Nghiên cứu nhân giống một số dòng tếch (tectona grandis linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Tr-ờng đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ D-ơng Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp H Tây 2007 Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Tr-ờng đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ D-ơng Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60.62.60 Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp Ng-ời h-ớng dẫn : T.S Hà huy thịnh H Tây 2007 Lời nói đầu Nâng cao chất l-ợng đào tạo nghiên cứu khoa học mục tiêu quan trọng việc đào tạo cao học Tr-ờng đại học Lâm nghiệp Để hoàn thành ch-ơng trình đào tạo Cao học Lâm nghiệp khoá học 2005- 2007, đ-ợc đồng ý Khoa sau đại học - Tr-ờng Đại học Lâm nghiệp, thực đề tài tốt nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Đ-ợc trí Ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng, đề tài đ-ợc thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô - Trung tâm nghiên cứu giống rừng Để đạt đ-ợc kết học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả nhận đ-ợc quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt Tr-ờng đại học Lâm nghiệp, đặc biệt Khoa sau đại học, tất thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, nh- lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng Cho phép đ-ợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy, cô giáo, đặc biệt T.S Hà Huy Thịnh Th.S Đoàn Thị Mai, toàn thể cán công nhân viên trung tâm tận tình h-ớng dẫn, bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn Trong luận văn tránh khỏi khiếm khuyết, mong đ-ợc bảo bổ sung ý kiến nhà khoa học, bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu đ-ợc hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Tây, Ngày 25/09/2007 Tác giả Đặt vấn đề Theo định thủ t-ớng phủ (QĐ số 17/2006/NĐ-TTg), đến năm 2020 phải tạo giống trồng, vật nuôi có suất cao, chất l-ợng hiệu kinh tế cao phục vụ tốt nhu cầu chuyển đổi cấu kinh tế lĩnh vực Nông nghiệp Phát triển nông thôn Một nhiệm vụ ngành Lâm nghiệp phát triển vi nhân giống đáp ứng đủ nhu cầu giống Lâm nghiệp vào năm 2015 [16] Tếch loài sinh tr-ởng nhanh có biên độ sinh thái rộng gỗ Tếch đ-ợc sử dụng phổ biến xây dựng làm đồ gỗ gia dụng có khả chống mối mọt, chịu n-ớc lâu ngày, mặt gỗ có độ bóng cao Trong công nghiệp chế biến gỗ: Tếch loài có chất l-ợng gỗ mịn bóc tách thành mỏng Do gỗ Tếch có tỷ trọng nhẹ, bị hà bám, chịu va đập ngâm n-ớc mặn nên đ-ợc dùng công nghiệp đóng tàu Mặt khác, nhu cầu th-ơng mại gỗ Tếch ngày tăng thay số loài gỗ quý khác[42] Cây Tếch đ-ợc trồng thăm dò n-ớc ta vào khoảng năm 30 kỷ 20 Lúc đầu, Tếch đ-ợc trồng thử công viên đ-ờng phố nhiều tỉnh nh-: Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, Lai Châu, Hà Nội, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh, Sài Gòn Cũng thời gian riêng Lộc Ninh, Tỉnh Bình Ph-ớc gây trồng Tếch thành khu rừng nhỏ Vào năm 60, với nguồn giống thu hái từ Lộc Ninh trồng thành công khu rừng Tếch 200 Định Quán, tỉnh Đồng Nai khu rừng Tếch Eak Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, Tếch đ-ợc trồng mở rộng nhiều lâm tr-ờng tỉnh miền Đông Nam Bộ Tây Nguyên nh-: Đồng Nai, Bình Ph-ớc, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, Kom TumNhưng chưa có giống cải thiện nên chất lượng rừng không cao, suất rừng trồng Tếch n-ớc ta thấp (9 12m3/ năm) [17] Hiện nay, diện tích rừng Tếch trồng n-ớc giới năm tăng