nghiên cứu nhân giống địa lan trần mộng xuân (cymbidium lowianum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

- Tìm hiểu ảnh hưởng của một số yếu tố của môi trường nuôi cấy lên sự tạo protocom và sự sinh trưởng, phát triển của lan Trần Mộng Xuân.. Tuy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kỳ sinh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VŨ THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN

TRẦN MỘNG XUÂN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

THÁI NGUYÊN - 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VŨ THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN

TRẦN MỘNG XUÂN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này là hoàn toàn trung thực, có thực tiễn; chƣa đƣợc bảo vệ ở bất kỳ một hội đồng khoa học hay học vị nào

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn dều đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Vũ Thị Hải

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn khoa học PGS TS Dương Mộng Hùng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp

đỡ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo và Ban giám hiệu Trường Đại học Nông – Lâm Thái Nguyên, Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên đã tạo những điều kiện thuận lợi, cung cấp những tài liệu cần thiết cho tôi hoàn thành các nội dung và chương trình mà luận văn đặt ra

Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ công nhân viên của Vườn Quốc gia Hoàng Liên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong nghiên cứu, thu thập số liệu và thừa kế các số liệu sẵn có để hoàn thành tốt luận văn

Cuối cùng tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp trong Bộ phận nuôi cấy mô

tế bào thực vật, bạn bè và người thân trong gia đình đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin trân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, năm 2013 Tác giả luận văn

Vũ Thị Hải

MỤC LỤC

1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro 4

1.2 Giới thiệu về họ lan 4

uân 8

1.4 Thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô hoa lan 9

1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 9

1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 10

1.5 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô in vitro 12

1.5.1 Dựa trên tính toàn năng của tế bào 12

1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 12

1.6 Quy trình nhân giống in vitro 13

1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 13

1.6.2 Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động 14

1.6.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 14

1.6.4 Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh 14

1.6.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 15

1.7 Các phương thức nhân giống vô tính in vitro 15

1.7.1 Hoạt hóa chồi nách 15

1.7.2 Tạo chồi bất định 15

1.7.3 Tạo phôi vô tính 16

1.8 Một số trường hợp thường gặp trong quá trình nuôi cấy in vitro 16 1.8.1 Tính bất định về mặt di truyền 16

1.8.2 Sự nhiễm mẫu 16

1.8.3 Sự hóa nâu 17

1.8.4 Hiện tượng thủy tinh hóa 17

1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 18

1.9.1 mẫu cấy 18

1.9.2 Môi trường nuôi cấy 18

1.9.2.1 Môi trường vật lý 18

1.9.2.2 Môi trường hóa học 19

1.9.3 Các chất điều hòa sinh trưởng 21

1.9.3.1 Auxin 21

1.9.3.2 Gebberelin 22

1.9.3.3 Các Xytokinin 22

1.9.3.4 Ethylene 22

1.9.3.5 Các chất ức chế tăng trưởng 23

1.9.3.6 Kết luận 23

1.9.4 Điều kiện vô trùng 23

1.9.5 Phòng nuôi 24

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nội dung nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp luận 27

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 27

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 27

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 28

2.2.2.3 Thí nghiệm 3:Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng tạo protocom 29

2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi 30

2.2.2.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 31

2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến

tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm 32

2.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 33

2.2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu 33

2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 36

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom 43

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi 46

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 49

3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm 53

KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Tồn tại 59

4.3 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 63

Phụ lục 1: Môi trường Murashige- Skoog (MS, 1962) 63

Phụ lục 2: Môi trường MS cải tiến (MS*) 64

Phụ lục 3: Môi trường Vacin &Went (VW) 65

Phụ lục 4: Phân tích kết quả khử trùng mẫu cấy 66

Phụ lục 5: Phân tích kết quả ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 70 Phụ lục 6: Phân tích kết quả ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA, Ki đến khả năng nhân Protocom 73 Phụ lục 7: Phân tích kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

BA, KI đến khả năng nhân nhanh chồi 74 Phụ lục 8: Phân tích ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây và chiều dài rễ 75 Phụ lục 9: Phân tích kết quả ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến

tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm 77

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Công thức khử trùng cho từng loại mẫu 28

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của môi trường hóa học và nồng độ chất ĐHST đến khả năng tái sinh của hạt lan 29

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất ĐHST Ki, BA đến khả năng tạo protocom 30

Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi 31

Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến sự ra rễ 32

Bảng 3.1a: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng HgCl2 36

Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng cồn 37

Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 2 loại môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40

Bảng 3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom 43

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi 47

Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 50

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con tại vườn ươm 54

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

1 Biểu đồ 3.1a: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ

chất ĐHST Ki và BA đến tỷ lệ mẫu tái sinh 44

2 Biểu đồ 3.1b: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ

chất ĐHST Ki và BA đến hệ số nhân thể chồi 45

3 Biểu đồ 3.1c: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ

chất ĐHST Ki và BA đến chiều cao trung bình của thể chồi 45

4 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng phối hợp của chất ĐHST BA và Ki

