRO 38

3 đến khả năng kéo dài chồi và ra rễ của Ban 38

nuôi cấy mô 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

1 Kết luận 44

2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

NAA : α -Napthalene acetic acid

THT : Than hoạt tính

CV : Sự sai khác giữa các công thức LSD : Độ tin cậy của thí nghiệm

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ Javen đến ty lệ tạo mẫu sạch nấm,

vi khuẩn sau 15 ngày nuôi cấy 32Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng Kinetin đến hệ

số nhân nhanh chất lượng chồi Ban sau 45 ngày 34Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến quá trình nhân nhanh

và chất lượng của chồi Ban sau 45 ngày 35Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng Kinetin đến nhân

nhanh, chất lượng chồi từ nách lá mầm của hạt Ban sau 45 ngày 36 Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BAP đến hệ số

nhân nhanh chất lượng chồi từ nách lá mầm hạt Ban sau 45 ngày 37Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo

dài và chất lượng chồi Ban sau 45 ngày 39Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ và chất

lượng rễ của chồi Ban sau 45 ngày kể từ ngày nuôi cấy 39Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của loại giá thể thích hợp đến khả năng sống,

sinh trưởng của cây Ban nuôi cấy mô sau 60 ngày nuôi cấy tính từ giai đoạn tiền chồi sau 30 ngày đưa ra vườn 41

DANH MỤC HÌNH

363.2

383.3

của chồi Ban 40Hình 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sống của

cây Ban nuôi cấy mô 41

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Ban trắng (Bauhinia variegate L.) có nguồn gốc ở Đông Nam Á và

phát triển trải dài từ Ấn Độ đến Trung Quốc Tuy có kích thước nhỏ nhưng Ban là một trong những loại cây phổ biến được trồng để ngăn cản hiệu ứng

nhà kính tại Ấn Độ [8] Ban trắng (Bauhinia variegate L.) là một loại ban sinh

trưởng và phát triển mạnh ở khu vực Tây Bắc Việt Nam, cây rụng lá theo mùa

và có hoa màu trắng Cây Ban có khả năng thích nghi tốt, sinh trưởng tốt trong đất, nhưng không chịu được nghèo dinh dưỡng Đã được chọn trồng ở một số tuyến đường ở Hà Nội từ đầu năm 1960 [19]

Hoa Ban còn có tác dụng làm thuốc, lá cây ban dùng để chống khuẩn rất tốt và có thể sử dụng làm thực phẩm Ngoài màu sắc và kiểu dáng hoa đẹp, cây Ban còn có một giá trị như một loại thảo mộc, và là đặc trưng của núi rừng Tây Bắc [19] Nhưng nạn phá rừng bừa bãi, đốt rừng làm nương rẫy đã làm giảm đáng kể số lượng quần thể thực vật này Dù khả năng sinh sản ở mức cao nhưng khả năng phát tán và nảy mầm của hạt kém, và việc nhân giống bằng phương pháp thủ công như gieo hạt, dâm cành, chiết cành… đạt hiệu quả nhân không cao

Hiện nay việc ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất đang được phổ biến tại Việt Nam và việc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng triệt để, nhằm nhân nhanh các giống cây quý hiếm có giá trị với số lượng lớn, chất lượng cao

Xuất phát từ những phân tích trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn

thạc sĩ là: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa Ban (Bauhinia variegata L.) ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được quy trình nhân giống in vitro cây hoa Ban (Bauhinia

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tối ưu phương pháp khử trùng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn ở cây Ban 3.2 Xác định thành phần môi trường nuôi cấy, môi trường tạo đa chồi và môi trường ra rễ cây Ban

3.3 Xác định loại giá thể thích hợp đến sinh trưởng, phát triển của cây con

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY HOA BAN (Bauhinia variegata L.)

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, của cây hoa Ban

Cây Ban (Bauhinia variegate) có nguồn gốc ở Đông Nam Á Việt Nam điểm danh được 40 loài, gồm nhiều loài đại mộc , có khi cao hơn 16- 17m , tiểu mộc 1- 7m hay dây leo to, nhỏ…

Loài Ban phân bố ở Mianma, Tây Bắc Thái Lan, Nam Trung Quốc, ở Lào và Việt Nam Ban cũng sinh trưởng và phát triển nhiều ở các xứ nhiệt đới, thường gặp trong các khu rừng rụng lá từ độ cao 500 m tới 1500

m, từ Sơn La, Lai Châu đến Nghệ An Hoa ban là một loại cây cảnh phổ biến

ở nhiều nơi trong khu vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, được trồng vì

có hoa tỏa mùi thơm Tuy nhiên, tại một số khu vực thì nó lại là một loài xâm hại do hợp thủy thổ và thích nghi với môi trường sống mới Tại Việt Nam, nó sinh trưởng chủ yếu ở khu vực Tây Bắc Bắc Bộ Có trồng ở các thành phố Hà Nội, Hồ chí Minh [8]