nhanh, nhiều Indonesia khoảng 1.760 nghìn ha, ấn Độ khoảng 2.450 nghìn ha, Myanmar 139 nghìn ha, Malaysia khoảng nghìn ha, Thái Lan 836 nghìn [29] Việt Nam, diện tích trồng Tếch đạt 1.500 ha, so với n-ớc khu vực nhiều nguyên nhân khác mà thiếu giống đ-ợc cải thiện nguyên nhân quan trọng Chính công tác chọn tạo nhân giống số dòng tếch có suất cao vấn đề cần thiết Hiện nay, giống sản xuất từ hạt đ-ợc sử dụng phổ biến nh-ng không đáp ứng đ-ợc nhu cầu trồng rừng rừng giống chuyên canh, hạt giống thu hái xô bồ nên phẩm chất hạt Hơn cách nhân giống gây t-ợng phân ly tính trạng thụ phấn tự làm cho trồng không đồng dẫn đến suất rừng biến động Một khó khăn suất hạt thấp (1 rừng 15 tuổi cho khoảng 50 kg hạt) Không thế, hạt Tếch tự nhiên có khả nảy mầm thấp, v-ờn -ơm tỷ lệ nảy mầm không cao, đạt khoảng 5-10% [28] [42] Để khắc phục nh-ợc điểm giải pháp nhân giống sinh d-ỡng ngày đ-ợc quan tâm Tuy nhiên loài Tếch ph-ơng pháp nhân giống vô tính hom gặp nhiều khó khăn tỷ lệ rễ không cao đạt khoảng 24-30% [3] Chính lý nên giải pháp nhân giống sinh d-ỡng nuôi cấy mô tế bào đ-ợc quan tâm nghiên cứu Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, gọi nhân giống in vitro, ph-ơng pháp sản xuất từ chồi v-ợt mẹ cách nuôi cấy chúng ống nghiệm, điều kiện vô trùng tuyệt môi tr-ờng thích hợp kiểm soát điều kiện hoàn cảnh đồng Nuôi cấy mô tế bào nhân nhanh với số l-ợng lớn khoảng thời gian ngắn, đ-ợc tiến hành điều kiện phòng thí nghiệm nên hoàn toàn chủ động sản xuất Ngoài ra, kỹ thuật giúp tạo giống mới, tạo nguồn bệnh, tạo có độ đồng cao trì đ-ợc đặc tính tốt mẹ Từ lý đề tài Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân giống Xoan ta Tếch có suất cao Ch-ơng Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm sở khoa học ph-ơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm Nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật hay gọi vi nhân giống ph-ơng pháp sản xuất hàng loạt từ chồi non (cơ quan, mô tế bào) cách nuôi cấy chúng ống nghiệm điều kiện vô trùng tuyệt môi tr-ờng thích hợp đ-ợc kiểm soát Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy in vitro phạm trù khái niệm tất loại nuôi cấy mô tế bào điều kiện vô trùng, bao gồm: Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật Nuôi cấy phận đ-ợc tách khỏi thực thể thực vật: nuôi cấy quan Nuôi cấy phôi thành thục hay ch-a thành thục đ-ợc tách khỏi thể thực vật: nuôi cấy phôi Nuôi cấy mô bắt nguồn từ quan thực vật: nuôi cấy mô hay nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy tế bào đơn lẻ hay cụm tế bào nhỏ môi tr-ờng lỏng Nuôi cấy tế bào thực vật sau tách bỏ vỏ tế bào, gọi nuôi cấy tế bào trần (protoplast) [14] 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào * Tính toàn (totipotence) Năm 1902 lần nhà thực vật học ng-ời Đức Haberlandt đ-a quan niệm: Mỗi tế bào (đã biệt hoá) lấy từ thể thực vật có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ biệt hoá chứa toàn thông tin di truyền (ADN) cần thiết thể đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh, tính toàn tế bào thực vật Tính toàn tế bào sở lý luận nuôi cấy mô tế bào Cho đến nay, ng-ời hoàn toàn chứng minh đ-ợc khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ * Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật tr-ởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự phân hoá tế bào chuyển hoá tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhận chức khác thể Quá trình phân hoá biểu thị nh- sau: Phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá Sơ đồ 1.1: Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào Quá trình gồm có giai đoạn - Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy mô phân sinh làm cho số l-ợng tế bào tăng lên cách đáng kể - Sự dãn tế bào: Tế bào dãn chiều ngang chiều dọc làm tăng kích th-ớc quan nói riêng toàn thể nói chung Sau hai giai đoạn với trình biệt hoá tế bào phân hoá thành mô có chức riêng biệt, đảm nhận vai trò khác thể sống Tuy nhiên, tế bào phân hoá thành mô chức chúng không hoàn toàn khả phân chia Trong điều kiện định tế bào lại trở thành dạng tế bào phôi sinh tiếp tục trình phân chia cho tế bào có khả tái sinh thành hoàn chỉnh Đây trình phản phân hoá tế bào Về chất phân hoá phản phân hoá trình điều hoà hoạt hoá gen Tại thời điểm trình phát triển cá thể, có số gen bị ức chế đ-ợc hoạt hoá trở lại để tạo tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo ch-ơng trình đ-ợc mã hoá cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể, th-ờng bị ức chế tế bào xung quanh Khi tế bào đ-ợc tách riêng ra, gặp điều kiện thuận lợi gen đ-ợc hoạt hoá, trình diễn biến theo ch-ơng trình định sẵn gen 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị Mục đích giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo nguồn mẫu để phục vụ cho b-ớc Giai đoạn coi nh- b-ớc hoá vật liệu để nuôi cấy Cây giống đ-ợc đ-a khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi tr-ờng mới, đồng thời giảm bớt khả nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy chủ động công tác nhân giống Trong tr-ờng hợp cần thiết làm trẻ hoá vật liệu giống 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động Mục đích giai đoạn tạo chồi từ mô nuôi cấy Khi có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu xử lý điều kiện vô trùng Ng-ời ta th-ờng dùng số hoá chất nh- HgCl 2, Ca(Ocl)2, H2O2 để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mô nuôi cấy phận (thân, rễ, lá, hoa quả) nh-ng theo Bhatt mô lấy từ phần non có khả nuôi cấy thành công cao mô lấy từ phận tr-ởng thành khác [29] Vì vậy, ng-ời ta th-ờng lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro Ngoài ra, lựa chọn mô nuôi cấy cần ý tuổi sinh lý mô thấp độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy thời kỳ sinh tr-ởng mạnh mùa sinh tr-ởng cho khả tái sinh tốt (Anolesnon 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu nuôi cấy bổ sung than hoạt tính Polyvinylpyrroline (PVP) vào môi tr-ờng [8] Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh tr-ởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào việc chọn phận nuôi cấy, lấy mẫu cần đảm bảo nguyên tắc nêu Giai đoạn th-ờng kéo dài tuần 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh Một -u điểm ph-ơng pháp nhân giống in vitro so với ph-ơng pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao Vì vậy, coi giai đoạn then chốt toàn trình nhân giống Hệ số nhân giai đoạn biến động từ đến 50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi tr-ờng ph-ơng pháp nhân Để tạo hệ số nhân cao cần lựa chọn môi tr-ờng điều kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn vai trò chất điều hoà sinh tr-ởng (Auxin, Cytokinin) quan trọng để sản sinh l-ợng tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền Theo nguyên tắc chung môi tr-ờng có nhiều Cytokinin kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy th-ờng 25 27oC 10 16 chiếu sáng/ngày, c-ờng độ ánh sáng 1000 3000lux Yêu cầu giai