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1: Địa lan Trần Mộng Xuân (Cymbidium lowianum) 9

Hình 3.1a: Mẫu quả lan khử trùng 39

Hình 3.1b: Mẫu quả lan đã khử trùng 39

Hình 3.1c: Hạt lan được gieo vào MT 40

Hình 3.1d: Hạt gieo sống và không nhiễm 40

Hình 3.2: Sự nảy mầm của hạt lan trong môi trường MS*, 1,5 mg/l BA 42

Hình 3.3.Protocom phát triển trong MT MS*, 1,5 mg/l BA, 1,5 mg/l Ki 46

Hình 3.4: Cây con trong MT nhân chồi MS*, 1,5 mg/l BA, 1,5 mg/l Ki 48

Hình 3.5a: Cây con mới được đưa vào MT ra rễ 52

Hình 3.5b: Cây con sau 4 tuần nuôi cấy trong MT ra rễ MS*, 0,5 mg/l NAA 53

Hình 3.6a: Những bình lan được đưa ra huấn luyện 55

Hình 3.6b: Những cây lan đã huấn luyện được đưa ra khỏi bình 55

Hình 3.6 c: Cây trồng và chăm sóc ở khay sau 4 tuần 55

Hình 4: Môi trường chuẩn bị cho các thí nghiệm 56

Hình 5: Khử trùng quả lan 56

Hình 6: Hạt lan được gieo vao môi trường nuôi cấy 57

Hình 7: Lan TMX trong môi trường nhân nhanh 57

Hình 8: Lan trong môi trường ra rễ 58

Hình 9: Cây con ngoài vườn huấn luyện 58

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IAA : Indol acetic acid

NAA : Naphthyl acetic acid

IBA : 3 - Indol butyric acid

GA3 : Gibberelin acid 3

BAP : 6-Benzyla amino purin

HgCl2 : Clorua thủy ngân

NaOCl : Hypoclorit natri

Ca(OCl)2 : Hypoclorit canxi

HSNTC : Hệ số nhân thể chồi

HSNC : Hệ số nhân chồi

ĐHST : Điều hòa sinh trưởng

CTTN : Công thức thí nghiệm

MS : Môi trường Murashige- Skoog, 1962

MS* : Môi trường Murashige- Skoog cải tiến

VW : Môi trường Vacin &Went

Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, diện tích rừng núi được phân bổ khá rộng tạo thành hệ thống lan

và địa lan Trong đó địa lan (Cymbidium) là loài thực vật đã được đưa vào nuôi trồng nhân tạo và thưởng thức từ rất lâu Từ thời phong kiến thú chơi địa lan rừng chỉ phát triển chủ yếu trong giới quý tộc có địa vị trong xã hội, ngày nay phong trào này đã được phát triển cách rộng rãi cả chất lẫn lượng Chủng Lan Kiếm là một chi trong họ Lan Hương lan Kiếm được tôn là Vương giả chi hương - thiên hạ đệ nhất hương, hương thanh, không hắc, nhưng đậm đà, khó quên, thoắt ẩn thoắt hiện, như gần như xa Mầu sắc của hoa lan là mầu sắc của cánh đài, của 2 cánh hoa, của cánh môi, của họng hoa, của lá Thiên nhiên đã vô cùng tỉ mỉ tuyển lựa mầu, tô vẽ cho các phần của hoa rất phong

có sự thống nhất cái đẹp bên ngoài của cây lan với

"cái thần" thẳm sâu bên trong, hình thành sự liên tưởng chặt chẽ sâu sắc

hoá của người Đông Á

, , nhu cầu về hoa trên Thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đang ngày càng gia tăng Hoa tươi, đặc biệt là hoa lan đã trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao, được nhiều người ưa chuộng và chiếm ưu thế trong thị trường hàng hóa nông nghiệp [15]

Trước kia, khi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật ở nước ta chưa phát triển thì việc nhân giống một loài lan gặp rất nhiều khó khăn do phương pháp nhân giống sinh dưỡng truyền thống có nhiều hạn chế như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều

thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên

là rất thấp

Ngày nay cùng sự phát triển của khoa học- công nghệ, kỹ thuật nhân

giống in vitro được áp dụng phổ biến và thành công ở nhiều đối tượng thì việc

nhân nhanh các loài hoa lan đã trở nên thuận lợi Bằng phương pháp này, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường

Địa lan Trần Mộng Xuân Cymbidium lowianum

chùm hoa dài, thường dài hơn lá với 12- 25 hoa Hoa lớn màu vàng lục, cánh môi chia ba thuỳ màu vàng, đỉnh môi màu

