tái sinh của mẫu cấy
Hiện nay, cĩ nhiều loại hĩa chất đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu lan trong nhân giống invitro, nhƣng phổ biến nhất vẫn là HgCl2. Phần lớn, khi khử trùng bằng HgCl2 đều cho tỷ lệ mẫu sống cao, tuy nhiên đây là chất đƣợc xếp vào nhĩm chất độc hại đối với cơ thể con ngƣời nên cần thận trọng khi sử dụng. Bên cạnh đĩ cĩ một số chất cũng đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu mà ít độc hại cho con ngƣời nhƣ Ca(OCl)2, cồn... Đề tài đã sử dụng hai loại hĩa chất là HgCl2 và cồn. Quả lan sau khi đƣợc khử trùng, gieo hạt vào mơi trƣờng nuơi cấy, sau 6 tuần theo dõi kết quả đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1a: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng HgCl2
CTTN Nồng độ HgCl2 (%) Thời gian (Phút) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) DC - - 0 0 100 CT1 0,1 5 83,33 0 16,67 CT2 0,1 10 96,67 3,33 0 CT3 0,3 5 86,67 10,00 3,33 CT4 0,3 10 73,33 26,67 0
Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng cồn CTTN Số lần đốt Tỷ lệ mẫu sống(%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) DC 0 0 0 100 CT1' 1 90,00 0 10,00 CT2' 2 66,67 30,00 3,33
Ở cả hai phƣơng pháp ta đều thấy mẫu hạt lan đƣợc gieo vào mơi trƣờng, sau 6 tuần theo dõi mẫu cĩ những biểu hiện khác nhau:
+ Với những mẫu sống và khơng nhiễm sau 1 tuần hạt bắt đầu thích nghi với mơi trƣờng và cĩ biểu hiện chuyển sang màu nâu vàng mật ong.
+ Những mẫu hạt bị ảnh hƣởng bởi HgCl2 và nhiệt độ cao thì hạt chuyển sang màu trắng và nâu đục, khơng phát triển.
Qua kết quả ở bảng 3.1a cho thấy:
Nồng độ HgCl2 0,1%, thời gian khử trùng 5 phút tỷ lệ mẫu sống và khơng nhiễm là 83,33%, mẫu khơng bị chết nhƣng tỷ lệ nhiễm khá cao (16, 67%). Cịn với thời gian khử trùng 10 phút, tỷ lệ mẫu sống và khơng nhiễm khá cao (96,67%), mẫu khơng bị nhiễm nhƣng bị chết với tỷ lệ nhỏ 3,33%.
Khi tăng nồng độ khử trùng lên thì tỷ lệ mẫu bị chết tăng theo và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần. Ở nồng độ 0,3%, thời gian khử trùng 5 phút tỷ lệ mẫu sống khá cao (86,67%), tỷ lệ mẫu chết là 10%, tỷ lệ mẫu nhiễm nhỏ (3,33%). Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút thì mẫu khơng nhiễm nhƣng tỷ lệ mẫu chết tăng cao (26,67%).
Quá trình ngâm quả lan trong dung dịch HgCl2, phần vỏ bên ngồi đã tiếp xúc trực tiếp với dung dịch khử trùng, cịn phần hạt bên trong khơng bị ảnh hƣởng, nên khi gieo hạt vào mơi trƣờng hạt cĩ khả năng phục hồi nhanh và nảy mầm. Tuy nhiên nếu tăng nồng độ và kéo dài thời gian khử trùng thì
dung dịch khử trùng sẽ ngấm vào bên trong vỏ quả gây ảnh hƣởng đến hạt làm hạt phục hồi chậm và cĩ thể bị hĩa trắng (chết).
Nhƣ vậy với các nồng độ HgCl2 đã đƣợc sử dụng trong các cơng thức thí nghiệm thì nồng độ 0,1% trong thời gian 10 phút là thích hợp nhất, cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất.
Qua kết quả ở bảng 3.1b cho thấy:
Khử trùng quả lan bằng phƣơng pháp đơt cồn thì mẫu hạt gieo bị nhiễm ít (10%). Nhƣng nếu tiến hành đốt 2 lần thì tỷ lệ mẫu chết cao (30%), cao hơn cả phƣơng pháp khử trùng bằng HgCl2 0,3% trong thời gian 10 phút. Khi đốt cồn 1 lần tỷ lệ mẫu sống là 90%, thấp hơn một chút so với khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút.
Khi nhúng quả lan vào cồn 960 và đốt, phần vỏ quả bên ngồi sẽ bị ảnh hƣởng trực tiếp của nhiệt độ cao, cũng nhờ nhiệt đĩ mà các tác nhân gây nhiễm bên ngồi vỏ đƣợc loại bỏ. Nhƣng nếu tăng số lần đốt lên 2 lần, nhiệt độ cao cùng với thời gian kéo dài sẽ gây ảnh hƣởng nhiều đến hạt bên trong, gieo hạt vào mơi trƣờng thấy hạt phục hồi chậm, cĩ thể hĩa nâu, khơng nảy mầm đƣợc.
Để so sánh ảnh hƣởng của các biện pháp khử trùng đến khả năng sống, chết, nhiễm của mẫu cấy chúng tơi dùng tiêu chuẩn Kruskal – Wallis trong SPSS. Qua phân tích, kết quả cho thấy:
Đối với mẫu sống: do xác suất của X2
= 0,008 < 0,05 nên H0 bị bác bỏ, cĩ nghĩa là các biện pháp khử trùng cĩ ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng sống của cây mẫu. Theo kết quả tính tốn ta cĩ số hạng trung bình của các cơng thức thí nghiệm xếp hạng theo thứ tự tăng dần nhƣ sau: ĐC (2.00) < CT2’(5,67) < CT(8.00) <CT1(12,67)<CT3(14,33)<CT1’(15,67)<CT2(18,67). Nghĩa là CT2 cĩ ảnh hƣởng rõ rệt nhất đến tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Đối với mẫu chết: Do xác suất X2
= 0,007 < 0,05 nên H0 bị bác bỏ, cĩ nghĩa là các biện pháp khử trùng cĩ ảnh hƣởng rõ rệt đến tỷ lệ chết và cơng thức thí nghiệm CT2’cĩ ảnh hƣởng rõ rệt nhất đến tỷ lệ chết của mẫu cấy.
Đối với mẫu nhiễm: Xác suất X2
= 0,026 < 0,05 nên H0 bị bác bỏ, nhƣ vậy các biện pháp khử trùng cĩ ảnh hƣởng rõ rệt đến tỷ lệ nhiễm và cơng thức CT1 cĩ ảnh hƣởng đến tỷ lệ chết của mẫu cấy.
Nhƣ vậy qua kết quả khử trùng mẫu bằng hai phƣơng pháp khác nhau ta thấy khi khử trùng quả lan bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút và đốt cồn 1 lần thì đều cho tỷ lệ sống và khơng nhiễm cao. Tuy nhiên HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút cĩ tính khử trùng mạnh hơn, cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ chết thấp hơn đốt cồn, nên đề tài chọn khử trùng bằng HgCl2 0,1%, trong thời gian 10 phút.
Hình 3.1a: Mẫu quả lan khử trùng.
Hình 3.1c: Hạt lan đƣợc gieo vào MT Hình 3.1d: Hạt gieo sống và khơng nhiễm