Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ XUÂN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN (CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ XUÂN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN (CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Ngà THÁI NGUYÊN - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Xuân i LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thu Ngà tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong q trình nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để học tập hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, tất thầy cơ, bạn bè động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình học tập hồn thành luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận đóng góp q báu từ thầy bạn bè để tơi có kết tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Xuân ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân loại bưởi 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.2.4 Cây bưởi Diễn 1.2 Thành phần hóa học giá trị sử dụng bưởi 1.2.1 Thành phần hóa học 1.2.2 Giá trị sử dụng bưởi 1.3 Một số giống bưởi chủ yếu giới Việt Nam 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam 1.4 Tình hình sản xuất bưởi giới Việt Nam 10 1.4.1 Tình hình sản xuất bưởi giới 10 1.4.2 Tình hình sản xuất bưởi Việt Nam 11 1.5 Kĩ thuật nhân giống in vitro 13 1.6 Một số thành tựu nhân giống có múi 19 iii Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu hóa chất 22 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22 2.2 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3.Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 23 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 23 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 26 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết khử trùng hạt bưởi Diễn 27 3.2 Kết tạo chồi in vitro bưởi Diễn 28 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến phát sinh chồi mẫu cấy 29 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy 32 3.2.3 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy 34 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn 36 3.4 Kết tạo bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh 39 3.4.1 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 39 3.4.2 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 41 3.5 Kết vườn ươm 42 3.5.1 Giai đoạn bầu đất 42 3.5.2 Ra vườn ươm 44 Kết luận 46 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid BAP : 6-Benzyl Amino Purin Cs : Cộng ĐC : Đối chứng MS : Murashige - Skoog (1962) IAA : Indoly Acetic Acid IBA : Indoly Butyric Acid NAA : α - Napthalen Acetic Acid GA3 : Gibberellin Kinetin : 6-furturylamino purine iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ăn có múi Việt Nam giai đoạn 2010- 2014 12 Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng javen đến nảy mầm hạt bưởi Diễn (sau tuần) 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi mẫu cấy 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy mẫu cấy 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn 37 Bảng 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tuần) 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 41 Bảng 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi Diễn in vitro (sau tuần) 43 Bảng 3.9 Kết vườn ươm 44 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt bưởi Diễn (sau tuần) 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP tới phát sinh chồi mẫu cấy (sau tuần) 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy (sau tuần) 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn (sau tuần) 38 Hình 