đỏ hồng Hiện nay, đây là một trong số ít giống lan Sapa có hoa đẹp nở đúng dịp tết nên nó đã thực sự thu hút người tiêu dùng trong và ngoài nước Nhưng khả

Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi triển khai nghiên cứu đề

in vitro”

* Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm ra các tác nhân khử trùng và nồng độ khử trùng thích hợp

- Xác định môi trường phù hợp để nhân giống lan Trần Mộng Xuân bằng

phương pháp nuôi cấy mô in vitro

- Tìm hiểu ảnh hưởng của một số yếu tố của môi trường nuôi cấy lên sự tạo protocom và sự sinh trưởng, phát triển của lan Trần Mộng Xuân

- Xây dựng hướng dẫn nhân giống cho lan Trần Mộng Xuân bằng

phương pháp nuôi cấy mô in vitro

- Ứng dụng kết quả nghiên cứu để triển khai nhân giống đại trà, cung cấp cây giống cho công tác bảo tồn

* Đối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành trên hạt của lan Trần Mộng Xuân Quả lan được thu hái khi được khoảng 5 tháng tuổi (vào tháng 11 dương lịch), hạt lan lúc đó sẽ có màu vàng chanh

* Địa điểm nghiên cứu

Bộ phận nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phòng khoa học và hợp tác quốc tế Vườn quốc gia Hoàng Liên – Sa Pa – Lào Cai

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ miêu tả các phương

thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hoocmon tăng trưởng và đường

Phương pháp nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc các cơ quan từ các

mô như: thân, lá, rễ ,hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh…

1.2 Giới thiệu về họ lan

Từ đời vua Thần Nông (2800) trước công nguyên, cây lan đã được biết đến đầu tiên ở phương Đông và được sử dụng làm thuốc chữa bệnh Sau đó, Robut Bron (1773 – 1858) là người đầu tiên đã phân biệt rõ ràng giữa họ lan

và các họ khác [5] Đặt nền tảng hiện đại cho môn học về lan là Joanlind (1979 – 1985) Năm 1836, ông công bố sắp xếp các tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ông đưa ra đựơc dùng cho đến ngày nay [5] Theo các tài liệu tham khảo của một số tác giả cây hoa lan

Orchidaceae thuộc họ lan Orchidaceae, bộ lan Orchidales, lớp một lá mầm Monocotyledoneae [1], [5], [3] Họ lan có mặt ở hầu hết các vùng trên trái đất,

nhưng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt đới, nó đứng thứ hai sau

họ cúc, khoảng 15000-35000 loài, phân bố từ 68 o cho đến 56o

vĩ nam Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu

Mỹ và Đông Nam Á (Mau – RFL 1983) Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung

Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium ensifonymum là một loài bán địa lan Ở

châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời bấy giờ mà phong lan đã đi khắp các miền của địa cầu, lúc đầu là Vanny sau đó đến Bạch Cập, Hạc Đính rồi

Ở Việt Nam, có lẽ người đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro – nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn “ Flora cochin chinensis” gọi tên

các cây lan trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là Aerides, Phaius

và Sarcopodium…mà đã được Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn

“Genera plante rum” (1862 – 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp – 1995), chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam thì mới có những công trình nghiên cứu được công bố đáng kể là F.gagne pain và A gui llaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “Thực vật Đông Dương chí” ( Flora Genera Indochine) do H Leconte chủ biên xuất bản từ

những năm 1932 – 1934

 Đặc tính thực vật học của địa lan

Lan cũng giống như các loại thực vật khác, gồm 6 bộ phận: rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt [5], được mô tả như sau:

 Thân cây

Thân rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang

lá Theo M.E.Pfizer (1882) phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộc loại sinh trưởng hợp trụ (nhóm không thân) [5] Thân này gồm hệ thống của nhiều nhánh lâu năm, với bộ phận nằm ngang, bò dải trên giá thể hay ẩn sâu trong lòng đất Ngược lại, rất ít khi gặp các loài phong lan sinh trưởng đơn trục

(nhóm có thân), cơ thể khó có khả năng duy trì được tư thế thẳng đứng, nó phải nhờ đến các rễ chống đỡ để vươn cao, ở các loài phong lan sống phụ, có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả Đó là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng để nuôi cây trong hoàn cảnh khô hạn khi sống bán trên cao Đa số củ giả

đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp

 Lá lan

Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng – lá nửa đứng, lá cong rũ Hầu hết các loại địa lan đều là cây tự dưỡng, là “ xương” chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá Lá mọc đơn độc, hoặc xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả Hình dáng

lá thay đổi từ loại lá mọng nước, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn hay có rãnh, đến loại lá hình phiến mỏng, dài, những lá dưới sát gốc thường tiêu giảm đi chỉ còn những bẹ không có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy Các loài địa lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh ít phải kể

