Nghiên cứu nhân giống một số dòng tếch (tectona grandis linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Để hoàn thành ch-ơng trình đào tạo Cao học Lâm nghiệp khoá học 2005- 2007, đ-ợc sự đồng ý của Khoa sau đại học - Tr-ờng Đại học Lâm nghiệp, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: "Nghiên cứu n

NguyÔn thÞ thuú D-¬ng

grandis Linn) b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro

LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp

Hà T©y 2007

trọng trong việc đào tạo cao học của Tr-ờng đại học Lâm nghiệp Để hoàn thành ch-ơng trình đào tạo Cao học Lâm nghiệp khoá học 2005- 2007, đ-ợc sự đồng ý của Khoa sau đại học - Tr-ờng Đại học Lâm nghiệp, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp:

"Nghiên cứu nhân giống một số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) bằng ph-ơng

pháp nuôi cấy in vitro”.

Đ-ợc sự nhất trí của Ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, đề tài đ-ợc thực hiện tại phòng nghiên cứu nuôi cấy mô - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng

Để đạt đ-ợc kết quả trong học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả đã nhận đ-ợc sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Tr-ờng đại học Lâm nghiệp, đặc biệt là Khoa sau đại học, cùng tất cả các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, cũng nh- lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng Cho phép tôi đ-ợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy, cô giáo, đặc biệt là T.S Hà Huy Thịnh và Th.S Đoàn Thị Mai, toàn thể cán bộ công nhân viên tại trung tâm đã tận tình h-ớng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này

Trong bản luận văn này không thể tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong đ-ợc sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu này đ-ợc hoàn thiện

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Đặt vấn đề

Theo quyết định của thủ t-ớng chính phủ (QĐ số 17/2006/NĐ-TTg),

đến năm 2020 chúng ta phải tạo ra các giống cây trồng, vật nuôi… có năng suất cao, chất l-ợng và hiệu quả kinh tế cao phục vụ tốt nhu cầu chuyển đổi cơ cấu kinh tế trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Một trong những nhiệm vụ của ngành Lâm nghiệp là “phát triển vi nhân giống và đáp ứng đủ nhu cầu về giống cây Lâm nghiệp vào năm 2015” [16]

Tếch là loài sinh tr-ởng nhanh có biên độ sinh thái rộng hơn nữa gỗ Tếch đ-ợc sử dụng phổ biến trong xây dựng và làm đồ gỗ gia dụng vì có khả năng chống mối mọt, chịu n-ớc lâu ngày, mặt gỗ có độ bóng cao Trong công nghiệp chế biến gỗ: Tếch là loài cây có chất l-ợng gỗ mịn có thể bóc tách thành tấm mỏng Do gỗ Tếch có tỷ trọng nhẹ, ít bị hà bám, chịu va đập và ngâm n-ớc mặn nên đ-ợc dùng trong công nghiệp đóng tàu Mặt khác, nhu cầu th-ơng mại của gỗ Tếch ngày càng tăng bởi nó có thể thay thế một số loài

gỗ quý khác[42]

Cây Tếch đ-ợc trồng thăm dò ở n-ớc ta vào khoảng những năm 30 của thế kỷ 20 Lúc đầu, cây Tếch đ-ợc trồng thử ở công viên hoặc trên đ-ờng phố tại nhiều tỉnh nh-: Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, Lai Châu, Hà Nội,

Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh, Sài Gòn… Cũng trong thời gian này chỉ riêng

ở Lộc Ninh, Tỉnh Bình Ph-ớc đã gây trồng Tếch thành những khu rừng nhỏ Vào những năm 60, với nguồn giống thu hái từ Lộc Ninh đã trồng thành công một khu rừng Tếch 200 ha tại Định Quán, tỉnh Đồng Nai và một khu rừng Tếch 5 ha tại Eak – Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, cây Tếch đ-ợc trồng

mở rộng ở nhiều lâm tr-ờng trong các tỉnh miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên nh-: Đồng Nai, Bình Ph-ớc, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, Kom Tum…Nhưng do chưa có giống được cải thiện nên chất lượng rừng không cao, năng suất rừng trồng Tếch ở n-ớc ta còn thấp (9 – 12m3/ năm) [17] Hiện nay, diện tích rừng Tếch trồng mới của các n-ớc trên thế giới mỗi năm tăng nhanh, nhiều nhất là ở Indonesia khoảng 1.760 nghìn ha, ấn Độ khoảng 2.450 nghìn ha, Myanmar là 139 nghìn ha, Malaysia khoảng 4 nghìn ha, Thái Lan là

836 nghìn ha [29] ở Việt Nam, diện tích trồng Tếch chỉ đạt 1.500 ha, rất ít so với các n-ớc trong khu vực do nhiều nguyên nhân khác nhau mà thiếu giống

đ-ợc cải thiện là một trong những nguyên nhân quan trọng

Chính vì thế công tác chọn tạo và nhân giống một số dòng tếch có năng suất cao là vấn đề cần thiết Hiện nay, cây giống sản xuất từ hạt đ-ợc sử dụng phổ biến nh-ng không đáp ứng đ-ợc nhu cầu trồng rừng do không có rừng giống chuyên canh, hạt giống thu hái xô bồ nên phẩm chất hạt kém Hơn nữa cách nhân giống này còn gây ra hiện t-ợng phân ly tính trạng vì thụ phấn tự

do làm cho cây trồng không đồng đều dẫn đến năng suất rừng biến động Một khó khăn nữa là năng suất hạt trên một cây cũng rất thấp (1 ha rừng 15 tuổi chỉ cho khoảng 50 kg hạt) Không những thế, hạt Tếch trong tự nhiên có khả năng nảy mầm thấp, trong v-ờn -ơm tỷ lệ nảy mầm cũng không cao, chỉ đạt khoảng 5-10% [28] [42] Để khắc phục những nh-ợc điểm trên thì giải pháp nhân giống sinh d-ỡng ngày càng đ-ợc quan tâm Tuy nhiên đối với loài Tếch thì ph-ơng pháp nhân giống vô tính bằng hom cũng gặp nhiều khó khăn do tỷ

lệ ra rễ không cao chỉ đạt khoảng 24-30% [3] Chính vì những lý do trên nên giải pháp nhân giống sinh d-ỡng bằng nuôi cấy mô tế bào đang đ-ợc quan tâm nghiên cứu Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, còn gọi là

nhân giống in vitro, là ph-ơng pháp sản xuất cây con từ chồi v-ợt của cây mẹ

bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm, ở điều kiện vô trùng tuyệt đối với môi tr-ờng thích hợp và có thể kiểm soát trong điều kiện hoàn cảnh

đồng nhất Nuôi cấy mô tế bào có thể nhân nhanh với số l-ợng cây con lớn trong một khoảng thời gian ngắn, đ-ợc tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm nên hoàn toàn chủ động trong sản xuất Ngoài ra, kỹ thuật này còn giúp chúng ta có thể tạo ra giống mới, tạo nguồn cây sạch bệnh, tạo ra cây con

có độ đồng đều cao và duy trì đ-ợc những đặc tính tốt nhất của cây mẹ

Từ những lý do trên đề tài “Nghiên cứu nhân giống một số dòng

dung trong đề tài cấp bộ “Nghiên cứu tuyển chọn và nhân giống Xoan ta và

Tếch có năng suất cao”

Ch-ơng 1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu

1.1 Khái niệm và cơ sở khoa học của ph-ơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Khái niệm

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là vi nhân giống là ph-ơng pháp sản xuất hàng loạt cây con từ chồi non của cây (cơ quan, mô tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở các điều kiện vô trùng tuyệt đối với môi tr-ờng thích hợp và đ-ợc kiểm soát

Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” hay “nuôi cấy in vitro” là

phạm trù khái niệm chỉ tất cả các loại nuôi cấy mô và tế bào ở điều kiện vô trùng, bao gồm:

 Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật

 Nuôi cấy các bộ phận đã đ-ợc tách khỏi thực cơ thể thực vật: nuôi cấy cơ quan

 Nuôi cấy các phôi thành thục hay ch-a thành thục đã đ-ợc tách khỏi cơ thể thực vật: nuôi cấy phôi

 Nuôi cấy mô bắt nguồn từ cơ quan thực vật: nuôi cấy mô hay nuôi cấy mô sẹo

 Nuôi cấy tế bào đơn lẻ hay các cụm tế bào rất nhỏ trong môi tr-ờng lỏng

 Nuôi cấy tế bào thực vật sau khi đã tách bỏ vỏ tế bào, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần (protoplast) [14]

1.1.2 Cơ sở khoa học của của nuôi cấy mô tế bào

* Tính toàn năng (totipotence)

Năm 1902 lần đầu tiên nhà thực vật học ng-ời Đức Haberlandt đã đ-a

ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kỳ (đã biệt hoá) lấy từ một cơ thể thực vật đều

có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh” Theo

quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã biệt hoá đều chứa toàn bộ thông tin di truyền (ADN) cần thiết của cơ thể đó, nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào đều có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh, đó là tính toàn năng của tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vậy Cho đến nay, con ng-ời đã hoàn toàn chứng minh đ-ợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Cơ thể thực vật tr-ởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể Quá trình phân hoá có thể biểu thị nh- sau:

Sơ đồ 1.1: Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào

Quá trình này gồm có các giai đoạn

- Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy ra trong mô phân sinh làm cho số l-ợng tế bào tăng lên một cách đáng kể

Phân hoá

Phản phân hoá

- Sự dãn tế bào: Tế bào dãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích th-ớc của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình biệt hoá tế bào phân hoá thành các mô có chức năng riêng biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống Tuy nhiên, khi tế bào phân hoá thành các mô chức năng thì chúng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia của mình Trong một điều kiện nhất định nào đó các tế bào này lại có thể trở thành dạng tế bào phôi sinh và tiếp tục quá trình phân chia cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Đây chính là quá trình phản phân hoá tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình điều hoà hoạt hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen bị ức chế đ-ợc hoạt hoá trở lại để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một ch-ơng trình đã đ-ợc mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN ở mỗi tế bào Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể, nó th-ờng bị ức chế bởi các tế bào ở xung quanh Khi tế bào đ-ợc tách riêng ra, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen đ-ợc hoạt hoá, quá trình này sẽ diễn biến theo một ch-ơng trình đã định sẵn trong

bộ gen đó

1.2 Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro

1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích của giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo ra nguồn mẫu sạch để phục

vụ cho các b-ớc tiếp theo Giai đoạn này coi nh- một b-ớc thuần hoá vật liệu

để nuôi cấy Cây giống đ-ợc đ-a ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi tr-ờng mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của của mẫu nuôi cấy và chủ động trong công tác nhân giống Trong tr-ờng hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống

1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều kiện vô trùng Ng-ời ta th-ờng dùng một số hoá chất nh- HgCl2, Ca(Ocl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa quả) nh-ng theo Bhatt thì mô lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận tr-ởng thành khác [29] Vì vậy, ng-ời ta

th-ờng lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro

Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hoá càng cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy ở thời kỳ sinh tr-ởng mạnh của cây trong mùa sinh tr-ởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anolesnon 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc Polyvinylpyrroline (PVP) vào môi tr-ờng [8] Giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh tr-ởng tốt Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên Giai đoạn này th-ờng kéo dài 4 – 6 tuần

1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những -u điểm của ph-ơng pháp nhân giống in vitro so với

các ph-ơng pháp nhân giống khác là có hệ số nhân cao Vì vậy, có thể coi đây

là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống Hệ số nhân ở giai

đoạn này biến động từ 5 đến 50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi tr-ờng và ph-ơng pháp nhân Để tạo hệ số nhân cao cần lựa chọn môi tr-ờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh tr-ởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra l-ợng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây Theo

nguyên tắc chung thì trong môi tr-ờng có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy th-ờng là 25 – 27oC và 10 – 16 giờ chiếu sáng/ngày, c-ờng độ ánh sáng 1000 – 3000lux Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số l-ợng cây con tối đa trong thời gian ngắn nh-ng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây

1.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh (cho ra rễ)

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đạt đ-ợc kích th-ớc nhất định, các chồi đ-ợc chuyển từ môi tr-ờng ở giai đoạn 3 sang môi tr-ờng tạo rễ Th-ờng sau 2 – 3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Môi tr-ờng tạo rễ đ-ợc giảm l-ợng Cytokinin và tăng l-ợng Auxin để tạo điều kiện thuận lợi cho sự ra rễ của chồi cây Ng-ời ta th-ờng dùng các chất NAA (Axit α-naphtyl axetic), IBA (Axit β-indol butyric) và IAA (Axit β-indol axetic) ở nồng độ 1mg/lít đến 5 mg/lít

để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Giai đoạn này th-ờng kéo dài từ 2 – 4 tuần lễ, sau đó đ-ợc chuyển sang môi tr-ờng không có Auxin để rễ phát triển

ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới phát sinh rất yếu, cây ch-a chuyển sang giai đoạn tự d-ỡng

1.2.5 Đ-a cây ra môi tr-ờng tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời Cây mô đ-ợc chuyển từ môi tr-ờng dị d-ỡng sang môi tr-ờng tự d-ỡng nên phải tập cho cây quen dần với môi tr-ờng tự nhiên, tránh sự thay

đổi đột ngột làm cây có thể sốc hoặc bị chết Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đ-a ra ngoài giá

thể Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng n-ớc và sạch

bệnh Phải giữ ẩm cho cây khi mới đ-a từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất n-ớc và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh Sau 2 – 3 tuần đ-a ra ngoài cây mô sẽ sinh tr-ởng ổn định, chăm sóc cây mô t-ơng tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt

1.3 Các nhân tố ảnh h-ởng tới quá trình nhân giống in vitro

1.3.1 Môi tr-ờng nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, môi tr-ờng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài

đ-ợc xem là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi tr-ờng nuôi cấy đ-ợc xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh d-ỡng cần

thiết cho sự tăng tr-ởng và phân hoá mô trong suốt qúa trình nuôi cấy in vitro

Cho đến nay, đã có nhiều môi tr-ờng dinh d-ỡng đ-ợc tìm ra (MS – 62, WPM, SH…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy Vấn đề lựa chọn môi tr-ờng thích hợp cho cây sinh tr-ởng và phát triển tối -u trong từng giai

đoạn của nuôi cấy in vitro là rất quan trọng Môi tr-ờng nuôi cấy của hầu hết

các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa l-ợng, vi l-ợng, nguồn các bon, các axit amin và các chất điều hoà sinh tr-ởng (cũng có thể bổ sung thêm một

số chất phụ gia khác như than hoạt tính…) tuỳ vào từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tuỳ từng cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh d-ỡng cần cho sự sinh tr-ởng tối -u của chúng khác nhau Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi tr-ờng thích hợp cho sinh tr-ởng, phát triển tối -u cho từng giai

đoạn của hệ mô trong nuôi cấy in vitro rất quan trọng, số l-ợng và các loại

hoá chất phải cực kỳ chính xác phù hợp với từng đối t-ợng cụ thể Tuy nhiên, môi tr-ờng nuôi cấy bao giờ cũng có những thành phần sau:

+ Nguồn Cácbon: Trong nuôi cấy mô, các tế bào ch-a có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ nên ng-ời ta phải đ-a vào môi tr-ờng một l-ợng hợp chất cácbon nhất định để cung cấp để cung cấp năng l-ợng cho tế bào và mô (Debengh – 1991) Nguồn cácbon ở đây là các loại

đ-ờng khoảng 20 – 30mg/lít có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi tr-ờng Ng-ời ta th-ờng sử dụng 2 loại

đ-ờng đó là Saccarose và Glucose [13]