Theo Phạm Hoàng Hộ hoa Ban ở Việt Nam bao gồm khoảng 40 loài đã

được định danh, một số loài thường thấy như [8]:

Bauhinia monandra Kurz (móng bò đơn hùng); cây đại mộc, cao đến

15 mét, nhánh ngang Lá xanh tươi, có lông mặt dưới; 9 – 12 gân từ đáy; lá bẹ hình gươm, cao 1cm Chùm đứng, dài 8 – 10 cm; đài hình tàu; cánh hoa hường hay vàng có đốm đỏ, cờ vàng có đốm đỏ; tiểu nhụy thụ 1, tiểu nhụy lép

9, nhỏ Trái dẹp, dài 20 cm, có mũi; hột đen, láng, to 1 cm Trồng nhiều ở Sài Gòn, hoa có chấm, mầu hồng hoặc đổ kem Nguồn gốc Châu Mỹ nhiệt đới

Bauhinia purpurea L (móng bò đỏ); cây tiểu mộc 2 – 6 m; nhánh

non có lông Lá to, không lông, gân từ đáy 9 -11 Tản phòng to, ít hoa; hoa

to, thơm, đỏ tươi hoặc sọc đỏ đậm, đẹp; đài nõa sào có lông Trái dẹp, 15-

25 x 2 cm; hột 12 – 15, rông 12 – 13 mm Thường trồng ở Bình Nguyên (vì hoa to đẹp) Nụ ăn như rau; vỏ trị tê thấp, kinh phong, bướu ở bao tử, hoa giúp tiêu hoa

Bauhinia pottsii G.Don var Subsessills (Craib) de Wit; tiểu mộc hay

đại mộc nhỏ; nhánh non có lông mịn, rồi không lông Phiến lá xoan tròn, chẻ đến 1/3, to 9 – 14 x 10 – 15 mm, đáy hình tim, có lông nhung màu nâu, gân từ đấy 11 – 15 Chùm dày, dài đến 10 cm; lá hoa 3 – 5 mm; cọng 1 – 1,5 cm, mang tiền diệp ở giữa; cánh hoa trắng, dài 4 – 6 cm, cánh hoa sau có bớt vàng; tiểu nhụy thụ 3; noãn sào có lông Trái rộng ở chót, có mỏ; hột 4 – 6, tròn dẹp, to 1 – 1,5 cm Nguồn gốc từ Cam bốt

Bauhinia variegata L (móng bò sọc; Variegate Bauhinia, Orchid Tree);

Đại mộc 6 – 15 m; nhánh non có lông mịn Lá rụng theo mùa; phiến xanh nhạt, mặt trên không lông, mặt dưới ít lông Chùm dài đến 20 – 30 cm, hơi thòng; hoa to, đài là tàu có 5 răng, có lông; cánh hoa trắng hay đỏ, hơi tím có sọc đậm, dài 5 cm; tiểu nhụy lép cao 1 cm Trái dẹp, to 15 – 30 x 2,5 cm; hạt

9 – 10, to 10 – 15 mm Mọc ở Lai Châu, Nghệ Tĩnh; Trồng ở Hà Nội, Sài Gòn Hoa ăn được, rễ trị bướu; vỏ và hoa trị kiết lị, bệnh da

Bauhinia acuminata L (móng bò nhọn, móng bò trắng; White

Bauhinia, Orchid Tree) Tiểu mộc cao đến 3 m Lá có lông xám mặt dưới, gân

từ đáy 7 – 11; lá bẹ vào 1 cm Chùm 3 – 10 hoa; hoa trắng, nụ ngọn, có lông; đài hình tàu; cánh hoa 5, gần bằng nhau, dài 4 – 6 cm; tiểu nhụy 10, gần như bằng nhau Trái dẹp, to 11 x 1,5 cm; hạt 5 – 11, tròn dài, dẹp, to 7 mm Gốc Malaixia, Trồng ở Hà Nội, Biên Hòa, Sài Gòn

Bauhinia hirsuta Weimann (móng bò lông phún) Tiểu mộc, cao 3 m;

nhánh non có lông màu nâu Phiến lá tròn, chẻ sâu 1/4 – 1/3, đấy hình tim, gân 7 – 9, mặt trên không lông, mặt dưới có lông màu nâu; lá bẹ hình kim dài