đến Đông lan (2,6 lá/ nhánh); trong khi đó Bạc lan (Cerythrostylum) có số lá/

nhánh rất lớn (9,1 lá/ nhánh) Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá

dài phải kể đến Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm; Thanh ngọc

(Cymbidiumensifolium) 40- 80 cm…

Về màu sắc, phiến lá thường có màu xanh bóng như các chi Lan kiếm

(Cymbidium SW), chi lan Bầu rượu (Calanthe R.Br), có loài có màu xanh

đậm như Hạc Đính Vàng (P Flavum)

 Hoa lan

Cấu tạo của hoa lan phong phú và đa dạng Ta có thể gặp nhiều loài mà mỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm một bông Mặc dù muôn hình muôn vẻ nhưng nếu ta quan sát hoa của bất kỳ cây lan nào cũng có một tổ chức đồng nhất của hoa mẫu 3 là một kiểu hoa đặc trưng của lớp một lá mầm, nhưng đã biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng qua một mặt phẳng

Mầm hoa của địa lan được hình thành từ đốt thứ 3, thứ 4 ở gần đáy của các giả hành, hoa đứng thẳng hay cong thường dài và mang nhiều hoa chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già đâm ra bên ngoài Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần Chồi hoa thường xuất hiện đồng thời với chồi thân, nhưng chồi hoa no tròn hơn, còn chồi thân hơi dẹp Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn ở chồi hoa các lá bao hoa luôn ôm chặt quanh phát hoa

Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng Chiều dài của phát hoa từ 10cm đến hơn 100cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên nhau theo đường xoắn ốc Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa Thoạt nhìn hoa địa lan có 5 cánh gần giống nhau, thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là 3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ 3 chuyên hoá thành cánh môi, màu sắc sắc sỡ hơn xẻ thành 3 thuỳ tạo ra dạng nửa hình ống Hai thuỳ bên

ôm lấy trụ, thuỳ thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm chỗ đậu cho côn trùng khi đến đậu hút mật và thụ phấn cho hoa Giữa 2 cánh môi có 2 gờ dọc song song màu vàng.Tận cùng bên trong có đĩa mật và đôi khi có tuyến tiết mồ hôi Hoa lưỡng tính nhị đực và nhị cái cùng gắn chung trên một trụ nhị, nhuỵ hình hình bán trụ hơi cong về phía trước Nhị ở trên cùng mang 2 khối phấn màu vàng có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn của trục hợp nhuỵ cách với muỗm nhuỵ bởi một cái gờ nổi lên Cấu trúc này trong tự nhiên hoa địa lan chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng Sau khi hoa thụ phấn, hoa xoay dần về

vị trí cũ, bầu noãn phình to lên tạo thành quả

loài quả chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi

vỏ quả khi vỏ này bị mục nát

 Hạt lan

Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thước hạt vô cùng nhỏ với khối lượng toàn

bộ hạt trong một quả =1/10-1/1000mg trong đó không khí chiếm 76-96% thể tích của quả Do đó hạt lan hầu như không có khối lượng Hạt chỉ cấu tạo từ một khối chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ xốp chứa đầy không khí Phải trải qua 2-18 tháng hạt mới chín Phần lớn hạt thường chết vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mần Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất

xa, nhưng hạt nảy mần thành cây lại hiếm Chỉ ở trong những khu rừng già

ẩm ướt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm

Địa lan Trần Mộng Xuân có tên khoa học Cymbidium lowianum thuộc họ

Phong lan Lan đất, củ giả tròn Lá hình dải hẹp dài từ 60 – 80cm, số lá trung bình trên một nhánh là 5,1 Chùm hoa dài từ 70 – 100cm, thường dài hơn lá với 15- 30 hoa Hoa lớn dài 12cm màu vàng lục, cánh môi chia ba thuỳ màu vàng, đỉnh môi màu đỏ hồng Hiện nay, đây là một trong số ít giống lan Sapa

có hoa đẹp nở đúng dịp tết

Loài địa lan này chỉ đẻ một nhánh trong một năm, đẻ 2 đợt mầm trong một năm vào tháng 3 - 4 và tháng 9 - 10 Những mầm đẻ vào tháng 9 - 10 thường là mầm sinh trưởng, phát triển kém, còi cọc, nhũng mầm này khó có khả năng cho hoa Tốc độ sinh trưởng vè chiều cao của địa lan chậm, nhanh nhất là vào tháng 6 mới đạt chiều cao tối đa

Hình 1: Địa lan Trần Mộng Xuân (Cymbidium lowianum)

1.4 Thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô hoa lan

1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới

Năm 1899: Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp đã tìm ra vai trò của nấm cộng sinh trong quá trình nảy mầm tự nhiên của hạt lan