+ Nguồn Nitơ: Tỷ lệ nguồn Nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển của mô Thông th-ờng, nguồn nitơ đ-ợc đ-a vào môi tr-ờng ở hai dạng là NH4+ (amoni) và NO3- (Nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+ Nh-ng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hoá” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitơ với tỉ lệ hợp lý đ-ợc sử dụng rộng rãi nhất

+ Các nguyên tố đa l-ợng: là những nguyên tố khoáng nh-: N, P, K, S,

Mg, Ca cần thiết và thay đổi tuỳ đối t-ợng nuôi cấy Nhìn chung, các nguyên

tố này đ-ợc sử dụng ở nồng độ trên 30ppm Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa tế bào thực vật với môi tr-ờng

đ-ợc thuận lợi Có nhiều môi tr-ờng với thành phần, tỉ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn để sử dụng Nói chung, môi tr-ờng giàu Nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi tr-ờng giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn Thành phần khoáng của một môi tr-ờng cấy đ-ợc xác

định do sự cân bằng nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng

độ ion thể hiện bằng mg/lít) Việc lựa chọn thành phần và hàm l-ợng khoáng cho một đối t-ợng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi ng-ời làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh d-ỡng khoáng

+ Nhóm các nguyên tố vi lượng:Fe, Cu, Zn, Mg, Mo, B, Co, I … là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào

do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng đ-ợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa l-ợng để đảm bảo sinh tr-ởng và phát triển bình th-ờng của cây [25]

+ Các Vitamin: Mặc dù cây in vitro có thể tự tổng hợp vitamin, nh-ng

không đủ cho nhu cầu (czocnowoki – 1952) Do đó, để cây sinh tr-ởng tối -u một số vitamin nhóm B đ-ợc bổ sung vào môi tr-ờng với l-ợng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy Các vitamin B1 (Thiamin) và B6

(pyrodoxal) là những vitamin cơ bản nhất th-ờng dùng trong môi tr-ờng nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0.1 – 1mg/lít [13]

+ Dung dịch hữu cơ có thành phần không xác định nh- n-ớc dừa, dịch chiết nấm men… được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh

tr-ởng mô sẹo và các cơ quan N-ớc dừa đã đ-ợc sử dụng vào nuôi cấy in vitro

từ năm 1941 và đ-ợc ứng dụng khá rộng rãi trong các môi tr-ờng nhân nhanh

in vitro Trong n-ớc dừa th-ờng chứa các axit amin, axit hữu cơ, đ-ờng, ARN

và ADN Đặc biệt trong n-ớc dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô đó là Myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin [25]

+ Chất làm đông cứng môi tr-ờng: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm n-ớc khá cao 6-12g/lít Độ thoáng khí của môi tr-ờng thạch có ảnh h-ởng rõ rệt đến sinh tr-ởng mô nuôi cấy Nồng

độ thạch dao động trong khoảng 6 – 10mg/lít thuỳ theo mục tiêu nuôi cấy

1.3.2 Các chất điều hoà sinh tr-ởng

Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh tr-ởng và phát triển của thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… Ngoài ra,

nó còn ảnh h-ởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác Các Phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic Axit Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi tr-ờng quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy

+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric axit), IAA (Indol acetic axit), NAA (Napthyl acetic axit), …Trong nuôi cấy mô thực vật Auxin th-ờng đ-ợc sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [25]

+ Cytokinin: Đ-ợc bổ xung vào môi tr-ờng chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ

quan Các hợp chất th-ờng sử dụng là: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine –

C10H9NO5), BAP (6-Benzyl amino purine) , Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin Trong các chất này thì Kinetin và BAP đ-ợc sử dụng phổ biến nhất vì chúng

có hoạt tính cao và giá thành rẻ Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin đ-ợc sử dụng ở các nồng độ khác nhau ở nồng độ thấp (10-7-10-

6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6-10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh ng-ời ta th-ờng xử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6-10-4M [2]

+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 50 loại hormone khác nhau nh-ng quan trọng nhất là GA3 (Gibberellic Axit 3) GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrik-1987) cũng nh- tạo chồi phụ (Street-1973) [43] Ngoài ra, nó còn ảnh h-ởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh tr-ởng sinh d-ỡng của cây

+ Abscisic Axit (ABA): là chất ức chế sinh tr-ởng tự nhiên nh-ng vẫn

đ-ợc dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro ABA có ảnh h-ởng âm tính đến mô nuôi cấy in vitro Khi ABA t-ơng tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn

khi dùng BAP riêng rẽ [2]

+ Ethylen: Có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn sớm nh-ng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn Trong một số tr-ờng hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nh-ng một số tr-ờng hợp nó lại kìm hãm quá trình này [25]

Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi tr-ờng ví nó ảnh h-ởng khá

rõ nét tới khả năng hoà tan các chấy khoáng trong môi tr-ờng, sự ổn định của môi tr-ờng, khả năng hấp thụ chất dinh d-ỡng của cây Nếu pH thấp (<4.5) hoặc cao (>7.0) đều gây ức chế sinh tr-ởng, phát triển của cây trong nuôi cấy

in vitro Nên việc xác định đ-ợc độ pH ban đầu của môi tr-ờng cho quá trình

sinh tr-ởng và phát triển của mô cấy là cần thiết Độ pH th-ờng đ-ợc sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 – 5,8

Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 – 12 h/ngày

C-ờng độ ánh sáng ảnh h-ởng lên quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy C-ờng độ áng sáng cao kích thích sinh tr-ởng của mô sẹo trong khi c-ờng

độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, c-ờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy khoảng từ 1000 – 7000 lux (Moresin, 1974)

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, c-ờng độ ánh sáng thì chất l-ợng ánh sáng cũng ảnh h-ởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự v-ơn cao của chồi nh-ng lại có ảnh h-ởng tốt tới sự sinh tr-ởng của mô sẹo

Chính vì vậy mà trong các phòng thí nghiệm th-ờng sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với c-ờng độ 2000 – 3000 lux

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh h-ởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó còn ảnh h-ởng tới sự hoạt

động của Auxin, do đó làm ảnh h-ởng đến khả năng ra rễ của cây mô Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 20OC/15 OC hoặc 20 OC/18 OC tỷ lệ ra rễ đạt đ-ợc khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn ở nhiệt

độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn Còn ở nhiệt độ cao lại kích thích

ra nhiều tế bào không có tổ chức Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ th-ờng đ-ợc duy trì

ổn định, ban ngày từ 25 - 28 OC và ban đêm từ 17 - 20 OC

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm t-ơng đối th-ờng đạt khoảng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến vấn đề độ ẩm khi nuôi cấy

1.3.4 Vật liệu nuôi cấy

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá

trình nhân giống in vitro Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên

hoá đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công Thực tế cho thấy các loại tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Nh- vậy,

tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đầu ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng…, sau đó là các

tế bào sinh dục nh- noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non [21] [22]

1.3.5 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình

nuôi cấy in vitro Nếu điều kiện này không đ-ợc đảm bảo thì mẫu nuôi cấy

hoặc môi tr-ờng sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai

đoạn sau sẽ bị ngừng lại Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần

đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có ph-ơng pháp khử trùng mẫu thích hợp, ph-ơng tiện khử trùng hiện đại, buồng

và bàn nuôi cấy vô trùng Chọn đ-ợc đúng ph-ơng pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi tr-ờng dinh d-ỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh tr-ởng nhanh

Ph-ơng tiện khử trùng:

- Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi tr-ờng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy bằng hơi n-ớc có áp suất và nhiệt độ cao (1,2 – 1.5 atm, 120 – 1300C)

- Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

- Dung dịch khử trùng: Để khử trùng vật liệu đ-a vào nuôi cấy ng-ời ta th-ờng sử dụng các dung dịch nh- HgCl2 (Clorua thuỷ ngân), NaClO (Hypoclorit natri), Ca(Ocl)2 (Hypoclorit canxi), H2O2 (Ôxi già) [43]… Cồn dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy

- Phễu lọc vô trùng: Dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng

đ-ợc ở nhiệt đô cao nh- dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh tr-ởng Hiện nay, ng-ời ta th-ờng sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào

- Buồng cấy và bàn cấy vô trùng:

+ Buồng vô trùng: Nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ Buồng phải đ-ợc tiệt trùng liên tục tr-ớc và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu đèn tử ngoại

+ Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box Thiết

bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía ng-ời ngồi thao tác

1.3.6 Buồng nuôi cấy

Buồng cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy Buồng cấy cần phải đảm bảo các điều kiện:

- Nhiệt độ 25 – 30OC

- ánh sáng đạt 2000 – 3000 lux

- Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài

1.4 ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác giống cây rừng

1.4.1 Trên thế giới

Hiện nay, nuôi cấy in vitro đã và đang đ-ợc ứng dụng rộng rãi trong sản

xuất th-ơng mại ở nhiều n-ớc trên thế giới, hàng trăm loài cây lá rộng và hàng chục loài cây lá kim đã đ-ợc nuôi cấy mô thành công Cho tới năm 1991, Thái

Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55 loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Dendrocalamus asper với số l-ợng khoảng 1 triệu cây mỗi năm đáp ứng đ-ợc nhu cầu cây con

phục vụ cho trồng rừng [15]

Số l-ợng các loài Bạch đàn đã đ-ợc nhân giống bằng ph-ơng pháp nuôi

cấy in vitro ngày càng tăng, đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác

nhau đ-ợc nuôi cấy thành công Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong

việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E globulus, E tereticornis, E torelliana Cây mô có nguồn gốc từ cây -u việt

sinh tr-ởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây

mẹ Tại Autralia, nhân giống in vitro đã đ-ợc áp dụng để nhân nhanh cho các

cây đ-ợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đ-ợc đ-a vào sản xuất trên

quy mô lớn cho loài E camandulensis

Trung Quốc là một n-ớc thành công trong việc tạo cây in vitro cho các

loài cây thân gỗ Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ đ-ợc nuôi cấy nh- Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng… Là một trong những nước ứng dụng sớm

và thành công nuôi cấy mô vào trồng rừng trên diện rộng Đến năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, ng-ời ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai đ-ợc chọn lọc Những cây mô này đ-ợc dùng nh- là những cây

đầu dòng để tạo cây hom tại các v-ờn -ơm địa ph-ơng và dùng thẳng vào trồng rừng [14]

Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã đ-ợc thử nghiệm nhân giống thành

công bằng ph-ơng pháp nuôi cấy mô nh-: Acer, Beluta, Fagus, Quercus, Carpinus Các cây mô đã đ-ợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy

chúng có kiểu hình t-ơng đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây

đ-ợc huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài [14]

Hiện nay, nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đ-ợc áp

dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các ch-ơng trình trồng rừng dòng vô tính Một số loài Thông đã đ-ợc nuôi cấy thành công đó là

Pinus nigra, P caribaea, P pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá

kim đ-ợc nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt đ-ợc những thành công b-ớc đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria japonica) Bách xanh [14]…Trong số 30 loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô,

có bốn loài đ-ợc đ-a vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempevirens) ở Pháp; Thông P radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New Dilân; Thông P taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ

Tác giả Darus H Ahmas thuộc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Malaysia

đã nuôi cấy in vitro cây Keo tai t-ợng (Accasia mangium) bằng môi tr-ờng

MS có bổ sung 3% sucrose, 0.6% agar và 0.5mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Những chồi có chiều cao trên 0.5 cm đ-ợc cấy vào môi tr-ờng tạo rễ và chất điều hoà sinh tr-ởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% [30]

Ng-ời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính Kỹ thuật này đang

đ-ợc áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh tr-ởng nhanh, kháng bệnh và cố định

đạm cao cho trồng rừng [14]

Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã đ-ợc áp dụng cho cây Tếch

(Tectona grandis) Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm

chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi Từ đó họ có thể tạo

đ-ợc 500 cây in vitro từ một chồi ở cây tr-ởng thành và 3000 cây từ một cây

non trong một năm Kaosaard (1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm [28] Perhutani (Indonesia, 1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã

đ-ợc đem trồng thử

1.4.2 ở Việt nam

Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong Lâm nghiệp n-ớc ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, Công ty giống Lâm nghiệp trung -ơng, Trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống Thành phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp, …vv Hiện nay, một số tỉnh và địa ph-ơng đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đạt đ-ợc những thành công b-ớc đầu

Nuôi cấy mô ở n-ớc ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và Keo lai có năng suất cao Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên

cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho

Keo lai, Bạch đàn và một số giống cây rừng khác [9]

D-ơng Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho hai loài

Bạch đàn E camaldulensis và E urophylla từ cây trội của 2 loài đã tạo đ-ợc

một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2 lần [5]

Năm 1995, Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự cũng có nghiên cứu nhân nhanh Keo lai bằng ph-ơng pháp nuôi cấy mô Keo lai nuôi cấy trong môi tr-ờng MS có bổ sung BAP 2mg/l cho hệ số nhân chồi cao hơn ở các nồng độ khác từ 3-4 lần Cây mô có thể cho ra rễ trực tiếp trên nền cát phun s-ơng trong nhà kính bằng cách ngâm hoặc nhúng nhanh trong các chất kích thích

sinh tr-ởng IBA hoặc ABT đều cho tỷ lệ ra rễ trên 70% đồng thời rút ngắn

đ-ợc thời gian tạo rễ cho cây[18]

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống Bạch đàn lai U29C3 Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất

và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5 đến tháng 8 Môi tr-ờng MS có bổ sung 0,5mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm) Môi tr-ờng ra rễ thích hợp là môi tr-ờng MS bổ sung 1,0mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8% [10]

Vũ Ngọc Ph-ợng và cộng sự (Viện sinh học nhiệt đới) năm 2002 đã

công bố nghiên cứu nhân giống in-vitro thành công cho cây Tre tàu

(Sinocalamus latiflorus) và Tre mạnh tông (Dendrocalamus asper) Mẫu vật

đ-ợc lấy từ hạt và đ-ợc khử trùng bằng Ca(OCl)2 (Hypoclorit canxi) trong 15 phút và HgCl2 trong 5 phút Nghiên cứu tiến hành với nhiều công thức thí nghiệm và thu đ-ợc kết quả là: Tạo chồi từ hạt tốt trên môi tr-ờng MS có bổ sung BAP 3mg/l và Kinetin 1mg/l; Môi tr-ờng thích hợp cho nhân chồi là môi tr-ờng MS bổ sung BAP 2mg/l và Kinetin 1mg/l; Môi tr-ờng ra rễ là MS/2 có

bổ sung IBA 10mg/l [15]

Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2005 (Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện khoa học Lâm nghiệp) đã đ-a ra môi tr-ờng nhân chồi thức hợp cho cây trầm

là môi tr-ờng MS cải tiến bổ sung 1.0mg/l BAP + 0.5mg/l Kinetin Môi tr-ờng ra

rễ thích hợp nhất là môi tr-ờng MS/2 cải tiến có bổ sung 2.0 mg/l IBA [ 11]

Đoàn Thị ái Thuyền và cộng sự (2005) đã nhân giống thành công cây Hông bằng ph-ơng pháp nuôi cấy mô tế bào Mẫu nuôi cấy ban đầu đ-ợc lấy

từ chồi đỉnh và chồi bên Mẫu đ-ợc khử trùng bằng Ca(OCl)2 (Hypoclorit canxi) trong 20 phút sau đó cho cấy vào các môi tr-ờng khác nhau Kết quả thu đ-ợc nh- sau: môi tr-ờng thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi

là môi tr-ờng MS cải tiến có bổ sung 30g/l đ-ờng + 8g/l Agar + 5mg/l BAP và

0.1mg/l NAA Môi tr-ờng tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối -u là MS/2 + 20g/l