1 mm Chùm ngắn ở nách lá; nụ hình bắp; đài hình tàu; cánh hoa trắng, dài 3 – 4 cm; tiểu nhụy thụ 10; noãn có cọng, gần như không lông Trái 6 -9 cm,

chót cong; hột 5 – 10, to 8 mm, dẹp Trồng ở Hà Bắc, Bình Trị Thiên, Đắc Lắc, Thuận Hải, Sông Bé

Bauhinia tomentosa L (móng bò vàng; Yellow Bauhinia) Tiểu mộc cao

3 m; nhánh mảnh, có lông mịn Lá không lông, mặt dưới hơi mốc; lá bẹ hình kim cáo 8 mm Chùm ít hoa; hoa vàng; cọng có 2 tiền diệp nhỏ; đài hình tàu; cánh hoa vàng tươi, cờ có 1 bớt đỏ đậm; tiểu nhụy thụ 10; noãn sào có và lông trắng Trái dài 12 cm; hột 4 – 12, dẹp, to 1 cm Trông ở Sài Gòn Trị nọc bọ cạp, rắn; rễ trị sưng gan; nụ trị kiết; trái lợi tiểu

Bauhinia racemosa Lamk (móng bò chùm) Đại mộc, cao đến 15 m;

nhánh thòng, có lông nhưng Lá có phiến hình thận, dài 5 – 10 cm, mặt trên không lông, mặt dưới như nhưng xám, gân từ đáy 7 – 9; lá bẹ tam giác, nhỏ, mau rụng Chùm thòng, dài 15 cm, thưa, có lông, cọng 5 mm; nụ hình thoi, cao 5 – 8 mm; đài hình tàu; cánh hoa vàng, thon hẹp; tiểu thụy thụ 10; noãn sào không lông Trái hơi cong, không lông; hạt 10 – 20, to 1cm Có ở Rừng Dầu Bình Nguyên, Đắc Lắc, lá trị nhức đầu, sốt rét

Bauhinia viridescens Desv (móng bò xanh) Tiểu mộc, đứng cao 4 – 6

m; nhánh không lông Lá có phiến hai thùy, đáy hình tim, mỏng, lúc khô nâu nhạt, mặt trên không lông, mặt dưới có lông ngắn ở gân; lá bẹ tam giác có tơ mũi Chùm dài 5 – 15 cm; cọng hoa 2 – 3 mm; nụ bầu dục hay thon; hoa tạp pha xanh; tiểu nhụy 10; noãn sào có cọng, có lông Trái 5 – 7 x 0,7 – 1 cm; hạt 5 – 10 dẹp Có nhiều ở Hà Sơn Bình, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Thuận hải Quả và lá ăn được

Bauhinia malabarica Roxb (tai voi) Đại mộc cao đến 17 m; nhánh

không hay có lông Lá không lông, mốc bạc mặt dưới gân từ đáy 9 – 11 Chùm 2 – 5 cm; cọng 2 cm; nụ tròn dài; ống đài rất ngắn; cánh hoa trắng, dài 2 cm; hoa đực với 10 tiểu ngụy thụ; noãn sào có lông Trái như rắn, dài

25 cm, rộng 2 cm; hạt 10 – 30 mm Thấy ở những nơi rừng dày, rừng thay

lá, từ Quảng Trị đến Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa Lá non chua, trâu bò thích ăn trái khô

Bauhinia saccocalyx Piere (Móng bò đài túi) Đại mộc Lá có lông hoe

dày mặt dưới, gân từ đấy 9 – 11; cuống 2 – 3 cm, có lông Chùm 2 -3 cm, có lông hoe; đài to, lá đài rời; cánh hoa trắng hay ửng hồng, dài 13 mm, không lông; tiểu nhụy 10; noãn sào không lông Trái to 11 x 2,5 cm; hạt 3 – 4, tròn dẹp, to 12 – 15 mm Có ở Quảng Trị Lá non và hoa ăn được

Bauhinia clenensiorum Merr (móng bò mấu) Dây leo cao; nhánh non,

mặt dưới lá, phát hoa có lông như nhung da đỏ Lá có phiến đơn không chẻ, chót có mũi 2 – 3 mm, xoan rộng, mặt trên đen, gân từ đấy 7 – 9; cuống ngắn

5 -7 mm Chùm 5 – 10 mm, có 2 mấu, có lông đỏ; lá hoa hẹp, 6 – 8 mm; cọng

15 mm, nụ xoan nhọn; đé 2,5 cm; đài 3 – 5 tai; cánh hoa cao 1cm; tiểu nhụy thụ 3, lép 7; noãn sào không lông Trái dẹp, mỏng, đen láng như dầu hắc, dài