Năm 1904: Noel Bernard & Burgeff người Đức cộng tác với nhau để đưa

ra phương pháp gieo hột lan có nhiễm nấm trong chai thạch Phương pháp này

đã làm gia tăng số lượng lớn cây con trồng từ hạt

Năm 1922, Knudson người Mỹ lại thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hột Từ đó phương pháp của Knudson

đã được sử dụng ở khắp nơi trên thế giới

Năm 1996, Yonco Sagaw và T.Shoji nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô

Như vậy, giống địa lan là nền tảng cho việc nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật Khả năng ứng dụng rễ thấy nhất của phương pháp nuôi cấy mô

tế bào thực vật là nhân nhanh giống và phục tráng giống trong cây trồng Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một loài địa lan có rất ít hoặc không

có virus Đồng thời ông cũng thành công trong kỹ thuật tạo protocorm, khi nuôi cấy Meristem, các protocorm được cắt và nuôi cấy tiếp tục sẽ thu được các protocorm mới Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây địa lan con mới và là những cây sạch virus

Từ đó đến nay nhân giống in vitro đã thành công đối với nhiều chi khác

thuộc họ lan, như: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hoàng Thảo (Dendrobium), Kim Tuyến (Anoectochilus) và các giống lai của chúng Đó

cũng là cơ sở cho những thành công của nhiều công trình nuôi cấy mô tế bào

về sau

1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu khá thành công về nhân giống lan

Năm 2002, tác giả Phạm Thị Liên đã nghiên cứu nhân giống Invitro

thành công cho một số loài địa lan ở khu vực phía Bắc Việt Nam và đưa ra quy trình nhân giống cho loài Địa lan Hạc đính nâu như sau: Khử trùng mẫu bằng dd HgCl2 0,1% trong 15 phút Đưa mẫu đã khử trùng vào môi trường F + 3% đường saccaro + 0,8% Agar + BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,7% mg/l + IBA 0,5mg/l Môi trường F + 3% đường saccaro + 0,8% Agar + 10% nước dừa + 0,5 mg/l NAA để tạo cây hoàn chỉnh

Năm 2003, trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng Lan Hồ Điệp

(Phalaenopsis) của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự cho thấy: Môi trường

thích hợp tạo vật liệu khởi đầu từ cơ quan sinh dưỡng là VW + 100 ml/l ND +

2 mg/l BA + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đường, môi trường thích hợp tạo nguồn

vật liệu khởi đầu từ hạt là VW + 100 ml/l ND+ 1g/l pepton + 10g/l đường + dịch nghiền khoai tây/cà rốt, môi trường tốt nhất cho phát sinh protocorm từ lát mỏng tế bào là VW + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đường, còn môi trường VW + 100 ml/l ND + 1g/l pepton + 10 g/l đường + 30g khoai tây+ 30g cà rốt là môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi

Năm 2004: Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt đã nhân giống in vitro thành công loài

lan Hài Hồng quý hiếm với cách gây vết thương rồi mới tiến hành nuôi cấy

Năm 2005, viện Di truyền nông nghiệp – Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh phong lan Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ của Khuất Hữu Trung

và cộng sự cho thấy: Môi trường phát sinh chồi từ chồi ngủ của phát hoa là

MS + 10% nước dừa + 3% đường + 1g/l than hoạt tính + 1mg/l BAP + 0,1mg/l NAA; môi trường tạo cây hoàn chỉnh từ chồi ngủ của phát hoa là MS + 10% nước dừa + 3% đường + 1g/l than hoạt tính + 0,1mg/l BAP+ 1,0 mg/l NAA Năm 2007, tác giả Nguyễn Thị Hồng Gấm và các cộng sự ở Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học – trường Đại học Lâm nghiệp đã tiến hành

Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis

gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm đạt kết quả tốt Khử

trùng quả lan trong 3 phút bởi cồn 70% + 5phút HgCl2 0,1% Môi trường gieo hạt tốt nhất: Knudson + 30 g/l đường+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa +7 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin Môi trường nhân nhanh thể chồi: Knudson +

30 g/l đường+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA Hệ số nhân thể chồi: 4,25 Môi trường tái sinh chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đường+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA Môi trường kéo dài chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đường + 100 g/l khoai tây + 100 ml/l nước dừa + 7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA + 0,2mg/l GA3 Môi trường ra rễ R2: Knudson cải tiến + 30g/l đường +100g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa + 7 g/l agar + 0,1 mg/l NAA

1.5 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô in vitro

1.5.1 Dựa trên tính toàn năng của tế bào

Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang toàn bộ lượng thông tin

di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Tuy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kỳ sinh trưởng, phát triển mà gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ thể điều hòa hoạt động của gen)

1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

+ Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phôi sinh ban đầu hình thành các tế bào mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều

cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó

từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hóa (có chức năng riêng biệt)