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh chồi bưởi Diễn 40 Hình 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tuần) 42 Hình 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi Diễn in vitro (sau tuần) 43 Hình 3.9 Cây bưởi Diễn in vitro trồng vườn ươm 44 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây Bưởi (Citrus grandis L.) loại ăn thương mại chủ lực, có lịch sử phát triển lâu đời nước ta Do có phổ thích nghi rộng nên trồng khắp vùng sinh thái nước từ Bắc vào Nam tạo nên vùng đặc sản tiếng như: Bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Diễn (Từ Liêm, Hà Nội), bưởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bưởi Da Xanh (Bến Tre), bưởi Đỏ (Thanh Hóa), bưởi Năm Roi,… Mỗi loại bưởi có hương vị đặc trưng riêng Diện tích sản lượng bưởi tăng không tạo cảnh quan đẹp, góp phần bảo vệ mơi trường sinh thái bền vững, nâng cao hiệu kinh tế cho nông hộ mà đáp ứng nhu cầu xuất khẩu, tạo điều kiện chuyển dịch cấu kinh tế nông nghiệp, thực cơng nghiệp hóa, đại hóa nơng nghiệp nơng thơn Nhiều nhà vườn trồng bưởi sau - năm thu lãi 40 - 100 triệu đồng/ha, suất cao tới 250 quả/cây vườn có mật độ khoảng 1000 - 1200 cây/ha [8] Cây bưởi loại ăn quý, có giá trị dinh dưỡng cao Trong lá, hoa, vỏ chứa nhiều tinh dầu; vỏ bưởi có pectin, narigin, men tiêu hóa peroxydaza, amilaza,… Quả bưởi có vị mát, chứa nhiều vitamin, chất khoáng cần thiết cho thể người [23] Chính vậy, bưởi dược liệu quan trọng có nhiều ứng dụng y học cổ truyền dân tộc Bưởi thuộc loại ăn lâu năm chịu ảnh hưởng rõ điều kiện ngoại cảnh, biểu qua sinh trưởng, phát triển, suất phẩm chất Hiện nay, Việt Nam nhiều nước giới rơi vào tình trạng nguồn gen ăn dần suy giảm, đặc biệt loại ăn q Đứng trước việc thị hóa, giới thiệu giống trồng biến đổi khí hậu, nguy xói mòn nguồn gen diễn nhanh chóng Diện tích ăn phá hàng năm khơng nhỏ gặp nhiều khó khăn dịch bệnh chất lượng giống Nhiều nông trại sản xuất giống áp dụng phương pháp truyền thống như: chiết cành, ghép cành, gieo hạt, [3], [15] Tuy nhiên giống xuất vườn chưa cao, thời gian sinh trưởng kéo dài, kết đạt không ổn định, chất lượng không Qua bảng 3.4 nhận thấy, kết cơng thức thí nghiệm có khác tiêu nghiên cứu Số chồi/mẫu chiều cao chồi tăng tỉ lệ thuận với nồng độ kinetin tăng dần từ 0,3 đến 0,5mg/l Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ kinetin khả phát sinh chồi giảm Hiệu tạo chồi tốt môi trường MS bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + BAP 5mg/l + kinetin 0,5mg/l, sau tuần, số chồi/mẫu 1,72, chiều cao chồi 0,69cm; Sau tuần số chồi/mẫu 3,03 (cao 1,63 lần so với đối chứng), chiều cao chồi 1,70 (cao 1,36cm so với đối chứng), sau tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu 4,47 (cao 2,40 lần so với đối chứng), chiều cao chồi 2,27 (cao 1,36cm so với đối chứng) Ở nghiên cứu chúng tôi, nồng độ BAP kết hợp với kinetin tối ưu cho tạo đa chồi cao so với kết nghiên tác giả Komal G (2013) nhân giống chanh không hạt (Citrus limon) [36] Sự khác biệt hàm lượng chất kích thích sinh trưởng nội sinh giống khác nhau, sử dụng nguồn hóa chất khác So sánh kết thí nghiệm cơng thức bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP kinetin tổ hợp BAP kinetin), môi trường bổ sung BAP cho hiệu tạo đa chồi chất lượng chồi tốt (hình 3.2) Mặt khác, môi trường thông dụng nuôi cấy, giảm giá thành giảm chi phí mơi trường ni cấy Môi trường bổ sung kinetin, hiệu tạo đa chồi chất lượng chồi (hình 3.3) Do đó, xếp hệ số tạo đa chồi bưởi Diễn mơi trường bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin theo thứ tự là: BAP > BAP +kinetin > kinetin 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn GA3 thực vật hormon sinh