22 – 25 cm, hạt nhỏ Ven rừng: Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà nẵng

Bauhinia cardinale Pierre ex Gagn (móng bò đỏ, mấu hăng, mấu tràm);

dây trườn, to; mấu nhỏ Lá đơn nguyên; gân lồi 2 mặt Chùm đứng dài 40 –

50 cm, lá hoa nhỏ, dài 1 – 1,5 cm, trục đỏ; cọng hoa đỏ; đài đỏ, cao 1,5 cm; cánh hoa 5, dài 2,5 cm, có lông dày, vàng mặt trong; tiệu nhụy 3 thụ có chỉ dài 3,5 cm, 7 lép; noãn sào trên cọng, có lông dày Trái dẹp, to 12 – 15 x 3 – 4

cm, như nhung đỏ đều; hạt 5 – 7, xoan dẹp, to 1 x 1,5 cm Rừng dày dưới

1500 m; từ Vĩnh Phú qua Đà Lạt, Tây Ninh, Định Quán, đến Minh Hải Vỏ cây làm dây thừng [8]

Bauhinia scandens L (móng bò leo); dây leo to; mấu quấn; thân già

dẹp, dạng thang của khỉ Phiến đa dạng, đơn, chót nguyên, chẻ cạn hoặc sâu, mặt trên có ít lông, mặt dưới ít hay không lông Chùm kép; hoa nhỏ, nhiều; lá hoa như tơ; cọng 2 – 4 mm; tiểu nhụy thụ 3, lép 2; noãn sào không lông Trái xoan, dẹp, láng, dài 3 – 4 cm; hột 1 – 3 tròn dài dẹp; rộng

6 mm Rừng xanh, ven suối, rừng bán thay lá; 1 – 700m từ Sơn La đến Thuận Hải Thân làm thừng tốt

Bauhinia curtissi Prain (móng bò Curtis); tiểu mộc hay dây leo to, có

mấu; nhánh non, có lông xám hay sét Phiến lá có chốt nguyên hay chẻ ít đến 1/5, láng, không lông mặt trên, không hay có ít lông mặt dưới, gân từ đáy 5 – 7 Chùm 10 – 20 cm; trục có lông xám xám; đài đo 2 – 3 phiến lông; cánh hoa xanh; tiểu nhụy thụ 3, lép 2; noãn sào không lông Trái tự khai thành mảnh mỏng, dài 5 – 6 cm, rông 1,5 cm; hột 2 – 6, dẹp, to 1 cm Ven rừng, đến 500 m: Bình Trị Thiên, Phú Khánh, Thuận Hải đến Đồng Nai Thân cây làm thừng tốt

Bauhinia championii Benth (móng bò Champion); tiểu mộc leo; nhánh

non có lông xám hay hoe Lá có phiên nguyên hay lõm ở chót, mặt dưới trắng với lông nằm Chùm dài 6 – 20 cm; nụ xoan, cao 3,5 – 4 mm; cánh hoa trắng, rộng 2 – 3 mm; tiểu nhụy thụ 3; noãn sào có cọng lông Trái dẹp, mỏng, không lông; hạt 2 – 5 mm có lông xám Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Sơn Bình

Bauhinia bassacensis Pierre ex Gagn (móng bò Hậu Giang); dây leo to;

nhánh non có lông nâu và có móc Lá không lông hay mặt dưới có lông sét; cuống 4 – 7 cm Tản phòng có lông vàng; hoa vàng tái; cánh hoa 5, đài 3 cm, rộng 7 – 9 mm, trên cọng dài 1 – 2,5 cm; tiểu nhụy thụ 2 – 3, lép 7 – 8; noãn sào có cọng, có lông Trái dẹp, to 9 x 3 cm; hạt dẹp, to 1 cm Rừng dày và bán thay lá, thường gần biển: Hoàng Liên Sơn, Vũng Tàu, Phú Quốc [8]

Bauhinia bracteata Benth (cánh dơi); dây leo to; nhánh có lông xám

Phiến xoan tròn, chẻ đến 1/3, to 3 – 15 x 5 – 14 cm, mặt dưới có lông ở gần; gân từ đáy 9 – 11; lá bẹ đến 1 cm Chùm hay chùm tụ, tán nhiều hoa; cọng dài; nụ nhọn; cánh hoa xanh; tiểu nhụy thụ 2 – 3, lép 5, noãn sào cso lông nhung Trái có mảnh dày, nâu đậm, to 15 x 5 cm, hạt 2 – 8, tròn dẹp, to 15

mm Ven rừng, dựa tường: từ Lạng Sơn đến Minh Hải, thân làm thừng

Bauhinia involucrans Gagn (móng bò tông giao); dây leo; nhánh non

ít lông Lá có phiến chẻ sâu đến 1/3, dài 7 – 14 cm, mặt trên không lông, mặt dưới gần như không lông, gần từ đáy 9 – 11 Chùm tụ tán dài đến 20 cm, có lông mịn nâu đỏ; lá hoa thon, dài 1 cm; cọng 2 – 3 cm mang 2 tiền diệp to bao nụ; đài 5 thùy; cánh hoa hường, trên cọng 8 mm; tiểu nhụy thụ 3, chỉ hường, có lonog, lép 7; noãn sào 1 cm, có lông đo đỏ, nõa 5 -6 Dựa rạch