Sơ đồ các giai đoạn phân hóa của tế bào

+ Sự phản phân hóa tế bào: khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên hóa chúng vẫn không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong những trường hợp nhất định nếu chúng gặp điều kiện thích hợp lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình này gọi là sự phản phân hóa tế bào, nó ngược lại với quá trình phân hóa tế bào

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào

Sơ đồ mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra một tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào Như vậy quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Vậy

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chính là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa tế bào và trên cơ sở tính toàn năng của tế bào

Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin và Xytokinin Tỷ lệ của hai nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra

sự phát sinh hình thái khác nhau

1.6 Quy trình nhân giống in vitro

1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ Những

cây này phải khỏe mạnh, sạch bệnh đặc biệt là sạch bệnh virut và đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

Nuôi dưỡng, chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu để làm giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu

1.6.2 Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động

Đây là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần

đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Mô được lấy từ các phần non của cây (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ ) có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác [17] Mặt khác, khi lựa chọn mô nuôi cấy cũng cần chú ý đến tuổi sinh lý, tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hóa càng cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn

Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp, thường dùng các loại hoá chất như HgCL2 0,1% (trong 5-10 phút), NaOCL, Ca(OCl)2 5-7% (trong 15-

20 phút), dung dịch Br

1.6.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là 25- 27oC và 16h chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 Lux Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau

1.6.4 Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ xung một lượng nhỏ Auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường

nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

1.6.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây)

+ Có thời gian huấn luyện cây con (từ 1- 2 tuần tùy từng loại cây) để thích ứng với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi

+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước + Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [12]

1.7 Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

1.7.1 Hoạt hóa chồi nách

Sự phát triển của chồi nách được kích thích bằng cánh loại bỏ ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi và đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương thúc này sự phát triển chồi diễn ra theo hai cách:

+ Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách, trường hợp này thường xảy ra khi nuôi cấy cây hai lá mầm

+ Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách, trường hợp này thường gặp ở cây một lá mầm

1.7.2 Tạo chồi bất định

Với trường hợp này cần phải thực hiện quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào để bắt các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo

Ở các đối tượng một lá mầm như dứa, chuối, lan thường gặp sự phát triển cây qua giai đoạn protocom: cùng một lúc mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocom, các thể này hoặc tiếp tục sản sinh protocom mới hoặc phát triển thành cây

1.7.3 Tạo phôi vô tính

Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào để bắt các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo Nhưng phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm

Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo

1.8 Một số trường hợp thường gặp trong quá trình nuôi cấy in vitro

1.8.1 Tính bất định về mặt di truyền

Nhân giống in vitro có mục đích là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng lớn Tuy vậy, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma

Do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng sẽ dẫn đến tính bất định về mặt di truyền Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh

Tần số biến dị xảy ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại mô cấy, số lần cấy chuyển và kiểu di truyền hay giống cây trồng

1.8.2 Sự nhiễm mẫu

Khi khử trùng mẫu để dưa vào nuôi cấy thì các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn đều bị loại trừ Tuy nhiên, vẫn còn một số loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia sau 1- 2 tuần nuôi cấy Ta có thể khắc phục hiện tượng trên bằng cách:

+ Mẫu nhiễm virut: nên sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh thì có thể loại bỏ được virut

+ Mẫu nhiễm vi khuẩn: có thể sử dụng kháng sinh như Penicillin, Ampicillin với nồng độ khác nhau tùy vật liệu nuôi cấy

+ Mẫu nhiễm nấm: không nên giữ mẫu đã nhiễm nấm do bào tử nấm phát tán rất mạnh

1.8.3 Sự hóa nâu

Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen mẫu làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của cây Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy mô có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol (thường có nhiều ở

mô già hơn mô non) gây độc cho cây Có thể khắc phục hiện tượng hóa nâu bằng cách:

+ Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1- 0,3%) [15] Phương pháp này đặc biệt rất có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenosis, Cattleya, Aerides Nhưng than hoạt tính sẽ có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây

do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác + Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu một số cây ăn quả [15]

+ Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng

+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy

+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1-2 tuần) + Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trường tươi trong 1- 2 tuần

1.8.4 Hiện tượng thủy tinh hóa

Trong quá trình nhân nhanh in vitro thường thấy sự xuất hiện của hiện tượng cây bị “thủy tinh hóa” – thân, lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra môi trường do bị mất nước mạnh Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp

Để khắc phục hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành một số giải pháp sau:

+ Tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao để làm giảm sự hút nước của cây

+ Giảm các chất chứa nito trong môi trường

+ Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy

+ Sử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng

+ Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi

1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

1.9.1 mẫu cấy

Về nguyên tắc thì mọi loại tế bào (Như tế bào của mô rễ, thân, lá, hoa ) của một cơ thể thực vật đều có tình toàn năng nghĩa là vẫn có khả năng nuôi cấy thành công Tuy nhiên trên cùng một cây thì mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn các mô già Mẫu có tỷ lệ lớn mô phân sinh hiện diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể sẽ

thích hợp để nuôi cấy in vitro [13], [11]