đ-ờng + 0.1mg/l NAA + 1.0g/l than hoạt tính [23]

Hồ Văn Giảng và cộng sự (2006) đã b-ớc đầu xây dựng qui trình nhân giống cây Dó trầm băng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Môi tr-ờng thích hợp nhất cho nhân chồi là MS cải tiến bổ sung 0,3mg/l BAP, 20g/l sucrose và 6g/l agar cho hệ số nhân chồi đạt 4,2 chồi/cụm Môi tr-ờng ra rễ thích hợp nhất là WMP+0,3mg/l NAA+20g/l sucrose+6g/l agar tỷ lệ ra rễ đạt 88,7% và cây mô sống đạt 98% khi đ-a ra v-ờn -ơm [4]

1.5 Loài Tếch ( Tectona grandis Linn)

1.5.1 Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học

* Đặc điểm sinh vật học

Tếch (Tectona grandis Linn) là cây gỗ lớn, cao đến 40m, đ-ờng kính

có thể lên tới 100cm Thân có múi, gốc có bạnh vè, vỏ màu xám vàng, cành non vuông cạnh phủ dày lông hình sao màu nâu vàng nhạt Lá đơn mọc cách

đối, lá hình trái xoan, hình trứng đầu nhọn, đuôi men cuống, dài 20 – 60cm, rộng 20 – 40cm mặt trên nhẵn mặt d-ới phủ lông hình sao màu vàng nhạt, cuống lá dài gần 5cm, không có lá kèm

Hoa tự hình viên chuỳ khá lớn, dài 40cm đ-ờng kính trên 35cm Hoa có lá bắc nhỏ hình l-ỡi mác Hoa nhỏ, đài hình chuông mép có 5 răng đều phía ngoài phủ đầy lông Tràng hoa màu trắng, ống dài 5 – 6mm, có 5 – 6 cánh tràng gần tròn, phía ngoài cánh tràng có phủ lông và các tuyến nhỏ Có 5 – 6 nhị hơi lộ ra ngoài Bầu hình nón, vòi ngắn, đầu nhuỵ xẻ đôi

Quả hạch hình cầu, đ-ờng kính quả gần 2cm, phủ lông hình sao Đài phát triển bao kín quả Mỗi quả có từ 1- 2, đôi khi 3 – 4 hạt [1]

* Đặc điểm sinh học và sinh thái học

Tếch là cây -a sáng (độ chiếu sáng thích hợp là 70-100%), thích hợp với khí hậu nhiệt đới m-a mùa có 2 mùa m-a và mùa khô rõ rệt, nhiệt độ trung bình năm 20 – 27oC, l-ợng m-a hàng năm khoảng 1200 – 3800mm,

không có s-ơng muối ở điều kiện sống thích hợp cây Tếch mọc khá nhanh có thể cao 18m, đ-ờng kính có thể tới 22cm Cây rụng lá vào mùa khô Mùa ra hoa vào tháng 6 – 8, quả chín vào tháng 11 đến tháng 2 năm sau [1]

Cây Tếch thích ứng rộng trên các loại đất phát triển từ các loại đá mẹ khác nhau nh- granit, sa thạch, phiến thạch.Cây phát triển tốt trên các loại đất sâu ẩm, thoáng và thoát n-ớc Có khả năng tái sinh chồi và hạt tốt

1.5.2 Giá trị kinh tế của Tếch

Tếch là loài cây gỗ lớn mọc t-ơng đối nhanh Gỗ Tếch có kết cấu mịn, vân thớ đẹp và có mùi thơm Hơn nữa, gỗ cững không bị mối mọt dùng để

đóng đồ mộc cao cấp, có giá trị xuất khẩu cao

1.5.3 Các nghiên cứu về Tếch

1.5.3.1 Trên thế giới

Tếch (Tectona grandis) thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), phân bố

trong các khu rừng nhiệt đới ở Miến Điện, nam và trung ấn độ, Thái Lan, Lào

và đã đ-ợc gây trồng trên một số n-ớc nh- Indonesia, Malaysia, Philippin, Cămphuchia và một số nước Châu Phi, Châu Mỹ…

Tếch là cây -a khí hậu nhiệt đới m-a mùa với l-ợng m-a trung bình 1200-2500mm và có 2 mùa rõ rệt, chịu lửa và ít bị sâu bệnh Gỗ Tếch nặng trung bình, thớ to mịn, không cong vênh, nứt nẻ, không bị mối mọt và nấm mốc phá hoại, chịu đ-ợc n-ớc mặn, không bị hà ăn [33]

Do có giá trị kinh tế rất cao nên Tếch trồng với diện tích lớn ở Java (Indonesia) diện tích trồng Tếch khoảng 1 triệu hecta chiếm tới 45% diện tích rừng trồng Tính đến 2004 diện tích rừng Tếch ở khu vực Châu á- Thái Bình D-ơng lên tới 25 triệu hecta [29]

Năm 1989 sản l-ợng xuất khẩu gỗ Tếch của Indonesia là 46000m3 đạt doanh thu 29,4 triệu USD Thái Lan cũng đạt mức xuất khẩu gỗ Tếch là 97000m3 vào năm 1980 Năm 1992, ở Sabah (Malaysia) chỉ với 12m3 gỗ Tếch

xuất khẩu đã thu đ-ợc 4600 USD trung bình đạt 383USD/m3 Tại Myanma, trong năm 2000 đã có 470.356 m3 gỗ Tếch đ-ợc khai thác, chiếm 25% tổng sản phẩm gỗ của n-ớc này (Saw Eh Dah, 2004)[41]

Giá gỗ Tếch thay đổi dựa vào chất l-ợng, đ-ờng kính, tuổi và xuất xứ

gỗ Giá cao nhất là 2000USD/m3 cho gỗ có nguồn gốc từ Myama dùng để

đóng bàn ghế Gỗ tỉa th-a và gỗ nhỏ từ các rừng trồng nh- từ Trung Mỹ có giá thấp nhất vào khoảng 200USD/m3 Gỗ có đ-ờng kính lớn hơn 40cm có giá bán 300USD Gỗ 25 năm đã chọn lựa có giá vào khoảng 600USD/m3, trong một vài tr-ờng hợp giá có thể nên tới 900USD/m3, trong khi đó ở Braxin giá bán gỗ lớn (ví dụ cây dái ngựa) có đ-ờng kính trên 80 cm cũng chỉ đạt 25-60USD/m3 [41]

Vì có giá trị kinh tế cao nên Tếch đ-ợc quan tâm phát triển ở các n-ớc trên thế giới ở Thái Lan ch-ơng trình cải thiện giống Tếch đã đ-ợc thực hiện từ năm 1982 với các khâu từ khảo nghiệm, bảo quản hạt, nhân giống bằng giâm hom, kỹ thuật lâm sinh và khảo nghiệm hậu thế (Verapong Suangtho, Sunanta Kajornsrichon, Tawin Kusolkul) [33] [35] Indonesia cũng bắt đầu có những nghiên cứu về nhân giống sinh d-ỡng (S.N Widiyanto) Ngoài ra các công trình cải thiện giống Tếch cũng đ-ợc công bố ở một vài quốc gia khác nh-: Miến Điện (Htun Kaufmanm 1980, Gyi 1993), Trung Quốc (Bingchao&shuzhen 1993) [33],…

Theo Erik D Kjaer và G Sam Foster (1999) thì giá trị kinh tế của công tác cải thiện giống và cung cấp giống Tếch đ-ợc cải thiện cho trồng rừng

sẽ cho năng suất rừng trồng tăng 10% và giá trị rừng trồng tăng 15-20% so với trồng từ hạt [35]