800 m: Bảo Lộc

Bauhinia lakhonensis Gagn (móng bò Lakhon); tiểu mộc đứng hay leo;

nhánh gần như song đỉnh, có lông sét Lá có phiến tròn hình thận, có lông rụng như nhung; lá bẹ hình phăng, mau rụng Hoa trắng, đế hoa dài 1,5 – 2 cm; cánh hoa không lông, dài 8 mm; tiểu nhụy thụ 3, lép 5 – 7; noãn sào không lông Trái mỏng, mảnh không quấn, dài 10 – 12 cm Ven rừng, dựa đường, bình nguyên: Quảng Trị Rễ dùng cho phụ nữ mới sinh con

Bauhinia corymbosa Roxb (móng bò tản phòng); dây leo to, có mấu;

nhánh non có lông sét rồi không lông Lá có phiến tròn, dài 2 – 3,5 cm, chẻ cạn hay sâu gần đến đáy, mặt trên không, mặt dưới có lông sét; cọng 1 cm; đài có 5 tai xụ; cánh hoa trắng, cao 10 – 13 mm; tiểu nhụy thụ 3, lép 7; noãn sào không lông Trái dài 10 – 17 cm, mảnh mỏng, hạt nhiều, tròn dài 7 mm

Có ở Quảng Ninh

Bauhinia glauca Benth (móng bò mốc); Dây leo có mấu; nhánh nâu đỏ,

láng chói, đen lúc khô Phiến bầu dục, chót có 2 thùy cạn tròn, mỏng, mặt dưới mốc, lúc khô cả 2 mặt màu nâu gỗ; hoa có lá hoa và tiền diệp nhọn dài 1 – 1,2 cm; nụ xoan; lá đài 3 – 5; cánh hoa trắng, cao 13 mm, có lông hoe mặt ngoài; tiểu nhụy thụ 3 – 5; noãn sào không lông Trái dày, 15 – 25 x 3 – 3,5

cm, không lông, mỏng; hạt 10 – 20 mm Ven rừng, rừng còi, đến 1500m, từ Vinh đến Phan Rang, Bảo Lộc

Bauhinia touranensis Gagn (móng bò Đà Nẵng, làu máu); Tiểu mộc

leo; móc nhỏ Lá xoan rộng, chót có 2 thùy cạn, ít lông

Ngoài những loài dạng mộc, chi Bauhinia còn có những loài dạng leo như: Bauhinia khasiana Bak (Quạch, Mấu)

Bauhinia oxyepala Gagn (Móng bò đài nhọn)

Bauhinia penicilliloba Pierre ex Gagn (Móng bò thùy cọ)

Bauhinia championii Benth (Móng bò champion)

Bauhinia godefroyi Gagn (Móng bò Godefroy)

Bauhinia wallichii Mcbride (Móng bò Wallich)

Bauhinia saigonensis Pierre ex Gagn (Móng bò Sài Gòn)

Bauhinia carcinophylla Merr (Càng cua)

Bauhinia coccinea

Bauhinia mastipoda Pierre ex Gagn (Móng bò đỏ)

Bauhinia lorantha Pierre ex Gagn (Móng bò thừng)

Bauhinia rubro-villosa K & S.S Lars (Móng bò lông đỏ)

Bauhinia pyrroclada Drake del Cast (Móng bò lưa)

Bauhinia ornata Kurz (Móng bò diện) [8]

1.1.2 Chi Bauhinia

(Angiospermatophyta), lớp Hai lá mầm (Dicotyledoneae), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), Bộ Đậu (Fabales), họ Đậu (Fabaceae), phân họ Vang (Caesalpinioideae)

Loài Bauhinia variegata L (Móng bò sọc; Variegate Bauhinia, Orchid Tree) thuộc chi Bauhinia tên thường gọi là Ban, đặc trưng cho rừng Tây bắc,

hoa nở vào mùa xuân trắng rừng, trông rất đẹp mắt Cây Ban là loại cây đại mộc, cây trưởng thành cao từ 6 đến 15 mét, nhánh non có lông mịn Lá rụng theo mùa, phiến lá có màu xanh nhạt, mặt trên của lá không có lông, mặt dưới