đoạn tạo số l-ợng tối đa thời gian ngắn nh-ng đảm bảo sức sống chất di truyền 1.2.4 Tạo hoàn chỉnh (cho rễ) Đây giai đoạn chuẩn bị cho chuyển hệ thống vô trùng đạt đ-ợc kích th-ớc định, chồi đ-ợc chuyển từ môi tr-ờng giai đoạn sang môi tr-ờng tạo rễ Th-ờng sau tuần chồi xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Môi tr-ờng tạo rễ đ-ợc giảm l-ợng Cytokinin tăng l-ợng Auxin để tạo điều kiện thuận lợi cho rễ chồi Ng-ời ta th-ờng dùng chất NAA (Axit -naphtyl axetic), IBA (Axit -indol butyric) IAA (Axit -indol axetic) nồng độ 1mg/lít đến mg/lít để tạo rễ cho hầu hết loài trồng Giai đoạn th-ờng kéo dài từ tuần lễ, sau đ-ợc chuyển sang môi tr-ờng Auxin để rễ phát triển giai đoạn nhạy cảm với ẩm độ bệnh tật hoạt động rễ phát sinh yếu, ch-a chuyển sang giai đoạn tự d-ỡng 1.2.5 Đ-a môi tr-ờng tự nhiên Đây giai đoạn chuyển dần từ ống nghiệm nhà kính trời Cây mô đ-ợc chuyển từ môi tr-ờng dị d-ỡng sang môi tr-ờng tự d-ỡng nên phải tập cho quen dần với môi tr-ờng tự nhiên, tránh thay đổi đột ngột làm sốc bị chết Khi cứng cáp đạt tiêu chuẩn định chiều cao, số số rễ đ-a giá thể Giá thể tiếp nhận in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng n-ớc bệnh Phải giữ ẩm cho đ-a từ bình nuôi ra, cần trì độ ẩm 50% để không n-ớc làm giàn che để tránh ánh sáng mạnh Sau tuần đ-a mô sinh tr-ởng ổn định, chăm sóc mô t-ơng tự chế độ chăm sóc hom từ hạt 67 Bảng 3.9: Kết vào mẫu số dòng Tếch (90 mẫu/dòng) Dòng Tỷ lệ nhiễm (%) TL chết (%) TL bật chồi (%) ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 TB F SigF 77,78 80 78,89 78,89 77,78 80 78,89 77,78 76,67 76,67 80,00 0,612 0,996 11,11 6,67 10 11,11 13,33 10 8,89 8,89 11,11 8,89 10,00 0,821 0,611 11,11 13,33 11,11 10,00 8,89 10,00 12,22 13,33 12,22 14,44 11,67 0,415 0,912 Cũng giống nh- kết vào mẫu thí nghiệm 1, tỷ lệ nhiễm Tếch cao (trên 76,67%) Tỷ lệ bật chồi dòng biến động khoảng 8,89%14,44% trung bình 11,67% gần t-ơng đ-ơng với thí nghiệm 1(13,70%) Các dòng VN cho tỷ lệ bật chồi cao nhất, lớn mức trung bình (12,22%14,44%) tiếp đến dòng MD ID cho tỷ lệ bật chồi 11,11%-13,33%, dòng Tếch Thái Lan cho tỷ lệ bật chồi thấp (8,89%-10%) Mặc dù có sai khác song kết phân tích ph-ơng sai tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ bật chồi nh- tỷ lệ chết dòng Tếch khác có xác suất F tính lớn 0,05 tỷ lệ bật chồi dòng Tếch có nguồn gốc khác sai khác rõ rệt Nh- vậy, dòng Tếch có phản ứng nh- với công thức khử trùng hay sử dụng loại hoá chất khử trùng cho tất dòng Tếch khác Tóm lại, công thức khử trùng thích hợp cho tất dòng Tếch HgCl 0,05% thời gian 10 phút 68 3.4.2 So sánh khả nhân chồi 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác Thí nghiệm nhân chồi sử dụng môi tr-ờng MS cải tiến có bổ sung BAP 0,7mg/l NAA 0,5mg/l Mỗi thí nghiệm đ-ợc tiến hành với 50 chồi lặp lại lần, kết đ-ợc tổng hợp phụ biểu 10, bảng 3.11 hình 3.9 d-ới đây: Bảng 4.10: Kết nhân chồi số dòng Tếch Dòng Hệ số nhân (lần) Chiều dài chồi (cm) Số TB/chồi (lá) X Sd X Sd X Sd ID 1,89 0,05 4,63 0,34 6,80 1,00 MD1 2,01 0,05 5,12 0,34 7,23 1,20 MD4 1,65 0,39 4,61 0,36 6,78 0,94 TL1 1,58 0,36 4,61 0,33 6,73 0,96 TL2 1,64 0,35 4,59 0,31 7,13 1,27 TL5 1,66 0,30 4,53 0,35 6,75 0,97 VN18 1,88 0,24 4,62 0,35 6,79 1,00 VN21 2,05 0,11 5,23 0,31 7,17 1,25 VN22 1,87 0,10 5,05 0,32 7,14 1,27 VN9 2,04 0,06 4,95 0,32 7,09 1,25 TB 1,83 0,20 4,59 0,33 6,96 1,11 F 24,24 0,340 1,008 SigF 0,000 0,961 0,433 69 Lần 2.50 2.00 1.89 2.05 2.01 1.88 2.04 1.87 1.65 1.58 1.64 1.66 