Kjaer Lauridsen và Wellendorf (1995) đã có tổng kết khảo nghiệm loài

và xuất xứ quốc tế cho Tếch Các tác giả nhận thấy rằng việc khảo nghiệm này khó có kết quả rõ rệt vì ở tại mỗi khảo nghiệm của mỗi n-ớc, xuất xứ này nổi trội về sinh tr-ởng thì chất l-ợng thân cây lại không tốt, ng-ợc lại xuất xứ khác

có chất l-ợng thân cây tốt thì sinh tr-ởng lại không v-ợt trội Nhìn chung, các xuất xứ Thái lan và Lào có chất l-ợng thân cây t-ơng đối tốt song năng suất ch-a cao Xuất xứ Indonesia có năng suất t-ơng đối cao thì chất l-ợng thân cây lại thấp [33]

1.2.3.2 ở Việt Nam

Cây Tếch đ-ợc nhập và trồng thăm dò ở n-ớc ta vào khoảng những năm

30 của thế kỷ 20 Lúc đầu, cây Tếch đ-ợc trồng thử ở công viên hoặc trên

đ-ờng phố tại nhiều tỉnh nh- Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, Lai Châu, Hà Nội, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh, Sài Gòn… Cũng trong thời gian này chỉ riêng ở Lộc Ninh, Tỉnh Bình Ph-ớc đã gây trồng Tếch thành những khu rừng nhỏ Vào những năm 60, với nguồn giống thu hái từ Lộc Ninh đã trồng thành công một khu rừng Tếch 200 ha tại Định Quán, tỉnh Đồng Nai và một khu rừng Tếch 5ha tại Eak – Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, cây Tếch đ-ợc trồng mở rộng ở nhiều lâm tr-ờng trong các tỉnh miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên nh-

Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, Kom Tum …[17]

Năm 1980 Lê Đình Khả đã tiến hành chọn cây trội và xây dựng ph-ơng

án khoanh nuôi rừng giống cho vùng Định Quán

Năm 1990-1995, tại rừng trồng Tếch ở Là Ngà (Đồng Nai), Hoàng Ch-ơng và cộng sự đã tiến hành b-ớc đầu chọn lọc đ-ợc 36 cây trội và xây dựng v-ờn giống bằng ph-ơng pháp ghép cho các cây trội này nh-ng ch-a đạt

đ-ợc kết quả mong muốn

Trần Văn Sâm (1996 - 2000) lại tiếp tục tiến hành chọn giống Tếch cho vùng Nam Bộ và Tây Nguyên Tác giả đã chọn lọc đ-ợc 31 cây trội, các cây trội này có độ v-ợt về chiều cao vút ngọn và đ-ờng kính ngang ngực từ 1.40

đến 3.08 Tác giả cũng đã tiến hành xây dựng v-ờn giống từ cây ghép tại Bầu Bàng và Kon Hà Nừng tuy nhiên ch-a thấy có sự khác biệt lớn giữa các dòng

về đ-ờng kính và chiều cao Bên cạnh đó tác giả đồng thời tiến hành thí nghiệm nhân giống bằng giâm hom cho Tếch nh-ng kết quả ch-a cao và cũng

ch-a làm thí nghiệm nhân giống cho từng dòng cây trội riêng rẽ [17]

Cho đến nay chúng ta mới chỉ có rừng giống chuyển hoá ở Định Quán và

La Ngà (Đồng Nai) đây là nguồn giống đ-ợc cải thiện ít nhiều về phẩm chất di truyền và cũng là nơi cung cấp nguồn giống chính để trồng rừng đại trà [7]

Gần đây, một số đơn vị nh- : Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, Viện di truyền nông nghiệp, Viện sinh học nhiệt đới, Xí nghiệp giống lâm nghiệp vùng Nam bộ đã b-ớc đầu tiến hành nhân giống sinh d-ỡng và trồng thử Tếch

Hiện nay, cây Tếch đ-ợc trồng nhiều ở Miền Nam và vùng Tây Nguyên Miền Bắc có một số vùng trồng Tếch ở quy mô nhỏ nh- Hà Giang, Tuyên Quang, Hoà Bình Theo thống kê ch-a đầy đủ ở Việt Nam có khoảng 1.500 ha rừng trồng Tếch Theo Đỗ Năng Vịnh, với mật độ 1000 cây/ha sau

40 năm khai thác giá trị sản l-ợng đạt bình quân hàng năm dự kiến đạt 10.000USD/ha/năm [26]

Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các vấn

đề cơ bản của nôi cấy mô tế bào và hiện trạng sử dụng cây mô vào sản xuất Các tác giả đã đưa ra một số môi trường nhân chồi và tạo rễ… thích hợp cho một số loài cây rừng cụ thể Những kết quả nghiên cứu này làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo và đ-ợc ứng dụng cho từng loài Trên thế giới cũng đã có một số n-ớc nghiên cứu nuôi cấy mô cho Tếch nh-ng trong n-ớc

ta những nghiên cứu về nuôi cấy mô cho loài Tếch vẫn ch-a đầy đủ Chính vì vậy đề tài tiến hành nghiên cứu một số vấn đề của nuôi cấy in vitro cho loài Tếch từ giai đoạn vào mẫu đến nhân chồi và ra rễ nhằm góp phần cải tiến quy trình thích hợp để nhân giống Tếch in vitro trên diện rộng đ-a vào sản xuất trên quy mô lớn

Ch-ơng 2

Mục tiêu, nội dung và ph-ơng pháp nghiên cứu

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định đ-ợc ph-ơng thức và các loại môi tr-ờng thích hợp cho việc nhân giống Tếch bằng nuôi cấy mô tế bào

- Xác định khả năng nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho một số dòng Tếch

2.2 Đối t-ợng nghiên cứu

Cây ghép 4 tháng tuổi của các dòng Tếch có nguồn gốc từ Malaysia, Indonesia, Thai Lan và Việt Nam đ-ợc trồng tại v-ờn -ơm thuộc Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, xã Đông Ngạc, huyện Từ Liêm, Hà Nội

2.3 Nội dụng nghiên cứu

Để thực hiện đ-ợc mục tiêu thì nội dung nghiên cứu của đề tài là:

1 Nghiên cứu ảnh h-ởng của các loại hoá chất khử trùng và mùa vụ đến mẫu cấy

2 Nghiên cứu ảnh h-ởng của một số Cytokinin (BAP, Kinetin) và tổ hợp Cytokinin và Auxin đến khả năng nhân chồi của Tếch

3 Nghiên cứu ảnh h-ởng nồng độ của các Auxin (IBA, NAA) và thời

vụ đến khả năng ra rễ trong ống nghiệm và ở v-ờn -ơm

4 So sánh khả năng vào mẫu, nhân chồi và ra rễ của 10 dòng Tếch có nguồn gốc khác nhau

2.4 Ph-ơng pháp nghiên cứu

2.4 1 Vật liệu nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy lấy từ chồi bên của cây ghép 4 tháng tuổi Mẫu đ-ợc lấy ở chồi 20 ngày tuổi, sinh tr-ởng tốt, không sâu bệnh Chồi đ-ợc cắt bỏ một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá Mẫu cấy có chiều dài từ 3-6cm mang từ 1-2 nách lá

2.4.2 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm

- Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm đ-ợc tiến hành tại phòng nuôi cấy mô của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện khoa học Lâm nghiệp, Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội

Điều kiện thí nghiệm tuân theo tiêu chuẩn và quy định kỹ thuật của phòng nuôi cấy mô:

+ Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10h/ngày

+ C-ờng độ ánh sáng khoảng 2000-3000 Lux

Cũng t-ơng tự các loài cây Lâm nghiệp khác nh- Keo, Bạch đàn, Thông

…việc nhân giống in vitro cho Tếch cũng đ-ợc tiến hành bằng ph-ơng pháp

tạo cụm chồi với sơ đồ tổng quát sau:

* Cấy khởi động: Là giai đoạn khử trùng đ-a mẫu vào nuôi cấy in vitro

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn đ-ợc tiến hành qua các b-ớc:

- Rửa xà phòng loãng

- Rửa d-ới vòi n-ớc chảy

- Tráng n-ớc cất

- Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5-15 phút

- Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng n-ớc cất vô trùng từ 3-5 lần