ít lông Chùm hoa dài đến 20 – 30 cm, hơi thòng, có hoa to, đài hoa hình tàu

có 5 răng, có lông, cánh hoa trắng hay đỏ, hơi tím có sọc đậm, dài khoảng 5

cm, tiểu nhụy lép cao 1 cm Trái dẹp, to 15 – 30 x 2,5 cm; kích thước hạt khoảng 9 – 10, to 10 – 15 mm Ngoài núi rừng Tây Bắc như Lào Cai, Lai Châu; gần đây được trồng ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh với mục đích làm đẹp cảnh quan đô thị [19]

1.1.3 Vai trò của Ban đối với đời sống

Cây ban có vai trò quan trọng trong đời sống, gỗ dùng đóng các đồ đạc thông thường, cây chứa gôm, vỏ chứa tanin, hạt chứa dầu béo khoảng 16%

Rễ có vị hơi chát, hơi mát; có tác dụng chỉ huyết, kiện tỳ Vỏ thân đắng, chát, tính bình; có tác dụng kiện tỳ táo thấp Lá nhạt, tính bình; có tác dụng nhuận phế chỉ khái, hoàn tả Hoa có vị nhạt, tính mát; có tác dụng tiêu thũng, hoa ăn được, có thể dùng làm thực phẩm…

Ở Ấn Ðộ, vỏ được xem như có tác dụng gây biến đổi, bổ; hạt có tác dụng làm đông máu, vỏ cũng có thể dùng làm thuốc hàn vết thương, chữa bệnh ngoài da, loét và tá tràng; chồi khô dùng trị lỵ và trĩ, ỉa chảy và trị giun; nước sắc rễ trị đầy hơi trướng bụng và rễ trị nọc rắn cắn

Ở Trung Quốc, rễ dùng trị lạc huyết, ăn uống không bình thường Vỏ

rễ trị ăn uống không bình thường, viêm dạ dày ruột cấp tính Lá trị ho, đái khó (tiện bí)

Ngoài ra Ban cũng như những loài cây rừng khác, góp phần phủ xanh diện tích rừng Tại những thành phố lớn ở nước ta như Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh… Ban đc trồng trên các tuyến đường, làm đẹp cảnh quan đô thị và làm giảm lượng khói bụi ô nhiễm…

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thức vật

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

[1]

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân hoá Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định là nhờ vào sự phân hoá [6]

Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhân các chức năng khác nhau trong cơ thể

Quá trình phân hoá có thể diễn ra như sau:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dẫn → Tế bào phân hoá chức năng

Khi tế bào phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể trở lại giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có

một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen mới lại ức chế hoạt động Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẻ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [13]

1.2.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường Murashige và Skoogs (MS) được sử dụng

Ngoài thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin của môi trường

cơ bản ban đầu thì nước dừa thông thường được bổ sung để tăng cường sự hình thành mô sẹo (callus), với phạm vi sử dụng từ 10 - 25% Với mẫu đưa vào nuôi cấy ban đầu có thể dùng 20% và sau khi xảy ra sự phân hóa cấy chuyển có thể giảm xuống còn 10% [24]

Một trong những nhân tố quan trọng nữa là cytokinin Tuy nhiên tùy theo đối tượng mẫu, ngồng hoa, mô lá hay tính trạng của mẫu (đã cấy chuyển nhiều lần hay chưa) mà ta sử dụng chủng loại, nồng độ cho thích hợp với từng loại mẫu, từng thời kì, vì đa số các loại thực vật là tương đối nhạy cảm với sự

có mặt của các chất điều tiết sinh trưởng bổ sung vào trong môi trường đặc biệt với mẫu đã qua một số lần cấy chuyển [24]

Việc bổ sung các chất phụ gia khác (dịch chiết của một số loại như: khoai tây, chuối, đu đủ, cà rốt…) là hết sức có ý nghĩa đối với quá trình nhân

giống in vitro

1.2.2.2 Các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng,

chúng là yếu tố quan trọng nhất trong điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây hoàn chỉnh

Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng là Auxin,

Cytokinin, Gibberelin, Ethylen

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây [1]

Cytokinin

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - benzyl aminopurin (BA) Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [1]

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng

sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ

sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình tạo thành ty thể (mitos) và cảm ứng cho

sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá

trình chuyển pha trong ty thể và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển [1]

Gibberelin

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá

vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường Về sau, các nghiên cứu khám phá ra là trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3, A4 Do gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác [1]

