1.9.1 mẫu cấy
Về nguyên tắc thì mọi loại tế bào (Nhƣ tế bào của mơ rễ, thân, lá, hoa...) của một cơ thể thực vật đều cĩ tình tồn năng nghĩa là vẫn cĩ khả năng nuơi cấy thành cơng. Tuy nhiên trên cùng một cây thì mơ non nhƣ chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn các mơ già. Mẫu cĩ tỷ lệ lớn mơ phân sinh hiện diện hay những tế bào cĩ khả năng biểu hiện tính tồn thể sẽ thích hợp để nuơi cấy in vitro [13], [11].
1.9.2 Mơi trường nuơi cấy
1.9.2.1 Mơi trường vật lý
Ánh sáng
Mẫu cấy ở trên mơi trƣờng cĩ chƣa một nguồn năng lƣợng sẵn cĩ là đƣờng, đƣợc sử dụng ít hay nhiều là tùy thuộc vào khả năng quang hợp của cây.
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian chiếu sáng cĩ vai trị trong quá trình phát sinh hình thái của mơ nuơi cấy, thích hợp là từ 12-18 h/ngày. Cƣờng độ ánh sáng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mơ nuơi cấy. Cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mơ nuơi cấy thƣờng từ 1000-7000 lux (Moresin, 1974). Cƣờng độ ánh sáng cao sẽ kích thích sự phát triển của mơ sẹo, cịn cƣờng độ ánh sáng thấp sẽ gây nên sự tạo chồi [16]. Bên cạnh đĩ, chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh hình thái mơ thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mơ nuơi cấy trong ánh sáng xanh
thì sẽ ức chế sự vƣơn cao của mơ nhƣng lại ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mơ sẹo. Vì vậy mà trong phịng thí nghiệm hay sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cƣờng độ 2000 – 3000 lux.
Nhiệt độ
Nhiệt độ phịng nuơi cấy mơ - tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây nuơi cấy in vitro. Nhiệt độ tối ƣu cho nhiều loại cây là trong khoảng 23- 280
C. Một số lồi cây cần nhiệt độ tối ƣu để tạo hình.
Độ ẩm
Trong bình nuơi cấy thì độ ẩm tƣơng đối luơn bằng 100% nên trong quá trình nuơi cấy ta khơng cần quan tâm nhiều đến độ ẩm.
Mơi trƣờng in vitro
Mơi trƣờng bên trên và dƣới mặt thạch trong bình nuơi cấy đƣợc gọi là mơi trƣờng in vitro, mơi trƣờng này cĩ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển hình thái của cây in vitro. Khi tiến hành nhân giống in vitro cần tiến hành các biện pháp cân bằng CO2, tạo mơi trƣờng thích hợp cho cây cĩ thể hấp thu và vận chuyển dinh dƣỡng...
1.9.2.2 Mơi trường hĩa học
Mơi trƣờng hĩa học là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự tăng trƣởng và phân hĩa mơ trong suốt quá trình nuơi cấy in vitro. Cho đến nay cĩ rất nhiều mơi trƣờng nuơi cấy đƣợc tìm ra nhƣng cơng thức mơi trƣờng của Murashige và Skoog (1962, MS) thích hợp cho phần lớn các mơi trƣờng nuơi cấy in vitro. Mơi trƣờng nuơi cấy của hầu hết các lồi thực vật đều bao gồm:
a. Nguồn cacbon:
Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phƣơng thức dị dƣỡng (hồn tồn sử dụng các chất dinh dƣỡng của mơi trƣờng), do vậy ngƣời ta phải đƣa vào mơi trƣờng một lƣợng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng lƣợng cho tế
bào và mơ (Debengh, 1991). Nguồn cacbon ở đây là các loại đƣờng, chúng cĩ tác dụng giúp mơ tế bào tổng hợp các chất hữu cơ, tăng sinh khối, ngồi ra cịn đĩng vai trị là chất thẩm thấu chính của mơi trƣờng. Cĩ hai loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là glucoze và saccarose [9].
b. Các nguyên tố đa lƣợng
Các nguyên tố đa lƣợng gồm những nguyên tố khống nhƣ N, P, K, S, Mg, Ca..., thƣờng sử dụng ở nồng độ > 30 ppm. Các nguyên tố này cĩ chức năng cung cấp nguyên liệu để tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc và giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào với mơi trƣờng đƣợc thuận lợi. Những nguyên tố N (Dùng ở dạng NO3ˉ và NH4 +
riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau), S (Đƣợc sử dụng ở dạng muối SO4 2- nồng độ thấp cịn dạng SO3 2- và SO2
2- kém tác dụng thậm chí cịn gây độc cho mơi trƣờng nuơi cấy), P (Là nguyên tố mà mơ và tế bào thực vật nuơi cấy cĩ nhu cầu rất cao và thƣờng đƣợc đƣa vào mơi trƣờng ở dạng đƣờng Photpho.), K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tƣợng.