trưởng giúp kích thích kéo dài thân ngun vẹn, vươn dài lóng, kích thích phân chia tế bào Từ đặc tính điển hình GA3, chúng tơi tiến hành thăm dò ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy GA3 với nồng độ thay đổi Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng chồi đạt chiều cao 1,5- 2,5cm cấy chuyển sang môi trường MS bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + GA3 thay đổi nồng 36 độ Môi trường đố i chứng MS + đường 30g/l + agar 9,0g/l Sau ngưỡng thời gian thí nghiệm, theo dõi đánh giá kết thu bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn Công thức GA3 (mg/l) ĐC CT1 0,3 CT2 CT3 CT4 0,5 0,7 0,9 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Chiều cao chồi (cm) Sau tuần 1,53 ± 0,50 1,86 ± 0,57 Số lá/chồi Chiều cao chồi 3,17 ± 0,55 3,33±0,88 + + 2,51±0,82 2,36±0,70 1,84±0,67 4,27±1,12 4,27±0,83 3,50±1,20 ++ ++ + 0,3 Sau tuần 1,69 ±0,53 2,36± 0,60 3,49 ±0,77 5,25±1,23 + ++ 0,5 0,7 0,9 3,65±0,84 3,55±0,65 2,46±0,71 7,86±1,13 5,23±0,94 5,73±0,97 +++ +++ Sau tuần ĐC 2,17±0,55 4,19±0,80 + CT1 0,3 3,73±0,61 6,62±1,57 ++ CT2 0,5 4,78±1,06 8,59±1,86 +++ CT3 0,7 3,81±0,82 5,36±0,93 +++ CT4 0,9 2,95±0,70 4,43±1,20 ++ Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá, màu xanh nhạt; (++) chồi mập, nhiều lá, màu xanh; (+++) chồi mập, cao, nhiều lá, màu xanh đậm Qua bảng 3.5 cho thấy, tất công thức, bổ sung GA3 vào môi trường nuôi cấy dẫn đến tượng chiều cao chồi tăng so với đối chứng Điều chứng tỏ GA3 có ảnh hưởng đến kéo dài chồi bưởi Diễn Ở môi trường đối chứng, chiều cao chồi tăng chậm Sau tuần, chiều cao chồi 1,53cm; sau tuần, chiều cao chồi 2,17cm Trên mơi trường có bổ sung GA3, chiều cao chồi bưởi Diễn tăng dần tăng nồng độ GA3 từ 0,3 đến 0,5mg/l Ở mơi trường có bổ sung GA3 0,5mg/l đạt hiệu kéo dài chồi tốt Sau tuần chiều cao chồi 2,51cm, sau tuần, chiều cao chồi tăng đến 4,78cm (tăng 2,61cm so với đối chứng) Ở công thức khác, 37 sau tuần, chiều cao chồi tăng từ 1,84- 2,36cm; sau tuần, chiều cao chồi tăng từ 2,95- 3,81cm ĐC GA3 0,3mg/l GA3 0,5mg/l GA3 0,9mg/l Hình 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn (sau tuần) Đối với tiêu theo dõi số lá/chồi, môi trường bổ sung GA3 tăng từ 0,30,9mg/l, sau tuần số lá/chồi tăng từ 3,33- 4,27 cao so với đối chứng Sau tuần, kết thí nghiệm tốt quan sát thấy mơi trường thí nghiệm có bổ sung GA3 0,5mg/l Như vậy, môi trường tối ưu cho kéo dài chồi bưởi Diễn môi trường MS + đường 30g/l + agar 9g/l + GA3 0,5mg/l Trên môi trường tiêu theo dõi cao cơng thức nghiên cứu lại Kết phù hợp với kết nghiên cứu môi trường kéo dài chồi Mohammad H cs (2013), tái sinh in vitro cam chua (Citrus 38 aurantium L.) kết luận, môi trường MS có bổ sung GA3 0,5mg/l cho hiệu kéo dài chồi tối ưu [37] 3.4 Kết tạo bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh Tác dụng rõ rệt auxin phân hóa tế bào khả phát sinh rễ kiểm chứng từ năm 1934 Nhiều kết nghiên cứu cho thấy vai trò IBA α-NAA tác động đến trình phát sinh rễ [10] Để chồi in vitro bưởi Diễn phát triển thành hồn chỉnh ống nghiệm, chúng tơi thăm dò ảnh hưởng riêng rẽ IBA α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 3.4.1 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn Các chồi in vitro bưởi Diễn có chiều cao từ - 4cm, -5 chúng tơi sử dụng để thăm dò mơi trường ni cấy Sử dụng môi trường MS bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + IBA thay đổi nồng độ Môi trường đố i chứng MS bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l Kết thu trình bày bảng 3.6 hình 3.6 Kết bảng 3.6 hình 3.6cho thấy, mơi trường có bổ sung IBA cho tiêu theo dõi cao đối chứng Sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 0,55-1,23 