1.9.2 Môi trường nuôi cấy

1.9.2.1 Môi trường vật lý

 Ánh sáng

Mẫu cấy ở trên môi trường có chưa một nguồn năng lượng sẵn có là đường, được sử dụng ít hay nhiều là tùy thuộc vào khả năng quang hợp của cây Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian chiếu sáng có vai trò trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, thích hợp là từ 12-18 h/ngày Cường độ ánh sáng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy thường từ 1000-7000 lux (Moresin, 1974) Cường độ ánh sáng cao sẽ kích thích sự phát triển của mô sẹo, còn cường độ ánh sáng thấp sẽ gây nên

sự tạo chồi [16] Bên cạnh đó, chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh

thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Vì vậy mà trong phòng thí nghiệm hay sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 – 3000 lux

 Nhiệt độ

Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô - tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây nuôi cấy in vitro Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại cây là trong khoảng 23- 280

C Một số loài cây cần nhiệt độ tối ưu để tạo hình

 Độ ẩm

Trong bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên trong quá trình nuôi cấy ta không cần quan tâm nhiều đến độ ẩm

 Môi trường in vitro

Môi trường bên trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy được gọi là môi

trường in vitro, môi trường này có ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển hình

thái của cây in vitro Khi tiến hành nhân giống in vitro cần tiến hành các biện pháp cân bằng CO2, tạo môi trường thích hợp cho cây có thể hấp thu và vận chuyển dinh dưỡng

1.9.2.2 Môi trường hóa học

Môi trường hóa học là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho

sự tăng trưởng và phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Cho đến nay có rất nhiều môi trường nuôi cấy được tìm ra nhưng công thức môi trường của Murashige và Skoog (1962, MS) thích hợp cho phần lớn các môi trường nuôi cấy in vitro Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật đều bao gồm:

a Nguồn cacbon:

Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng (hoàn toàn sử

dụng các chất dinh dưỡng của môi trường), do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế

bào và mô (Debengh, 1991) Nguồn cacbon ở đây là các loại đường, chúng có tác dụng giúp mô tế bào tổng hợp các chất hữu cơ, tăng sinh khối, ngoài ra còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Có hai loại đường thường được sử dụng là glucoze và saccarose [9]

b Các nguyên tố đa lượng

Các nguyên tố đa lượng gồm những nguyên tố khoáng như N, P, K, S, Mg, Ca , thường sử dụng ở nồng độ > 30 ppm Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc và giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào với môi trường được thuận lợi Những nguyên tố N (Dùng ở dạng NO3ˉ và NH4 +

riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau), S (Được sử dụng ở dạng muối SO4

2- nồng độ thấp còn dạng SO3

so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng phát triển bình thường của cây [14]

d Các vitamin

Nuôi cấy in vitro khi chồi tái sinh vẫn tổng hợp được vitamin nhưng không

đủ cho nhu cầu, do vậy phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy đặc biệt là vitamin B Tuỳ thuộc vào các loại mô nuôi cấy và giai đoạn nuôi cấy

mà hàm lượng vitamin bổ sung vào khác nhau Hai loại vitamin B1 và B6 thường được dùng nhất trong môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,1- 1 mg/l [9]

e Các dung dịch hữu cơ

Với một số loài cây cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số dung dịch hữu cơ để kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men, dịch thuỷ phân Casein Từ năm

1941 nước dừa đã được sử dụng vào trong nuôi cấy mô (nhất là trong các môi

trường nhân nhanh in vitro) Trong nước dừa có chứa các axit amine, axit hữu

cơ, ARN, ADN và những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxyton, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các gluxit của Xytokinin [14]

f Chất làm đông cứng môi trường

Aga (thạch) là một loại Polysacharid của tảo, có khả năng ngậm nước khá cao (6 – 12g/ lít) Việc lựa chọn môi trường rắn hay lỏng rất cần thiết cho sự phát triển của cây Môi trường có agar có tác dụng đỡ cây và tạo sự thoáng

khí, nhưng có thể làm giảm sự tiếp xúc của cây mầm để hấp thu dinh dưỡng

1.9.3 Các chất điều hòa sinh trưởng

1.9.3.1 Auxin

Auxin có tác dụng nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, quả Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích phân chia tế bào, kích thích sự hình thành rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả, tạo ra các rễ phụ [14]

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:

+ Indol acetic acid (IAA)

+ Naphthyl acetic acid (NAA)

+ Benzyladenine (BA)

+ 2,4D Dichlorophenol acetic acid (2,4D)

+ Indol butyric acid (IBA)