1.50 Hệ số nhân (lần) 1.00 0.50 Dòng 0.00 ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 Hình 3.9: Biểu đồ hệ số nhân chồi số dòng Tếch Kết cho thấy dòng trội Tếch có nguồn gốc khác cho kết nhân chồi không giống Hệ số nhân chồi biến động khoảng 1,58-2,05 lần, trung bình 1,83 lần Tốt dòng Tếch Việt Nam hệ số nhân chồi đạt 1,87-2,05 lần, tiếp đến dòng ID MD (1,65-2,01lần) cuối dòng TL hệ số nhân chồi thấp giá trị trung bình (1,58-1,66lần) Kết phân tích ph-ơng sai cho thấy xác suất F tính hệ số nhân nhỏ 0,05 nên dòng Tếch khác có sai khác rõ rệt Cùng nuôi cấy loại môi tr-ờng nh-ng hệ số nhân chồi dòng Tếch có nguồn gốc khác không giống Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy hệ số nhân dòng VN21, VN9 MD1 (2,05lần, 2,04lần 2,01lần) tốt tiếp đến dòng ID, VN18 VN22 (1,89lần, 1,88lần 1,87lần) cuối dòng TL5, MD4, TL2 TL1 (hệ số nhân thấp 1,66lần) Xác suất F tính chiều dài chồi số trung bình/chồi dòng Tếch lớn 0,05 có nghĩa sai khác dòng Tếch có nguồn gốc khác Chiều dài chồi tất 70 dòng lớn 4,53 cm số lá/chồi lớn 6,73lá/chồi, chồi đều, khoẻ đẹp, xanh tốt Trong thí nghiệm nhân chồi dòng Tếch Việt Nam có hệ số nhân chồi tốt tiếp đến dòng Malaysia Indoneisa, cuối dòng Tếch Thái Lan Chất l-ợng chồi tất dòng Tếch thí nghiệm tốt đ-ợc nuôi cấy môi tr-ờng dinh d-ỡng thích hợp nên chồi lên khoẻ, đẹp, cứng cáp, xanh tốt Nh- vậy, phản ứng dòng Tếch môi tr-ờng nhân chồi không giống nhau, hệ số nhân dòng có sai khác rõ rệt song chất l-ợng chồi tất dòng tốt nên sử dụng môi tr-ờng để nhân giống cho dòng trội Tếch Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để xác định môi tr-ờng nhân chồi thích hợp cho dòng trội Tếch để nâng cao hệ số nhân chồi VN9 VN21 MD1 VN22 VN18 ID MD4 TL5 TL1 ảnh 6: ảnh nhân chồi số dòng Tếch TL2 71 4.4.3 So sánh khả rễ 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác Chồi đạt tiêu chuẩn 10 dòng Tếch có nguồn gốc khác đ-ợc xử lý thuốc kích thích rễ IBA 1,0% cấy vào cát Mỗi thí nghiệm đ-ợc tiến hành với 50 mẫu lặp lại lần Kết đ-ợc tổng hợp phụ biểu 12, bảng 3.11 hình 3.10 d-ới đây: Bảng 3.11: Kết rễ số dòng Tếch Dòng Tỷ lệ rễ (%) Số rễ TB/chồi Chiều dài (rễ) TB/rễ (cm) Chỉ số rễ X Sd X Sd X Sd X Sd ID 89.91 1.57 2.30 0.22 2.27 0.17 4.97 0.83 MD1 92.32 7.46 2.14 0.27 2.02 0.23 4.56 1.00 MD4 96.33 0.96 2.35 0.47 2.01 0.32 4.62 0.66 TL1 91.67 3.46 1.95 0.45 1.91 0.25 4.04 1.01 TL2 85.93* 2.49 1.96 0.45 1.70 0.18 3.85 0.98 TL5 84.33* 2.54 1.71* 0.36 1.85 0.22 3.14 0.60 VN18 92.55 4.65 2.38 0.19 2.04 0.24 4.55 1.11 VN21 98.98 0.09 2.16 0.38 2.09 0.23 4.19 1.03 VN22 97.98 0.86 2.11 0.42 2.15 0.30 4.41 1.22 VN9 97.78 0.89 2.50 0.35 2.19 0.34 5.47 1.18 TB 92.78 2.50 2.16 0.36 2.02 0.25 4.38 0.96 F 72,141 12,415 13,213 12,621 SigF 0,000 0,000 0,000 0,000 (* Sai khác rõ rệt với tất dòng lại) 72 % 100.00 98.98 96.33 95.00 90.00 92.32 97.98 97.78 92.55 91.67 89.91 85.93 85.00 84.33 TL re 80.00 Dòng 75.00 ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 Hình 3.10: Biểu đồ tỷ lệ rễ số dòng Tếch Cũng giống nh- kết thí nghiệm 7, dòng trội Tếch cho tỷ lệ rễ cao, biến động khoảng 84,33%-98,98% trung bình 92,78% Các dòng Tếch khác có phản ứng không giống với loại chất kích thích rễ Các dòng VN có tỷ lệ rễ cao (92,55%-98,98%) tiếp đến dòng MD (92,32-96,33%) cuối dòng ID TL (84,33%-91,67%) Kết phân tích ph-ơng sai cho thấy xác suất F tính đ-ợc tỷ lệ rễ nhỏ 0,05 nên dòng Tếch khác có sai khác rõ rệt Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy dòng VN9, VN22, VN21 MD4 có tỷ lệ sống cao (trên 96,33%) tiếp đến dòng VN18, MD1, TL1 (91,6692,54%) cuối dòng ID, TL2 TL5 tỷ lệ rễ nhỏ 90% 73 Cũng t-ơng tự nh- kết thí nghiệm số rễ TB/chồi dòng Tếch không cao, biến động khoảng 1,71-2,38rễ/chồi, trung bình 2,16rễ/chồi Trong 10 dòng thí nghiệm dòng TL có số rễ trung bình/chồi thấp (nhỏ 2rễ/chồi) dòng lại số rễ trung bình/chồi lớn 2rễ/chồi Kết phân tích ph-ơng sai cho F tính = 12,415 có mức ý nghĩa nhỏ 0,05 điều chứng tỏ có khác số rễ TB/chồi dòng Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy số rễ TB/chồi đ-ợc chia thành nhóm nh-ng nhóm sai khác rõ ràng Dùng tiêu chuẩn Bonferroni để so sánh cặp với cho thấy dòng TL5 sai khác với tất dòng Giữa dòng lại sai khác không rõ rệt Nh- vậy, phản ứng dòng trội Tếch có nguồn gốc khác với loại chất kích thích rễ không giống Song, tỷ lệ rễ tất dòng thí nghiệm cao (trên 84,33%), số rễ t-ơng đối cao (trên 3,14) nên sử dụng thuốc kích thích rễ IBA 1,0% để rễ cho Tếch Song, cần tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm rễ cho dòng trội để tìm loại hoá chất nồng độ xử lý thích hợp Nhìn chung, từ giai đoạn vào mẫu đến nhân chồi rễ dòng Tếch Việt Nam cho kết tốt tiếp đến dòng có nguồn gốc từ Inđonêsia Malaysia cuối dòng Tếch Thái Lan Kết giải thích nh- sau: Quá trình nhân giống in vitro chịu ảnh h-ởng nhiều nhân tố khác nh- môi tr-ờng nuôi cấy (các loại chất khoáng đa lượng, vi lượng, Vitamin ), điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm,), nhân tố di truyền, thời gian cấy chuyển ảnh h-ởng qua lại nhân tố Trong đó, nhân tố di truyền có ảnh h-ởng lớn đến khả nhân giống nh- sinh tr-ởng phát triển sau Hơn nữa, từ dẫn giống v-ờn -ơm dòng Việt Nam sinh tr-ởng phát triển tốt thích nghi với điều kiện khí hậu địa ph-ơng Các 74 dòng Tếch đ-ợc dẫn giống từ Thái Lan, Indonesia Malaysia nằm khu vực Đông Nam nh-ng điều kiện khí hậu thời tiết có khác biệt nên từ giai đoạn đầu sinh tr-ởng phát triển dòng Tếch Việt Nam Mặc dù môi tr-ờng nuôi cấy tất dòng Tếch đồng nh-ng yếu tố di truyền sức sống ban đầu có ảnh h-ởng đến tỷ lệ bật chồi, hệ số nhân nh- tỷ lệ rễ nên dòng Tếch khác cho kết không giống từ giai đoạn vào mẫu, nhân chồi đến rễ Tóm lại, ph-ơng pháp nhân giống in vitro thích hợp Tếch Các kết thí nghiệm áp dụng rộng rãi cho nhiều dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 75 Ch-ơng Kết luận, tồn kiến nghị 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu b-ớc đầu nhân giống in vitro số dòng Tếch, đề tài đến số kết luận sau: Các chất khử trùng khác có ảnh h-ởng tới khả bật chồi mẫu cấy không giống Cùng loại hoá chất nh-ng sử dụng nồng độ thời gian khác cho kết vào mẫu khác Khử trùng mẫu HgCl2 0,05% khoảng thời gian 10 phút thích hợp nhất, tỷ lệ nhiễm tỷ lệ bật chồi cao Thời gian lấy mẫu cấy ảnh h-ởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ mẫu bật chồi Thời gian vào mẫu phù hợp với loài Tếch mùa Xuân mùa Hè (từ tháng đến tháng 7) Tỷ lệ mẫu bật chồi vào mùa Xuân (15%) mùa Hè (13,89%) cao so với mùa Thu (6,67%) mùa Đông (3,33%) Môi tr-ờng có tác dụng tốt nhân chồi MS WMP cải tiến Môi tr-ờng MS cải tiến cho hệ số nhân chồi (1,73lần) chất l-ợng chồi tốt (5,09 cm/chồi 6,33 lá/chồi) Môi tr-ờng WMP cho hệ số nhân chồi cao (2,10lần) nh-ng chất l-ợng chồi (4,45 cm/chồi 5,75lá/chồi) môi tr-ờng MS cải tiến Môi tr-ờng MS cải tiến bổ sung BAP Kinetin có ảnh h-ởng rõ rệt đến hệ số nhân sinh tr-ởng chồi Môi tr-ờng thích hợp môi tr-ờng có bổ sung thêm 0.5mg/l