rễ/chồi, sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 0,75-2,41 rễ/chồi; sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 0,90-2,70 rễ/chồi Trong đó, môi trường bổ sung IBA 0,7mg/l cho hiệu qủa tạo rễ tốt Sau tuần, số rễ trung bình đạt 2,70 rễ/chồi (tăng 1,17 lần so với đối chứng) Nồng độ IBA ảnh hưởng đến phát triển chiều dài rễ bưởi Diễn Chiều dài trung bình rễ tăng dần nồng độ IBA môi trường nuôi cấy tăng từ 0,3 - 0,5mg/l Chiều dài trung bình rễ tăng cao mơi trường có bổ sung IBA nồng độ 0,7mg/l, đạt 3,72cm Khi tiếp tục tăng nồng độ IBA chiều dài trung bình rễ giảm 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tuần) Công thức IBA (mg/l) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ Sau tuần ĐC CT1 CT2 0,3 0,5 0,73±0,08 1,00±0,09 0,75±0,08 1,48±0,04 + + CT3 CT4 0,7 0,9 1,23±0,27 0,55±0,05 1,60±0,05 1,55±0,07 ++ + Sau tuần ĐC CT1 CT2 0,3 0,5 1,07±0,12 1,18±0,16 1,77±0,11 2,35±0,36 ++ ++ CT3 CT4 0,7 0,9 1,41±0,20 0,75±0,07 3,63±0,51 1,71±0,12 +++ + Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 1,67±0,21 1,90±0,14 ++ CT2 0,5 1,70±0,13 2,32±0,34 +++ CT3 0,7 2,70±0,04 3,72±0,20 +++ CT4 0,9 0,90±0,09 0,92±0,08 + Ghi chú: (+) rễ ngắn, nhỏ, khơng có rễ phụ, màu trắng; (++): rễ ngắn, màu trắng xanh; (+++): rễ mập, dài, có rễ phụ, màu trắng xanh ĐC IBA 0.7mg/l Hình 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh chồi bưởi Diễn 40 Xét đồng thời tiêu theo dõi thí nghiệm chúng tơi cho thấy môi trường tối ưu nồng độ nghiên cứu cho việc tạo rễ bưởi Diễn môi trường bổ sung IBA 0,7mg/l Trên môi trường này, số rễ/chồi đạt 2,07, chiều dài trung bình 3,72cm, bề mặt rễ sần xùi, có nhiều rễ phụ, màu xanh nhạt 3.4.2 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn NAA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trưởng dãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ [10] Dựa đặc tính NAA, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn Thí nghiệm tiến hành cơng thức có bổ sung αNAA nồng độ khác Bảng 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn Công thức α-NAA (mg/l) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 0,38±0,11 0,47 ±0,03 + CT2 0,5 0,88±0,15 0,91 ±0,02 ++ CT3 0,7 0,53±0,10 0,52 ±0,04 ++ CT4 0,9 0,52±0,08 0,29 ±0,08 + Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 0,73 ±0,11 1,59 ±0,13 +++ CT2 0,5 2,00 ±0,06 1,55 ±0,25 +++ CT3 0,7 1,16 ±0,10 1,94 ±0,11 +++ CT4 0,9 0,88 ±0,08 0,95 ±0,11 + Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 1,32 ±0,14 2,08 ±0,15 ++ CT2 0,5 2,80 ±0,17 2,85 ±0,32 +++ CT3 0,7 1,68 ±0,17 2,36 ±0,15 +++ CT4 0,9 1,40 ±0,06 1,42 ±0,10 ++ Ghi chú: (+): rễ ngắn, nhỏ, màu trắng; (++): rễ ngắn, màu trắng xanh; (+++): rễ dài mập, màu trắng xanh 41 ĐC α-NAA 0,5mg/l Hình 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tuần) Kết bảng 3.7 rằng, môi trường bổ sung α-NAA tiêu số rễ trung bình chiều dài rễ tăng so với môi trường không bổ sung α-NAA Sau tuần nuôi cấy, số rễ trung bình đạt từ 1,32- 2,8, chiều dài rễ tăng từ 1,42- 2,85 cm Bề mặt rễ xốp, rễ mập, khỏe, màu trắng xanh Có thể thấy, mơi trường có bổ sung α-NAA nồng độ 0,5mg/l cho tiêu theo dõi thí nghiệm tốt nồng độ nghiên cứu Trên môi trường này, rễ bưởi Diễn khỏe, mập, sinh trưởng phát triển nhanh So sánh kết nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ IBA α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn nhận thấy, môi trường tạo chất lượng rễ tốt Nếu nghiên cứu tạo hồn chỉnh mang đặc điểm hình thái rễ bưởi (có rễ rễ bên), mơi trường bổ sung IBA phù hợp Nếu nghiên cứu tạo số lượng rễ nhiều mơi trường bổ sung α-NAA thích hợp kĩ thuật tạo rễ bưởi Diễn 3.5 Kết vườn ươm 3.5.1 Giai đoạn bầu