Bên cạnh đĩ cĩ Na+
và Cl -: Cần ở nồng độ thấp và đƣợc đƣa vào mơi trƣờng cùng với muối khống khi điều chỉnh pH mơi trƣờng
c. Các nguyên tố vi lƣợng
Các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot..., đƣợc sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (< 30 mg/l). Các nguyên tố này đĩng vai trị quan trọng trong các hoạt động của enzyme. Chúng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lƣợng để đảm bảo sinh trƣởng phát triển bình thƣờng của cây [14].
d. Các vitamin
Nuơi cấy in vitro khi chồi tái sinh vẫn tổng hợp đƣợc vitamin nhƣng khơng đủ cho nhu cầu, do vậy phải bổ sung vitamin vào mơi trƣờng nuơi cấy đặc biệt là vitamin B. Tuỳ thuộc vào các loại mơ nuơi cấy và giai đoạn nuơi cấy
mà hàm lƣợng vitamin bổ sung vào khác nhau. Hai loại vitamin B1 và B6 thƣờng đƣợc dùng nhất trong mơi trƣờng nuơi cấy với nồng độ 0,1- 1 mg/l [9]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
e. Các dung dịch hữu cơ
Với một số lồi cây cần phải bổ sung vào mơi trƣờng nuơi cấy một số dung dịch hữu cơ để kích thích sinh trƣởng mơ sẹo và các cơ quan nhƣ: nƣớc dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men, dịch thuỷ phân Casein...Từ năm 1941 nƣớc dừa đã đƣợc sử dụng vào trong nuơi cấy mơ (nhất là trong các mơi trƣờng nhân nhanh in vitro). Trong nƣớc dừa cĩ chứa các axit amine, axit hữu cơ, ARN, ADN và những hợp chất quan trọng cho nuơi cấy mơ nhƣ: Myoinoxyton, các hợp chất cĩ hoạt tính Auxin, các gluxit của Xytokinin [14].
f. Chất làm đơng cứng mơi trƣờng
Aga (thạch) là một loại Polysacharid của tảo, cĩ khả năng ngậm nƣớc khá cao (6 – 12g/ lít). Việc lựa chọn mơi trƣờng rắn hay lỏng rất cần thiết cho sự phát triển của cây. Mơi trƣờng cĩ agar cĩ tác dụng đỡ cây và tạo sự thống khí, nhƣng cĩ thể làm giảm sự tiếp xúc của cây mầm để hấp thu dinh dƣỡng.
1.9.3 Các chất điều hịa sinh trưởng
1.9.3.1 Auxin
Auxin cĩ tác dụng nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, quả... Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích phân chia tế bào, kích thích sự hình thành rễ, hình thành mơ sẹo, kìm hãm sự sinh trƣởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả, tạo ra các rễ phụ [14].
Trong nuơi cấy mơ thƣờng sử dụng các chất nhƣ: + Indol acetic acid (IAA)
+ Naphthyl acetic acid (NAA). + Benzyladenine (BA)
+ 2,4D Dichlorophenol acetic acid (2,4D). + Indol butyric acid (IBA).
1.9.3.2 Gebberelin
Nhĩm này cĩ khoảng 20 loại hoocmon khác nhau nhƣng quan trọng và thƣờng đƣợc sử dụng nhất là GA3 (Gibberelin acid 3). Đây là chất cĩ tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lĩng, đốt, thân, cành cây. Ngồi ra, nĩ cịn cĩ tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987), cũng nhƣ tạo chồi phụ (Street, 1973). Bên cạnh đĩ, GA3 cịn cĩ tác dụng ảnh hƣởng tới sự ra hoa của một số thực vật và cĩ tác dụng rút ngắn thời gian sinh trƣởng sinh dƣỡng của cây [4].