Trong cây gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau

đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong phloem và xylem

Ethylen

Ethylen là chất điều hoà sinh trưởng dạng khí Ethylen có rất nhiều tác dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật Đã từ lâu vai trò của ethylen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng dụng nhiều Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethylen lên sự kéo dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và xuống của Auxin [1]

1.2.2.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), bổ sung agar 7g/l, đường saccarose 30g/l

Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm

Các chất hữu cơ khoai tây, cà rốt cũng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm

Giá trị pH của môi trường nuôi cấy: 5,8 - 6,0

Thể tích dung dịch dinh dưỡng trong bình nuôi cấy là 50 – 70 ml/ bình

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,1 atm trong 20 phút

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới

Nuôi cấy mô tế bào đã được thí nghiệm ở thế kỷ XVII nhưng chỉ thành công sau những sưu tầm về môi trường nuôi cấy của White và Gautheret [13]

Trung Quốc là một nước thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô cho các loài cây thân gỗ Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ được nuôi cấy như: Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (cây Hông) Là một trong những nước ứng dụng sớm và thành công nuôi cấy mô tế bào vào trồng rừng trên diện rộng Đến nắm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, người ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và dòng lai được chọn lọc Những cây mô này được dùng như là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn ươm địa phương và dùng thẳng vào trồng rừng [25]

Hiên nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống được

áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng dòng vô tính Một số loài thông đã được nuôi cấy thành công đó là: Pinus nigra, P Caribeea, P Pinaster Có tới 30 loài trong số loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt được những thành công bước đầu, trong

đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh Trong số 30 loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô, có 4 loài được đưa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempviriens) ở Pháp, Thông P Radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P Taera và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [25]

Darus H Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường MS

có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Những chồi có chiều cao > 0,5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra

rễ là 40% [17]

Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính Kỹ thuật này đang được áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng [25]

Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona grandis) Gupta và cs (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm Perhtani đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử [10]

Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung quốc, các loài Bạch đàn ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Văn sam (Picea), Thông Ridiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribe (Pinus caribaea) và Thông lai [27]

Nitiwattanachai đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) Môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) + 10

µM BAP + 0,5 µM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) +

2 µM IBA + 1 µM NAA [25]

Cùng với cây Keo tai tượng, Hartney và cs (thuộc Division of Forest

Research) đã sản suất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro Môi

trường nuôi cấy được sử dụng là WPM +3% Sucrose + 0,8 agar + 1 µM BAP + 1 µM NAA Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250

C (± 40C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút [25]

1.3.2 Nhân giống cây thân gỗ bằng phương pháp in vitro ở Việt Nam

Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phú Ninh Phú Thọ, Công ty giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp… Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu

Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và Keo lai có năng suất cao Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Keo lai, Bạch đàn và một số cây rừng khác [10]

Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô Keo lai đã được giới thiệu khi tổng kết đề tài KH03.03 năm 1996 (Lê Đ nh Khả, 1996) trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu của Nguy n Ngọc Tân và cs (1996), Đoàn Thị Mai và cs đã

thực hiện nghiên cứu bổ sung cho một số dòng Keo lai đã được đánh giá và thu được một số kết quả như sau: khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 8 – 10 phút cho kết quả tốt Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nẩy chồi là BAP (2ppm) và BAP (2ppm) + Kn (0,5 ppm)

và môi trường MS là công thức cho mẫu vật đẻ chồi nhiều nhất Ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là: IBA (3ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80 – 92%) đối với BV10, BV29, BV32, BV33 Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV16 (65%), BV5 (50%) [16]

Dương Mộng Hùng tại trường Đại học Lâm nghiệp đã nghiên cứu

bằng nuôi cấy mô cho 2 loài Bạch đàn E camaldulensis và E uronphylla

từ cây trội của 2 loài đã được một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi

ra rễ tới 83,8% [16]

Mai Đình Hồng (1995) đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây bạch đàn dòng U6 là: môi trường nhân chồi (MS +3% đường + 4,5% agar + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trường tạo rễ (1/4 MS + 1,5% đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA) [16]

Đoàn Thị Nga, thuộc viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh – Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng PN2 Tác giả cho rằng, môi trường thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA Môi trường ra rễ tối ưu là 1/4 MS + 1 mg/l IBA [7]

Đoàn Thị Mai đã đề xuất môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng UE35 với chất khử trùng thích hợp là chất kháng sinh với nồng độ 4,5 mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian là 12 phút Môi trường là MS + BAP 0,5 mg/l + NAA 0,3 mg/l + các phụ gia khác [16]