đất Việc lựa chọn giá thể phù hợp để vườn ươm phải thực tỉ mỉ cẩn thận, khâu định đến thành công q trình ni cấy in vitro Giá thể phù hợp giá thể cho tỉ lệ sống cao, sinh trưởng phát triển tốt Trong điều kiện in vitro, ni cấy mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo vô trùng Khi đưa trồng giá thể vườn ươm, phải sống tự dưỡng, xung quanh môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên Do vậy, huấn luyện in vitro giúp chuyển từ trạng 42 thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, đưa trồng môi trường tự nhiên tự dưỡng mà khơng ảnh hưởng đến sinh trưởng [23] Đất thịt trung bình giữ nước, nhiệt, khơng khí, tơi xốp thuận lợi cho q trình lý hố xảy đất Mặt khác, dễ cày bừa, làm đất Độ pH từ 5,5 đến 6,5, thích hợp cho sinh trưởng phát triển thuận lợi bưởi Diễn [4] Các in vitro đạt chiều cao - cm,mọc - lá,2 - rễ, chiều dài rễ đạt - 3cm, rễ mập đủ tiêu chuẩn đưa ngồi vườn ươm Chúng tơi tiến hành đưa in vitro khỏi môi trường, rửa agar bám rễ Sử dụng loại giá thể để trồng thăm dò: cát vàng + trấu hun (tỉ lệ 1:1); đất thịt trung bình + trấu hun (tỉ lệ 6:4); đất thịt trung bình Kết thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống bưởi Diễn trồng giá thể sau tuần chăm sóc trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi Diễn in vitro (sau tuần) Tỉ lệ sống (%) Chất lượng Cát vàng + trấu hun (1:1) 61,70 + Đất thịt trung bình + trấu hun (6:4 ) 93,56 +++ Đất thịt trung bình 79,23 ++ Giá thể Ghi chú: (+): vàng nhạt, rụng, không phát triển; (++): xanh nhạt, không phát triển; (+++): xanh đậm, sinh trưởng bình thường Cát vàng + trấu hun (1:1) Đất thịt trung bình + trấu Đất thịt trung bình hun (6:4) Hình 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi Diễn in vitro (sau tuần) 43 Kết bảng 3.8 hình 3.8 cho thấy, loại giá thể khác cho tỉ lệ sống chất lượng khác rõ rệt Tỉ lệ sống giá thể sau tuần trồng dao động từ 61,70- 93,56% Trên giá thể cát vàng + trấu hun (1:1), tỉ lệ sống đạt 61,7%, sinh trưởng yếu so với công thức khác, có màu vàng nhạt, khơng phát triển, có tượng rụng cũ Những trồng giá thể đất thịt trung bình + trấu hun theo tỉ lệ 6:4, tỉ lệ sống cao đạt 93,56%, sinh trưởng phát triển bình thường, hình thành thêm mới, phiến rộng, màu xanh đậm Cây trồng giá thể đất thịt trung bình, tỉ lệ sống đạt 79,23%, không phát triển giá thể này, khơng hình thành mới, chuyển sang màu xanh nhạt Do đó, giá thể đất thịt trung bình kết hợp với trấu hun tỉ lệ 6:4 nghiên cứu phù hợp để trồng bưởi Diễn in vitro giai đoạn bầu đất 3.5.2 Ra vườn ươm Cây bưởi Diễn in vitro sau huấn luyện đạt chiều cao khoảng 4- 5cm, hình thành thêm mới, xanh, chiều dài rễ đạt 3-4cm, khỏe mạnh sẵn sàng cho việc chuyển môi trường tự nhiên Chúng tiến hành chuyển trồng luống với mật độ 30x30cm Tuần phủ ni lông Theo dõi, đánh giá kết sau 1, 2, tháng chăm sóc Kết thí nghiệm thể bảng 3.9 hình 3.9 Bảng 3.9 Kết vườn ươm Thời gian Chiều cao (cm) Số lá/cây Chất lượng Sau tháng 3,82 ± 0,89 7,87 ± 1,18 + Sau tháng 6,66 ± 2,05 10,74 ± 2,18 ++ Sau tháng 11,50 ± 6,57 13,03 ± 2,52 +++ tháng tháng tháng Hình 3.9 Cây bưởi Diễn in vitro trồng vườn ươm 44 Qua bảng 3.9 hình 3.9 cho thấy, in vitro sinh trưởng phát triển tốt môi trường tự nhiên, chiều cao tăng dần từ 3,83cm đến 11,50 cm Thời gian đầu, phát triển chậm, nhỏ thấp, nhỏ, màu xanh nhạt Do chuyển vườn ươm chưa thích ứng với điều kiện môi trường tự nhiên.Tuy nhiên, sau tháng trồng chăm sóc phát triển nhanh chóng, to, cao, thân bắt đầu phân cành, nhiều lá, phiến rộng, có màu xanh đậm, chiều cao đạt 11,50cm, số lá/ 13,03, phát triển cân đối sau tháng chăm sóc 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Hạt bưởi Diễn khử trùng