BAP hệ số nhân chồi đạt 1,99 lần, chiều cao bình quân chồi đạt 4,45cm số bình quân 7,57 lá/chồi Môi tr-ờng MS cải tiến có bổ sung chất kích thích sinh tr-ởng BAP NAA nồng độ khác ảnh h-ởng rõ rệt đến khả nhân nhanh kéo dài chồi chồi Tếch in vitro Môi tr-ờng MS cải tiến có bổ sung thêm 76 0.7mg/l BAP 0,5mg/l NAA thích hợp nhất, hệ số nhân chồi đạt 2,04 lần, chiều cao chồi đạt 4,93 cm số TB/chồi (8,24 lá/chồi) Môi tr-ờng MS/2 có bổ sung số chất kích thích sinh tr-ởng nồng độ khác cho tỷ lệ rễ khác Môi tr-ờng thích hợp môi tr-ờng MS/2 có bổ sung 1.5mg/l IBA cho tỷ lệ rễ 89,48%, số rễ TB/chồi 2,3 rễ/chồi, chiều dài TB/rễ 1,6 cm/rễ số rễ 3,7 Ph-ơng pháp cho rễ trực tiếp tỏ hiệu rút ngắn đ-ợc thời gian rễ đồng thời tỷ lệ rễ cao ph-ơng pháp rễ ống nghiệm Công thức thí nghiệm tốt IBA 1,0% cho tỷ lệ rễ cao 98,15%, số rễ bình quân chồi 2,4rễ/chồi, chiều dài rễ 1,8cm/rễ số rễ 4,3 Tỷ lệ rễ chồi Tếch v-ờn -ơm phụ thuộc nhiều vào mùa vụ rễ Mùa rễ thích hợp cho loài Tếch mùa Xuân mùa Thu tỷ lệ rễ lần l-ợt 94,81% 86,37% Các dòng Tếch khác cho kết vào mẫu, nhân chồi rễ khác điều chứng tỏ nhân tố di truyền có ảnh h-ởng đến nuôi cấy in vitro Tếch Trong đó, tốt dòng trội có nguồn gốc Việt Nam (VN9, VN18, VN21 VN22) tiếp đến dòng Malaysia (MD1 MD4) Indonesia (ID), cuối dòng Tếch Thái Lan (TL1, TL2 TL5) 10 Mặc dù kết có khác dòng nh-ng kết vào mẫu, nhân chồi rễ dòng t-ơng đối tốt nên áp dụng công thức thí nghiệm thích hợp vào nhân giống cho dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 4.2 Tồn Do thời gian hạn chế kinh nghiệm tác giả có hạn nên đề tài nhiều hạn chế - Ch-a nghiên cứu đ-ợc điều kiện nuôi cấy thích hợp nh- ánh sáng, nhiệt độ 77 - Các thí nghiệm môi tr-ờng dinh d-ỡng phối hợp chất điều hoà sinh tr-ởng ch-a nhiều - Ch-a tiến hành thí nghiệm giá thể thích hợp cho Tếch 4.3 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu môi tr-ờng sinh d-ỡng khác với nhiều tổ hợp chất điều hoà sinh tr-ởng khác để có đ-ợc môi tr-ờng nuôi cấy tối -u cho Tếch - Tiếp tục nghiên cứu môi tr-ờng nhân chồi rễ thích hợp cho dòng trội Tếch - Nghiên cứu nhân giống Tếch loại vật liệu khác nh- phôi hạt, quả, phôi vô tính - Nghiên cứu thử nghiệm thêm số loại giá thể phù hợp với Tếch mà có hiệu kinh tế 78 Mục lục Trang Lời nói đầu Mục lục Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình, ảnh sơ đồ Đặt vấn đề Ch-ơng Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm sở khoa học ph-ơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh 1.2.4 Tạo hoàn chỉnh (cho rễ) 1.2.5 Đ-a môi tr-ờng tự nhiên 1.3 Các nhân tố ảnh h-ởng tới trình nhân giống in vitro 1.3.1 Môi tr-ờng nuôi cấy 1.3.2 Các chất điều hoà sinh tr-ởng 10 1.3.3 Môi tr-ờng vật lý 12 1.3.4 Vật liệu nuôi cấy 13 1.3.5 Điều kiện vô trùng 13 1.3.6 Buồng nuôi cấy 14 1.4 ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật công tác giống rừng 15 1.4.1 Trên giới 15 1.4.2 Việt nam 17 1.5 Loài Tếch ( Tectona grandis Linn) 19 1.5.1 Đặc điểm sinh vật học sinh thái học 19 1.5.2 Giá trị kinh tế Tếch 20 1.5.3 Các nghiên cứu Tếch 20 Ch-ơng Mục tiêu, nội dung ph-ơng pháp nghiên cứu 24 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 2.2 Đối t-ợng nghiên cứu 24 2.3 Nội dụng nghiên cứu 24 79 2.4 Ph-ơng pháp nghiên cứu 24 2.4 Vật liệu nuôi cấy 24 2.4.2 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm 25 2.4.