1.9.3.3 Các Xytokinin
Cytokinin cĩ tác dụng kích thích sự sinh trƣởng của tế bào cấy mơ và làm tăng tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ 10-6 – 10-5
M, nĩ cĩ tác dụng kích thích sự tạo chồi non, đồng thời ức chế sự phân hố rễ của mơ cấy. Ở nồng độ thấp 10-7 – 10-6
M chúng cĩ tác dụng kích thích sự phân bào. Trong nuơi cấy in vitro để kích thích sự nhân nhanh ngƣời ta thƣờng dùng xytokinin với nồng độ 10-6
– 10-4 [2].
Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì cĩ thể kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thơng thƣờng cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi và ngƣợc lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ.
Các hợp chất thƣờng đƣợc sử dụng là: + 6-Benzyla amino purin (BAP). + Kinetin (Ki).
+ Zeatin (Z).
+Thidiazuron (TDZ).
Trong số các hợp chất này thì Ki và BAP cĩ hoạt tính cao và giá thành rẻ nên đƣợc sử dụng rộng rãi nhất.
1.9.3.4 Ethylene
Ethylene là một cất khí đƣợc nhận dạng từ lâu trong các kho dự trữ quả. Ngƣời ta nghiệm thấy là tất cả các bộ phận của một cây cĩ khả năng sinh ra chất ethylen. Ethylen cĩ biểu hiện tác động hai chiều: Ở giai đoạn sớm, nĩ sẽ kìm
hãm sự hình thành chồi, nhƣng ở giai đoạn muộn thì nĩ lại kích thích sự phát triển chồi. Trong một số trƣờng hợp, ethylen làm kìm hãm quá trình hình thành rễ, nhƣng ở một số trƣờng hợp nĩ lại cĩ tác dụng kích thích hình thành rễ [14]. Ethylen cịn gây hiệu quả sinh lý lên nhiều quá trình sinh lý khác nhau nhƣ gây lên tính hƣớng của cây, ức chế sinh trƣởng của chồi bên, xúc tiến sự vận chuyển của auxin, tăng tính thẩm thấu của màng [8].
1.9.3.5 Các chất ức chế tăng trưởng
Cĩ rất nhiều chất cĩ tác dụng ức chế, trong số các chất nội sinh ngƣời ta tìm thấy nhiều chất cĩ thành phần phenol và axit absicique.
a. Các chất ức chế cĩ thành phần phenol
Trong nuơi cấy in vitro các chất phenol đơi lúc đƣợc phĩng thích ra mơi trƣờng cấy và gây hiện tƣợng oxy hĩa, chất này đã gây ra sự hĩa nâu cho mơi trƣờng dẫn đến sự chết của các mơ thực vật. Vì vậy mà trong một vài trƣờng khi nuơi cấy, ngƣời ta thƣờng sử dụng trong mơi trƣờng các chất chống oxy hĩa hoặc là các chất hấp thụ để khử độc mơi trƣờng nuơi cấy.
b. Axit abcisique (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chất này đƣợc nhận dạng năm 1965 và từ đĩ nĩ đƣợc tìm thấy trong tất cả các lồi thực vật. Mặc dù là một chất ức chế sinh trƣởng nhƣng nĩ vẫn đƣợc dùng trong nuơi cấy mơ tế bào. Khi IBA tƣơng tác với BAP sẽ cho hệ số nhân chồi cao hơn khi chỉ dùng BAP riêng rẽ [2].
1.9.3.6 Kết luận
Nhƣ vậy, trong nuơi cấy in vitro sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vƣợt qua các sự cân bằng giữa chất điều hịa với nhau và trong số đĩ cĩ hai chất chính mà vai trị tạo sinh cơ quan là cơ bản: auxin và xytokinin.
- Nếu tỷ lệ auxin/ xytokinin cao ngƣời ta sẽ thu đƣợc chức năng tạo rễ. - Nếu tỷ lệ auxin/ xytokinin thấp, mơ sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân.
- Nếu tỷ lệ này bằng 1 thì sẽ thu đƣợc sinh tạo mơ sẹo.
Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuơi cấy mơ- tế bào. Nếu điều kiện khơng đảm bảo thì mơi trƣờng sẽ bị nhiễm, cây mơ sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại. Vì vậy, yêu cầu đặt ra là phải cĩ phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp kết hợp với các dụng cụ, thiết bị nuơi cấy, khử trùng hiện đại.