- Cấy mẫu vào môi tr-ờng tái sinh chồi ban đầu, các thao tác đ-ợc thực hiện trong buồng cấy vô trùng

* Tạo và nhân nhanh chồi: là giai đoạn kích thích mô cấy phát sinh

hình thành nhiều chồi Vấn đề là phải xác định đ-ợc môi tr-ờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để có hiệu quả cao nhất

- Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành cấy trên các môi tr-ờng khác nhau nh- WPM, MS, B5 có bổ sung 7g/l agar, 30g/l đ-ờng và độ

pH của các môi tr-ờng đ-ợc điều chỉnh đến 5,8

- Nhân chồi: trên cơ sở của thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử nghiệm môi tr-ờng tối -u cho quá trình nhân nhanh chồi bằng cách thay đổi thành phần chất khoáng và sự có mặt của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ hay phối hợp

* Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi tr-ờng nhân

nhanh sang môi tr-ờng tạo rễ để có đ-ợc cây con hoàn chỉnh hoặc có thể cho

ra rễ trực tiếp trên nền cát trong nhà kính Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn về chiều cao, chất l-ợng nuôi cấy trên các môi tr-ờng tạo rễ hoặc cho ra rễ trực tiếp, mục đích là để tìm ra môi tr-ờng thích hợp để tạo cây con hoàn chỉnh Sau đó cây con đ-ợc huấn luyện để thích nghi với điều kiện bên ngoài

* Đ-a cây in vitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho

cây con có tỷ lệ sống cao khi đ-a ra ngoài điều kiện tự nhiên, tiến hành các thí nghiệm về thành phần ruột bầu

2.4.4 Ph-ơng pháp bố trí thí nghiệm

Các môi tr-ờng, loại hoá chất và nồng độ chất điều hoà sinh tr-ởng sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào rất đa dạng và phong phú Do đó, việc lựa chọn loại môi tr-ờng, loại và nồng độ các chất điều hoà sinh tr-ởng cũng nh- sự kết hợp giữa chúng với nhau đ-ợc dựa trên kinh nghiệm và các kết quả nuôi cấy mô một số loài cây lâm nghiệp nh- Keo, Bạch đàn

Các thí nghiệm đều đ-ợc bố trí theo dạng khối ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp Thí nghiệm 1-3 đ-ợc tiến hành song song với 4 dòng cây trội Tếch ngẫu nhiên, quan sát trên 45 mẫu cấy Thí nghiệm 4 – 8 quan sát trên 1 dòng cây trội Tếch với số mẫu quan sát là 50 Thí nghiệm 9-11 tiến hành với 10 dòng trội Tếch

có nguồn gốc từ Thái Lan, Việt Nam, Inđônêsia và Malaysia Các mẫu thí nghiệm đều đ-ợc kiểm tra hàng tuần để loại bỏ mẫu nhiễm và quan sát đ-ợc diễn biến của mẫu cấy

Thí nghiệm 1 ảnh h-ởng của các loại hoá chất đến khử trùng mẫu

Thí nghiệm đ-ợc tiến hành với 3 loại hoá chất là HgCl2 nồng độ 0.05% và 0.1%, Ca(OCl)2 và H2O2 (Ôxi già) khử trùng trong thời gian 5, 10 và 15 phút

Do ch-a xác định đ-ợc môi tr-ờng tối -u cho giai đoạn cấy khởi động nên mẫu đã khử trùng đ-ợc cấy vào môi tr-ờng MS cải tiến có bổ sung 0.5mg/l BAP Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau 30 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 2 Xác định thời điểm lẫy mẫu thích hợp

Các thí nghiệm đ-ợc tiến hành theo 4 mùa trong năm

- Thu: tháng 9-2006

- Đông: tháng 12-2006

- Xuân: tháng 3-2007

- Hạ: tháng 6-2007 Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau

30 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 3 Xác định môi tr-ờng tái sinh chồi ban đầu

Thí nghiệm đ-ợc tiến hành trên ba loại môi tr-ờng MS, WPM và B5 có

bổ sung thêm một số chất khoáng và Vitamin (Môi tr-ờng cải tiến)

Công thức 1: Môi tr-ờng MS* (Murashige và Skoog Medium)

Công thức 2: Môi tr-ờng WPM* (McCown Woody Plant Medium) Công thức 3: Môi tr-ờng B5* (Micro-Macro Gamborg’s B5 medium)

Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi

Thí nghiệm 4: ảnh h-ởng của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ

đến khả năng nhân nhanh và kéo dài chồi

Chất điều hoà

sinh tr-ởng Công thức Thành phần môi tr-ờng

BAP

K1 MS* + 0,1mg/l kinetin K2 MS* + 0,5mg/l kinetin K3 MS* + 1,0 mg/l kinetin K4 MS* + 1,5 mg/l kinetin

Thí nghiệm 5: ảnh h-ởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân

nhanh và kéo dài chồi

Chất điều hoà sinh

0.5

0.1 BA5 MS*+0,5mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA6 MS*+0,5mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA7 MS*+0,5mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA8 MS*+0,5mg/l BAP +1,5mg/l NAA

0.7

0.1 BA9 MS*+0,7mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA10 MS*+0,7mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA11 MS*+0,7mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA12 MS*+0,7mg/l BAP +1,5mg/l NAA Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi

Thí nghiệm 6: ảnh h-ởng của các Auxin (IBA và NAA) riêng rẽ đến

tỷ lệ ra rễ trong ống nghiệm

Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2.0 cm cứng cáp khoẻ mạnh đ-ợc cấy vào môi tr-ờng ra rễ là môi tr-ờng 1/2MS* bổ sung một số chất kích thích sinh tr-ởng

ở nồng độ khác nhau

Thí nghiệm 7: ảnh h-ởng của IBA và NAA đến tỷ lệ ra rễ ở v-ờn -ơm

Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2.0cm và cứng cáp khoẻ mạnh đ-ợc chấm thuốc TTG có gốc là các Auxin ở nồng độ khác nhau để kích thích ra rễ, sau đó cấy xuống nền cát hay bầu đất đã đ-ợc khử trùng bằng thuốc tím và Benlat

Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ

Thí nghiệm 8: ảnh h-ởng của nhân tố mùa vụ đến tỷ lệ ra rễ

Từ kết quả ra rễ ở v-ờn -ơm tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp, mỗi lần lặp quan sát 45 chồi Thí nghiệm tiến hành vào các mùa khác nhau trong năm

Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau

30 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 10: So sánh khả năng nhân chồi của 10 dòng cây trội Tếch

có nguồn gốc khác nhau

Thí nghiệm đ-ợc tiến hành với 10 dòng Tếch (nh- thí nghiệm 9) Môi tr-ờng sử dụng trong thí nghiệm là môi tr-ờng MS* có bổ sung 0,7mg/l BAP

và 0,5mg/l NAA

Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi

Thí nghiệm 11: So sánh khả năng ra rễ của 10 dòng cây trội Tếch có

nguồn gốc khác nhau

Thí nghiệm đ-ợc tiến hành với 10 dòng Tếch nh- thí nghiệm 9 và 10 Các chồi đủ tiêu chuẩn cao hơn 3,0cm và cứng cáp khoẻ mạnh đ-ợc chấm thuốc bột IBA 1,0% rồi cấy vào cát sạch đã đ-ợc khử trùng bằng Benlat

Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung

bình/rễ

2.5 Ph-ơng pháp thống kê và sử lí số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi và thu thập

1, Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100

Tổng số mẫu ban đầu

2, Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Tổng số mẫu nảy chồi x 100

Tổng số mẫu cấy vào

3, Chiều cao trung bình (Cm) = Tổng chiều cao chồi x 100

Tổng số mẫu ban đầu

4, Hệ số nhân (Lần) = Tổng số chồi mới hình thành x 100

Tổng số chồi ban đầu

5, Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100

Tổng số chồi nuôi cấy

6, Chiều dài rễ trung bình (cm) = Tổng chiều dài rễ

Nếu nhân tố A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm thì giả thuyết