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 V

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Hạt Ban (4 tháng kể từ ngày thụ phấn), hạt tốt, chắc, mẩy, không dị tật,

có đường kính từ 4 – 5 mm thu từ cây Ban

ng MS, bổ sung agar 7g/l, đường

Chồi non cây Ban sinh trưởng tốt, không sâu bệnh được

20 ngày tuổi, Chồi được cắt bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá Mẫu có chiều dài từ 1,5 – 3 cm, đường kính từ 2 – 3 mm mang 1 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 – 6

2.1.2

Hóa chất:

- Hóa chất khử trùng: Javen thương phẩm (chứa 0,5% NAOCl)

- Môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), bổ sung agar 7g/l, đường saccarose 30 g/l

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin, chất hữu cơ tự nhiên, than hoạt tính bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm

2.1.4 Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật – Khoa Sinh – Kĩ , Trường Đại học

Sư phạm- Thái Nguyên, từ tháng 6/2013 đến tháng 6/2014

tủ cấy vô trùng:

Khử trùng bằng hóa chất: sử dụng dung dịch NaOCl (nước Javen thương phẩm chứa 5% NaOCl) với nồng độ khác nhau và được bổ sung 1 – 2 giọt tween (làm giảm sức căng bề mặt) Hạt Ban được ngập hoàn toàn trong dung dịch NaOCl Khử trùng trong bình tam giác 500ml đã được hấp vô trùng, thường xuyên lắc đều bình tam giác đến hết thời gian khử trùng, sau đó tiến hành rửa hạt bằng nước cất và tiến hành tách lớp vở bên ngoài lấy phôi đem gieo vào bình môi trường đã được hấp vô trùng

Hạt Ban được gieo vào các bình môi trường hình tam giác 250 ml Nuôi cấy trong phòng nuôi cây của

2.2.1.2 Phương pháp theo dõi:

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Số mẫu nhiễm (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu (mẫu)

Tỷ lệ mẫu không nhiễm (%) =

Số mẫu không nhiễm(mẫu)

x 100%

Tổng số mẫu (mẫu)

Mẫu sống không nhiễm = Tổng số mẫu không nhiễm - Tổng số mẫu không nhiễm bị chết

Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu chết (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Tỷ lệ mẫu không nhiễm - Tỷ lệ mẫu chết

- Đánh giá cảm quan chất lượng hạt (sau 45 ngày)

+ Hạt tốt: hạt lên có mầu xanh, nảy mầm đều, khỏe

+ Hạt trung bình: có mầu xanh, khỏe, không nảy mầm đều

+ Hạt kém: nẩy mầm ít, có màu nâu nhạt

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng tới hiệu

quả khử trùng hạt Ban

Thí nghiệm gồm 4 công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại sử dụng 9 hạt Ban gieo vào 3 bình môi trường MS có bổ sung agar 8 g/l, đường 30g/l

+ CT1: (Đ/C) Chỉ rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy

+ CT2: Ngâm trong dung dịch Javen 10%

+ CT3: Ngâm trong dung dịch Javen 30%

+ CT4: Ngâm trong dung dịch Javen 50%

Thời gian khử trùng 20 phút

- Theo dõi sau 10 ngày

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

+ Tỷ lệ mẫu sống (%)

2.2.2 Giai đoạn nhân nhanh

Phương pháp nhân nhanh:

Sử dụng môi trường nền: MS , bổ sung agar 7 g/l, đường saccarose 30g/l

Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin

bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm

Giá trị pH của môi trường nuôi cấy: 5,8 - 6,0

Thể tích dung dịch dinh dưỡng trong bình nuôi cấy là 50 – 70 ml/ bình

Phương pháp theo dõi:

Chồi yếu: chồi bị dị dạng, sinh trưởng kém

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến quá trình

nhân nhanh và chất lượng của chồi Ban

* Kiểu I: Sử dụng vật liệu là chồi Ban lấy từ cây ban nuôi cấy mô (lấy

từ hạt đã khử trùng và đem nuôi cấy ở thí nghiệm 1)

Cách bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là ba bình, mỗi bình cấy 3 chồi Môi trường nền (MT nền): MS bổ sung đường 30 g/l, agar 7 g/l

Chất điều tiết sinh trưởng: kinitin (K) được bố trí thành một dải nồng

độ trên 6 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 3 bình nuôi cấy đã vô trùng

- Theo dõi sau 45 ngày

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Số lượng (chồi)

+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình nhân

và chất lượng của chồi Ban

Cách bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 3 bình, mỗi bình cấy 3 chồi

- Môi trường nền: MS bổ sung đường 30 g/l, agar 7 g/l