cồn 700 (1 phút), javen 60% 25 phút Ở ngưỡng thời gian tỉ lệ hạt nảy mầm đạt 91% Mơi trường thích hợp để tạo đa chồi từ đoạn thân bưởi Diễn invitro MS + đường 30g/l + agar 9g/l +BAP 5,0mg/l Trên môi trường chồi mập, phát triển cân đối, số chồi/mẫu đạt 5,8 Trên môi trường MS + đường 30g/l + agar 9g/l + GA3 0,5mg/l cho hiệu kéo dài chồi tốt nồng độ nghiên cứu (Chiều cao chồi đạt 4,78 cm sau tuần nuôi cấy) Môi trường tối ưu cho q trình tạo bưởi Diễn in vitro hồn chỉnh MS + đường 30g/l + agar 9g/l có bổ sung IBA 0,7mg/l NAA 0,5mg/l Rễ phát sinh mập, khỏe, rễ mang nhiều rễ phụ Khi điều kiện tự nhiên giai đoạn bầu đất, giá thể đất thịt trung bình + trấu hun tỉ lệ 6:4 phù hợp cho việc huấn luyện in vitro Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng chất phụ gia khác đến sinh trưởng phát triển bưởi Diễn in vitro Cây bưởi Diễn chưa đưa vào sản xuất quy mô rộng nên đề nghị tiếp tục nhân giống sản xuất với số lượng lớn nhằm bảo vệ nguồn gen quý, đáp ứng nhu cầu nhà vườn 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Boun K V (2005), Nghiên cứu tình hình sản xuất có múi huyện ngoại thành Hà Nội số biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao suất bưởi quýt, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Cục Nông nghiệp thành phố Phúc Châu, Phúc Kiến (2009), Tình hình sản xuất kỹ thuật trồng bưởi tỉnh Phúc Kiến, Tài liệu hướng dẫn kỹ thuật Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Sổ tay trồng ăn quả, NXB Nông nghiệp Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động - xã hội Nguyễn Hữu Đống, Huỳnh Thị Dung, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2003), Cây ăn quả có múi cam chanh quýt bưởi, NXB Nghệ An Vũ Mạnh Hải (2000), Tài liệu tập huấn ăn quả, Viện Nghiên cứu Rau Trần Văn Hâu (2009), Giáo trình xử lý hoa ăn trái, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Quỳnh Hoa (2010), “Nghiên cứu đặc tính nơng sinh học bưởi Diễn chọn lọc ảnh hưởng số biện pháp kỹ thuật đến suất phẩm chất bưởi Diễn trồng xã Minh Khai - Từ Liêm - Hà Nội”, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ (2010), Nhân giống vơ tính in vitro chanh Dây (Passiflora Edulis Sims) sử dụng đoạn thân mang chồi nách, Tạp chí cơng nghệ Sinh học 8(3): 379-385 10 Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục 11 Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 12 Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm 13 Trần Văn Minh (2004), Công nghệ Sinh học, NXB Trường đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh 47 14 Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Chi Mai, Đặng Hòa Hiếu, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi trực tiếp từ thân mầm cam sành (Citrus nobilis loureiro) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 363- 370 15 Hoàng Thị Sản, Phân loại thực vật, NXB Giáo dục 16 Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Hà Nội (2010 - 2015), Báo cáo khả thi dự án xây dựng sở ứng dụng, sản xuất giống sản phẩm trồng chất lượng cao, Báo cáo tổng kết 17 Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thu Thủy (2016), Giáo trình Cơng nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Đại học Thái Nguyên 18 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch Vũ Quang Sáng (2006), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 19 Phan Hữu Tơn, Tống Văn Hải, Đồn Văn Lư, Phạm Thị Dung, Nguyễn Xuân Viết “Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống cam (Citrus sinensis), quýt (Citrus reticulata)”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 5: 641-649 20 Tổng cục thống kê (2013), NXB thống kê 21 Nguyễn Quang