Ho đặt ra là: Ho: 1=2=…a = 

Còn đối thuyết H1: Nhân tố A tác động không đồng đều đến kết quả thí nghiệm Nghĩa là có ít nhất 1 số trung bình tổng thể i khác với các số trung bình tổng thể còn lại

Ng-ời ta đã chứng minh đ-ợc rằng nếu giả thuyết Ho đúng thì biến ngẫu nhiên Vn có phân bố: 2 với k= n-a bậc tự do và Va có phân bố 2 với k

= a-1 bậc tự do vì vậy biến ngẫu nhiên:

j ij

i



 1  1

2 ) (

a

i i a

i

n

j

ij n x x

i

1

Phân bố F với k1=a-1 và k2= n-a bậc tự do

Nếu FA tính theo (1)  F0.5 tra bảng với k1=a-1 và k2 = n-a bậc tự do thì giả thuyết Ho đợc chấp nhận, ng-ợc lại nếu FA tính theo (1)> F0.5 thì giả thuyết

Ho bị bác bỏ nghĩa là nhân tố A tác động không đồng đều tới kết quả thí nghiệm, nói cách khác việc phân cấp các công thức thí nghiệm là có ý nghĩa

Ph-ơng pháp phân tích ph-ơng sai trên dựa vào phần mềm máy tính SPSS11.5

Kiểm tra thống kê ảnh h-ởng của các nhân tố đến các chỉ tiêu nghiên cứu, dùng các thủ tục phân tích ph-ơng sai một nhân tố và phân tích ph-ơng sai hai nhân tố với mức ý nghĩa =0.05

* Phân tích ph-ơng sai một nhân tố

Giả thiết Ho là1 = 2 = 3=…… i =…….=k trong đó i là

trung bình tổng thể thứ i mà từ đó mẫu thứ i đ-ợc rút ra

Trong phân tích ph-ơng sai thì kết quả đ-ợc trình bày d-ới dạng 1 bảng tính gọi là bảng phân tích ph-ơng sai:

Ph-ơng sai

Xác suất của F (sig) Nhân tố A VA a-1 S2 = VA/a-1 S2 / S2

ý nghĩa (sig)  0.05 thì giả thuyết Ho bị bác bỏ nghĩa là các công thức thí nghiệm khác nhau có ảnh h-ởng khác nhau đến kết quả thí nghiệm Nếu giá trị thống kê F tính đ-ợc với mức ý nghĩa (sig) > 0.05 thì giả thuyết Ho đ-ợc chấp nhận nghĩa là các công thức thí nghiệm khác nhau đều không ảnh h-ởng đến kết quả thí nghiệm

Để so sánh nhiều cặp công thức với nhau, tìm ra công thức có ảnh h-ởng trội nhất ta dùng tiêu chuẩn Duncan Các giá trị trung bình đ-ợc phân thành các tập con, mỗi tập con chứa các số trung bình thuần nhất Kết quả từ bảng cho thấy công thức có ảnh h-ởng trội nhất

* Phân tích ph-ơng sai hai nhân tố

Giả thuyết th-ờng đ-ợc cho là:

H0A: i = 0 với mọi i (và đối thuyết H1A ít nhất có một i0)

H0B: j = 0 với mọi j (và đối thuyết H1B ít nhất có một  j0)

động (SS)

Bậc tự do

Xác suất của F (sig)

Nhân tố A V A a-1 S 2

a = V A /a-1 S 2

a /S 2 N

Nhân tố B V B b-1 S 2 = V B /b-1 S 2 /S 2

N

Ngẫu nhiên V N (a-1).(b-1) S 2

N = V N /(a-1).(b-1) Toàn bộ V T n-1 S 2

T = V T /n-1

Trong bảng phân tích ph-ơng sai, giá trị thống kê F đ-ợc tính với mức ý nghĩa (sig)  0.05 thì giả thuyết H0A bị bác bỏ nghĩa là nhân tố A có ảnh h-ởng đến kết quả thí nghiệm; Nếu giá trị thống kê F tính đ-ợc với mức ý nghĩa (sig) > 0.05 thì giả thuyết H0A đ-ợc chấp nhận nghĩa là nhân tố A không

ảnh h-ởng đến kết quả thí nghiệm Nhân tố B cũng t-ơng tự nh- nhân tố A

Để so sánh nhiều cặp công thức với nhau, tìm ra công thức có ảnh h-ởng trội nhất ta dùng tiêu chuẩn Duncan Các giá trị trung bình đ-ợc phân thành các tập con, mỗi tập con chứa các số trung bình thuần nhất Kết quả từ bảng cho thấy công thức có ảnh h-ởng trội nhất

Ch-ơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1 Khử trùng mẫu vật

3.1.1 ảnh h-ởng của các loại hoá chất đến khử trùng mẫu vật

Môi tr-ờng nuôi cấy có chứa đ-ờng muối khoáng và các loại Vitamin

… Do vậy, các loài nấm và vi khuẩn có điều kiện rất thuận lợi để phát triển Nấm và vi khuẩn có tốc độ phân bào lớn hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật, nên nếu trong môi tr-ờng và mẫu nuôi cấy có bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau một thời gian ngắn toàn bộ môi tr-ờng và mẫu nuôi cấy sẽ bị nhiễm nấm và vi khuẩn Khi đó, thí nghiệm sẽ phải huỷ bỏ vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển đ-ợc và chết dần Chính vì thế mà yếu tố vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đòi hỏi rất nghiêm ngặt

Tạo đ-ợc mẫu sạch là yếu tố hàng đầu của sự thành bại trong quá trình

nhân giống in vitro Công việc tạo mẫu vô trùng là t-ơng đối khó khăn vì không

những cần thao tác nhanh, khéo léo, cẩn thận mà còn phải loại bỏ một cách tuyệt

đối các vi sinh vật có hại (nấm và vi khuẩn) bằng các hoá chất trong khi vẫn đảm bảo đ-ợc sức sống cho mẫu cấy Vấn đề chọn loại hoá chất, nồng độ sử dụng

và thời gian khử trùng là một việc khó, cần có nhiều nghiên cứu để tìm ra công thức tốt nhất cho từng loài cây Xuất phát từ yêu cầu đó đề tài tiến hành nghiên cứu kỹ thuật khử trùng cho một số dòng Tếch nhằm tìm ra ph-ơng pháp khử trùng tốt nhất

Theo tài liệu nghiên cứu của Street(1974) thì có thể sử dụng nhiều loại hoá chất để diệt nấm [43] nh-ng do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ tiến hành thí nghiệm đ-ợc với một số loại hoá chất là HgCl2 0.05% và 0.1%, CaCO3, H2O2 Đây là các hoá chất có hoạt tính diệt nấm, khuẩn cao th-ờng đ-ợc sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô Mẫu vật đã khử trùng

đ-ợc cấy vào môi tr-ờng MS* có bổ sung 0,5mg/l BAP, quan sát số mẫu

nhiễm, mẫu bật chồi trong 30 ngày Số liệu thu thập đ-ợc tổng hợp và tính toán trong phụ biểu 02, thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 ảnh h-ởng của các loại hoá chất và thời gian khử trùng đến kết

quả vào mẫu

Hoá

chất

Thời gian

Tổng

số mẫu

Tỷ lệ mẫu nhiễm

lệ bật chồi thấp (d-ới 13,70%)

Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy các loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng có ảnh h-ởng lớn đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ bật chồi của mẫu cấy Cùng một loại hoá chất nh-ng nồng độ khác nhau cho kết quả khử trùng không giống nhau Cùng một loại hoá chất, cùng một nồng độ nh-ng thời gian khử trùng khác nhau cũng cho kết quả khác nhau t-ơng đối rõ rệt Mẫu khử trùng bằng Ca(ClO)2 và

Ôxi già có tỷ lệ nhiễm rất cao (81,85% - 100%) nên không thích hợp cho khử trùng mẫu Tếch