1.9.3.2 Gebberelin

Nhóm này có khoảng 20 loại hoocmon khác nhau nhưng quan trọng và

thường được sử dụng nhất là GA3 (Gibberelin acid 3) Đây là chất có tác

dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt, thân, cành cây Ngoài ra, nó còn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987), cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973) Bên cạnh đó, GA3 còn có tác dụng ảnh hưởng tới sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng của cây [4]

hãm sự hình thành chồi, nhưng ở giai đoạn muộn thì nó lại kích thích sự phát triển chồi Trong một số trường hợp, ethylen làm kìm hãm quá trình hình thành

rễ, nhưng ở một số trường hợp nó lại có tác dụng kích thích hình thành rễ [14] Ethylen còn gây hiệu quả sinh lý lên nhiều quá trình sinh lý khác nhau như gây lên tính hướng của cây, ức chế sinh trưởng của chồi bên, xúc tiến sự vận chuyển của auxin, tăng tính thẩm thấu của màng [8]

1.9.3.5 Các chất ức chế tăng trưởng

Có rất nhiều chất có tác dụng ức chế, trong số các chất nội sinh người ta tìm thấy nhiều chất có thành phần phenol và axit absicique

a Các chất ức chế có thành phần phenol

Trong nuôi cấy in vitro các chất phenol đôi lúc được phóng thích ra môi

trường cấy và gây hiện tượng oxy hóa, chất này đã gây ra sự hóa nâu cho môi trường dẫn đến sự chết của các mô thực vật Vì vậy mà trong một vài trường khi nuôi cấy, người ta thường sử dụng trong môi trường các chất chống oxy hóa hoặc là các chất hấp thụ để khử độc môi trường nuôi cấy

b Axit abcisique

Chất này được nhận dạng năm 1965 và từ đó nó được tìm thấy trong tất cả các loài thực vật Mặc dù là một chất ức chế sinh trưởng nhưng nó vẫn được dùng trong nuôi cấy mô tế bào Khi IBA tương tác với BAP sẽ cho hệ số nhân chồi cao hơn khi chỉ dùng BAP riêng rẽ [2]

1.9.3.6 Kết luận

Như vậy, trong nuôi cấy in vitro sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các

sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo sinh cơ quan là cơ bản: auxin và xytokinin

- Nếu tỷ lệ auxin/ xytokinin cao người ta sẽ thu được chức năng tạo rễ

- Nếu tỷ lệ auxin/ xytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân

- Nếu tỷ lệ này bằng 1 thì sẽ thu được sinh tạo mô sẹo

Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô- tế bào Nếu điều kiện không đảm bảo thì môi trường sẽ bị nhiễm, cây mô sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại Vì vậy, yêu cầu đặt ra là phải có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp kết hợp với các dụng cụ, thiết

bị nuôi cấy, khử trùng hiện đại

+ Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp khử trùng vật liệu ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và cồn trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra nồng độ, thời gian khử trùng và chất khử trùng thích hợp nhất

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh của mẫu cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo protocom

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo rễ)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm

QUY TRÌNH KHẢO NGHIỆM TỔNG QUÁT

Tạo chồi ban đầu

Đưa vào môi trường tái sinh

Đưa vào môi trường nuôi cấy

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp luận

- Các nhân tố chỉ tiêu phải chia thành những phương pháp khác nhau

- Các nhân tố không phải nghiên cứu phải đảm bảo đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm

- Số mẫu của các công thức thí nghiệm phải đủ lớn

- Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể

- Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố và

+ Số chai cho mỗi lần lặp lại: 3

- Đánh giá kết quả sau 4 - 6 tuần nuôi cấy

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy

 Mục đích:

- Tìm phương pháp khử trùng thích hợp

- Xác định nồng độ, thời gian khử trùng phù hợp nhất đối với quả lan

- Theo dõi biểu hiện của hạt

+ Đối với phương pháp đốt cồn: Nhúng quả vào cồn 900

và hơ nhanh qua ngọn lửa Nhanh chóng đặt quả lan vào đĩa petri, đậy lắp lại

+ Đối với phương pháp dùng hóa chất: Ngâm mẫu trong HgCl2 và thường xuyên lắc mẫu Rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3-4 lần cho sạch

- Sau đó quả lan sẽ được cắt gọt hai đầu và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan, tách làm hai

- Dùng dao giữ lấy phần vỏ quả, dùng panh lấy hết hạt lan ra đĩa petri

- Gieo hạt vào môi trường

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần một quả

 Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ mẫu sống, mẫu chết, mẫu nhiễm

Thời gian lần 1 (phút)

Nồng độ (%) Số lần đốt

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và nồng

độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy

 Mục đích: Tìm môi trường khoáng thích hợp để cấy mẫu

 Môi trường gieo hạt:

- Môi trường MS cải tiến (MS*), không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

- Môi trường MS cải tiến có bổ sung 1,5mg BA

- Môi trường Vacxin and Went (VW), không bổ sung chất ĐHST