Thạch Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm 22 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp 23 Hà Thị Thúy, Đỗ Năng Vịnh (2004), Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa phơi vơ tính từ ni cấy nỗn số giống ăn có múi, Tạp chí Di truyền Ứng dụng, trang 13-19 24 Đào Thanh Vân, Ngô Xuân Bình (2003), Giáo trình ăn (dành cho cao học), NXB Nông nghiệp, Hà Nội 25 Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần Dinh dưỡng, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 26 Hồng Văn Việt (2014), "Nghiên cứu đa dạng hóa thị trường tiêu thụ chuỗi giá trị bưởi Da Xanh Bến Tre", TC Hội nhập phát triển, 2, trang 15-19 27 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi - Công nghệ sinh học chọn tạo giống, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 48 28 Vũ Văn Vụ (2012), Công nghệ sinh học 2- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục 29 Trần Như Ý, Đào Thanh Vân, Nguyễn Thế Huấn (2000), Giáo trình ăn quả, Đại học Nông lâm Thái Nguyên, NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng Anh 30 Anna K P., Jacek P., Ewa S (2015), In vitro Regeneration induced in leaf explants of Citrus limon L Burm cv ‘Primofiore’, Maria Curie-Skłodowska University in Lublin 31 Bosch M (2005), Plant Physiology, 138: 1334-1346 32 Chen Q., Xu C J (2005), "Effect of artificial pollination on fruit development and quality in storage of Yongjiazaoxiangyou pomelo, China", Journal of Fruit Science 33 Ehsan E., Ali D (2015), In vitro plant regeneration from mature tissues of Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Rumani 34 Evandro H S., Fernando A (2011), In vitro organogenesis in some citrus species 35 Freeman T., Robbertse P J (2003), "Internal quality of Valencia ‟orange fruit as influenced by tree fruit position and winter girdling" 36 Komal G., Shanma R., P K singh and Govind singh (2013), In vitro propagation produces seedless lime (Citrus limon L cv Kaghzi Kalan) and genetic evaluation of the plant, Plant physiology pp 131-145 37 Rezadost M., Hosein S (2013), In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.) via direct organogenesis, 55 (3) pp.137-164 38 Mung H.T (2008), Citrus production in Asia, Cheju Citrus ResearchInstitute, Korea, Asian Studies on the Pacific Coast 39 Ngo Xuan Binh (2001), Study of self-incompatibility in Citrus with special emphases on the pollen tube growth and allelic variation, Ph.D thesis Kyushu University - Japan 40 Plant Physiology online, http://www.biology-online.org 49 41 Rosely P., Weliton A B., Elma d S., (2008), In vitro organogenesis from adult tissue of ‘Bahia’ sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Brasil, pp 367-371 42 Shahid A K et al (2011), Regeneration in vitro from non-pollinated flowers of sweet citrus (Citrus sinensis L Osbeck), African Journal of Biotechnologyp 15.130-15.134 43 Sunette L (2004), South African Journal of Plant and Soil, pp 199-202 Tài liệu mạng 44 FAO (2013), FAO Statistic Division 45 http://thanglong.chinhphu.vn chuong-my-hieu-qua-kinh-te-tu-mo-hinh-trong- buoi-dien 50 ... cho cây, thời gian nhân giống nhanh Xuất phát từ lí trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu nhân giống bưởi Diễn (Citrus grandis L.) kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm tạo giống. .. PHẠM HOÀNG THỊ XUÂN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN (CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng... thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi Diễn in vitro (sau tuần) 43 Hình 3.9 Cây bưởi Diễn in vitro trồng vườn ươm 44 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây Bưởi (Citrus grandis L.) loại ăn thương