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu 25 2.4.4 Ph-ơng pháp bố trí thí nghiệm 27 2.5 Ph-ơng pháp thống kê sử lí số liệu 32 Ch-ơng Kết nghiên cứu thảo luận 36 3.1 Khử trùng mẫu vật 36 3.1.1 ảnh h-ởng loại hoá chất đến khử trùng mẫu vật 36 3.1.2 ảnh h-ởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi bất định ban đầu 39 3.2 ảnh h-ởng môi tr-ờng chất điều hoà sinh tr-ởng đến nhân chồi Tếch 43 3.2.1 Xác định môi tr-ờng nuôi cấy thích hợp 43 3.2.2 ảnh h-ởng loại chất điều hoà sinh tr-ởng đến khả tạo chồi phát triển chồi Tếch 46 3.3 ảnh h-ởng chất điều hoà sinh tr-ởng, mùa vụ ph-ơng thức rễ chồi Tếch 54 3.3.1 ảnh h-ởng NAA IBA đến khả tạo rễ chồi Tếch ống nghiệm 55 3.3.2 ảnh h-ởng IBA NAA đến khả rễ chồi Tếch v-ờm -ơm 58 3.3.4 ảnh h-ởng mùa vụ đến trình rễ chồi Tếch nuôi cấy mô 63 3.4 Khả nhân giống nuôi cấy mô cho dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 65 3.4.1 So sánh kết vào mẫu 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 66 3.4.2 So sánh khả nhân chồi 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 68 4.4.3 So sánh khả rễ 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 71 Ch-ơng Kết luận, tồn kiến nghị 75 4.1 Kết luận 75 4.2 Tồn 76 4.3 Kiến nghị 77 Tài liệu tham khảo Phụ lục 80 Danh mục bảng TT Tên bảng Trang 4.1 ảnh h-ởng loại hoá chất thời gian khử trùng đến kết vào mẫu 37 4.2 ảnh h-ởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban đầu 41 4.3 ảnh h-ởng môi tr-ờng nuôi cấy đến khả tái sinh chồi Tếch (sau tuần) 44 4.4 ảnh h-ởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh kéo dài chồi Tếch 48 4.5 ảnh h-ởng tổ hợp BAP NAA đến khả nhân nhanh kéo dài chồi Tếch 52 4.6 ảnh h-ởng IBA NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch 57 4.7 ảnh h-ởng IBA NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch v-ờn -ơm 60 4.8 ảnh h-ởng mùa vụ đến tỷ lệ rễ chồi Tếch v-ờn -ơm Kết vào mẫu số dòng Tếch (90 mẫu/dòng) Kết nhân chồi số dòng Tếch Kết rễ số dòng Tếch 4.9 4.10 4.11 60 65 69 72 81 Danh mục hình, ảnh sơ đồ TT 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.8 4.9 4.10 Tên Trang Biểu đồ ảnh h-ởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban 41 đầu Biểu đồ ảnh h-ởng môi tr-ờng nuôi cấy đến khả tái 44 sinh chồi Tếch Biểu đồ ảnh h-ởng BAP Kinetin đến khả nhân 49 nhanh kéo dài chồi Tếch Biểu đồ ảnh h-ởng tổ hợp BAP NAA đến khả nhân 52 nhanh kéo dài chồi Tếch ảnh h-ởng BAP NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch in 56 vitro ảnh h-ởng IBA NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch 60 v-ờn -ơm Biểu đồ ảnh h-ởng mùa vụ đến tỷ lệ rễ chồi Tếch 64 v-ờn -ơm Biểu đồ hệ số nhân chồi số dòng Tếch 69 Biểu đồ tỷ lệ rễ số dòng Tếch 72 Danh mục ảnh sơ đồ TT 2.1 3.1 Tên Trang Chồi Tếch sau vào mẫu đ-ợc 30 ngày Chồi Tếch nuôi cấy sau tuần loại môi tr-ờng khác Chồi Tếch hai công thức cho kết nhân chồi tốt 39 ảnh so sánh công thức tốt dùng BAP riên rẽ BAP kết hợp với NAA Chồi Tếch rễ trực tiếp v-ờn -ơm sau 25 ngày ảnh nhân chồi số dòng Tếch Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào Các b-ớc nhân giống in vitro 46 51 54 62 70 25 ... nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Đ-ợc trí Ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng, đề tài đ-ợc thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô... tài Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân giống Xoan ta Tếch có suất cao 3 Ch-ơng Tổng quan vấn đề nghiên. .. đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ D-ơng Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60.62.60 Luận văn thạc sĩ khoa học