1.9.5 Phịng nuơi
Phịng nuơi là nơi dùng để đặt các mẫu nuơi cấy. Phịng nuơi cần đảm bảo điều kiện:
+ Nhiệt độ: 25- 300 C
+ Ánh sáng đạt: 2000 – 3000 lux
CHƢƠNG II
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phƣơng pháp khử trùng vật liệu ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và cồn trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra nồng độ, thời gian khử trùng và chất khử trùng thích hợp nhất.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng nuơi cấy đến khả năng tái sinh của mẫu cấy.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng đến khả năng tạo protocom
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hịa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng đến giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh (giai đoạn tạo rễ).
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm.
QUY TRÌNH KHẢO NGHIỆM TỔNG QUÁT
Chồi, hạt lan Trần mộng xuân (Cymbidium nowianum)
Khử trùng chồi, hạt
Tạo chồi ban đầu
Đƣa vào mơi trƣờng tái sinh
Đƣa vào mơi trƣờng nuơi cấy
Protocom
Chồi
chơ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đƣa vào mơi trƣờng nuơi cấy Nhân nhanh
Cây hồn chỉnh
Đƣa vào mơi trƣờng ra rễ Nhân nhanh
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp luận
- Các nhân tố chỉ tiêu phải chia thành những phƣơng pháp khác nhau. - Các nhân tố khơng phải nghiên cứu phải đảm bảo đồng nhất giữa các cơng thức thí nghiệm.
- Số mẫu của các cơng thức thí nghiệm phải đủ lớn - Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3.
2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể
- Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên đơn yếu tố và
hai yếu tố: + Số lần lặp lại: 3
+ Số chai cho mỗi lần lặp lại: 3 - Đánh giá kết quả sau 4 - 6 tuần nuơi cấy
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
Mục đích:
- Tìm phƣơng pháp khử trùng thích hợp
- Xác định nồng độ, thời gian khử trùng phù hợp nhất đối với quả lan. - Theo dõi biểu hiện của hạt.
Phƣơng pháp và hĩa chất sử dụng: - Phƣơng pháp đốt cồn.
- Phƣơng pháp hĩa chất: Dùng HgCl2.
Bố trí thí nghiệm:
- Quả lan đƣợc thu hái từ những cây bố mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh và sinh trƣởng tốt ở Sapa.
- Mẫu đƣợc khử trùng thơ ở ngồi bằng dung dịch xà phịng lỗng rồi rửa sạch dƣới vịi nƣớc chảy và rửa lại bằng nƣớc cất vơ trùng.
- Đƣa mẫu vào trong box cấy rửa bằng cồn 700 trong 1 phút, sau đĩ rửa lại bằng nƣớc cất vơ trùng 2- 3 lần.
+ Đối với phƣơng pháp đốt cồn: Nhúng quả vào cồn 900
và hơ nhanh qua ngọn lửa. Nhanh chĩng đặt quả lan vào đĩa petri, đậy lắp lại.
+ Đối với phƣơng pháp dùng hĩa chất: Ngâm mẫu trong HgCl2 và thƣờng xuyên lắc mẫu. Rửa lại mẫu bằng nƣớc cất vơ trùng 3-4 lần cho sạch.
- Sau đĩ quả lan sẽ đƣợc cắt gọt hai đầu và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan, tách làm hai.
- Dùng dao giữ lấy phần vỏ quả, dùng panh lấy hết hạt lan ra đĩa petri. - Gieo hạt vào mơi trƣờng.
- Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần một quả
Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ mẫu sống, mẫu chết, mẫu nhiễm + Tình trạng mẫu.
Bảng 2.1: Cơng thức khử trùng cho từng loại mẫu
Vật liệu CT TN Cơng thức khử trùng HgCl2 Cồn Nồng độ (%) Thời gian lần 1 (phút) Nồng độ (%) Số lần đốt Quả CT1 0,1 5 96 1 CT2 0,1 10 96 2 CT3 0,3 5 CT4 0,3 10 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường và nồng độ chất điều hịa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy độ chất điều hịa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
Mục đích: Tìm mơi trƣờng khống thích hợp để cấy mẫu.
Mơi trƣờng gieo hạt:
- Mơi trƣờng MS cải tiến (MS*), khơng bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng. - Mơi trƣờng MS cải tiến cĩ bổ sung 1,5mg BA.
Bố trí thí nghiệm:
- Lấy các quả lan đã đƣợc khử trùng ở thí nghiệm 1 đem gieo vào 4 loại