Nghiên cứu nhân giống song mật (calamus platyacanthus warb ex beccc) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố học Thạc sĩ trường Đại học Lâm nghiệp, đồng ý Lãnh đạo Nhà trường, Khoa Đào tạo sau Đại học, Khoa Lâm học, Trung tâm Giống Công nghệ sinh học cho phép thực đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex Becc) phương pháp nuôi cấy in vitro” hướng dẫn khoa học TS Hà Văn Huân – Trung tâm Giống CNSH, Khoa Lâm học, trường Đại học Lâm nghiệp Trong trình thực tập làm luận văn tốt nghiệp, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi lãnh đạo Trường Đại học Lâm nghiệp, Khoa Đào tạo sau Đại học, Khoa Lâm học, Trung tâm Giống Công nghệ sinh học Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hà Văn Huân, người định hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình thực hồn thành khố luận Xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Huệ, Chủ nhiệm đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu tạo Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex becc) kỹ thuật nuôi cấy in vitro”, cho phép tơi tham gia trực tiếp vào tồn nội dung nghiên cứu thực nghiệm cuả đề tài phép sử dụng phần kết đề tài để báo cáo luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Văn Giảng - Giám đốc Trung tâm Giống Công nghệ sinh học, ThS Nguyễn Thị Hồng Gấm tạo nhiều điều kiện thuận lợi có nhiều đóng góp quý báu cho tơi suốt q trình làm luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo, cán thuộc: Trung tâm Giống CNSH, Khoa Lâm học, Khoa Đào tạo sau Đại học tận tình truyền đạt kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học tạo điều kiện thuận lợi cho Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp, gia đình người thân ủng hộ, động viên, giúp vượt qua khó khăn suốt q trình học tập cơng tác Tơi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, tháng 11 năm 2012 Học viên Trần Thị Thời ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Mục lục .ii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đại cương nuôi cấy mô- tế bào Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô - tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 1.1.3 Một số phương thức nhân giống in vitro 1.1.4.Các giai đoạn q trình nhân giống in vitro 1.1.5 Những vấn đề nhân giống in vitro 1.1.6 Thành tựu nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy in vitro 1.1.7 Ý nghĩa kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật 10 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 11 1.2.1 Tổng quan Song mây 11 1.2.2 Tổng quan Song mật 12 1.2.3 Một số nghiên cứu nhân giống Song mật 13 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 iii 2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu in vitro 17 2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro 17 2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh kích thích tăng trưởng chồi 18 2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ 18 2.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc in vitro nhà lưới/vườn ươm 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu in vitro 18 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro 19 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh kích thích tăng trưởng chồi 22 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ 24 2.3.5 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc in vitro nhà lưới/vườn ươm 25 2.3.6 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu 26 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu in vitro 29 3.2 Kết nghiên cứu tạo cụm chồi 32 3.2.1 Ảnh hưởng đường kính gốc chồi măng làm vật liệu tạo cụm chồi 32 3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy in vitro đến khả tạo cụm chồi Song mật 34 3.2.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo cụm chồi 35 3.2.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi in vitro 36 3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả tạo cụm chồi Song mật 39 3.3 Kết nghiên cứu nhân nhanh kích thích tăng trưởng chồi 41 iv 3.3.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi in vitro 41 3.3.2 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến kích thích tăng trưởng chồi 44 3.4 Kết nghiên cứu kỹ thuật tạo hoàn chỉnh 46 3.4.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả rễ in vitro 47 3.5 Kết nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc Song mật in vitro trồng vườn ươm 50 3.5.1 Ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống sinh trưởng Song mật in vitro vườn ươm 50 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 57 Kết luận 57 Tồn khuyến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Nghĩa đẩy đủ BAP 6- Benzyl amino purine Cs Cộng CTNC Cơng thức nghiên cứu CTTN Cơng thức thí nghiệm CNSH Công nghệ sinh học ĐC Đối chứng ĐHLN Đại học Lâm nghiệp ĐHST Điều hòa sinh trưởng GA3 Gibberellic acid HgCl2 Clorua thủy ngân IAA Indol-3 acetic acid IBA Indolyl butyric acid Kinetin 6- furfuryl amino purine MS Murashige & Skoog 1962 (Môi trường MS 1962) MS* Môi trường MS cải tiến NAA Naphtyl acetic acid NaOCl Natri hypoclorit TB Trung bình TN Thí nghiệm % w/v Phần trăm khối lượng thể tích % v/v Phần trăm thể tích thể tích vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng TT 2.1 2.2 2.3 2.4 Các công thức khử trùng chồi măng Ảnh hưởng đường kính gốc chồi măng đến khả tạo cụm chồi Ảnh hưởng hưởng chất ĐHST đến khả tạo cụm chồi Ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi 2.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến khả tạo cụm chồi 2.6 Ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến khả tạo cụm chồi 2.7 2.8 2.9 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả rễ 2.10 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả rễ 2.11 2.12 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Ảnh hưởng thành phần phối trộn ruột bầu đến khả sống sinh trưởng in vitro vườn ươm Ảnh hưởng chế độ che sáng vườn ươm đến khả sống sinh trưởng Kết tạo mẫu in vitro từ chồi măng Song mật Kết ảnh hưởng đường kính gốc chồi măng đến khả tạo cụm chồi Kết ảnh hưởng phối hợp chất ĐHST đến khả tạo cụm chồi Kết ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi Kết ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến khả tạo cụm chồi Trang vii 3.6 3.7 3.8 Kết ảnh hưởng cường độ ánh sáng giàn nuôi đến khả tạo cụm chồi Kết ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Song mật in vitro Kết ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến khả kích thích tăng trưởng chồi 3.9 Kết ảnh hưởng chất ĐHST đến khả rễ chồi 3.10 Kết ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả rễ 3.11 3.12 Kết ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến khả sống sinh trưởng in vitro vườn ươm Kết ảnh hưởng độ che sáng vườn ươm đến khả sống sống sinh trưởng viii DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng công thức khử trùng đến tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu nảy mầm Chồi măng trước vào mẫu Chồi măng nảy mầm Biểu đồ ảnh hưởng đường kính gốc chồi măng đến đến khả tạo cụm chồi in vitro Chồi măng tạo cụm chồi Biểu đồ ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo cụm chồi Cụm chồi Song mật in vitro môi trường Ph8 (A), Ph4 (B) Ph9 (C) Biểu đồ ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi Cụm chồi môi trường MS (A) 2MS (B) Cụm chồi môi trường MS* Biểu đồ ảnh chất điều hòa sinh trưởng đến hệ số nhân nhanh chồi Chồi sau tuần môi trường NC11 (A) NC6 (B) Biểu đồ ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả kích thích tăng trưởng chồi Song mật in vitro Chồi tăng trưởng công thức KT8 (A) KT 11 (B) Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp IBA NAA đến khả rễ in vitro Chồi Song mật rễ môi trường R5 Cây tạo trông môi trường MS (A) 1/2MS* (B) Biểu đồ ảnh hưởng giá thể trồng đến khả sống sinh trưởng in vitro vườn ươm Biểu đồ ảnh hưởng độ che sáng vườn ươm đến tỷ lệ sống Cây Song mật in vitro sau cấy vào bầu đất Cây Song mật vườn ươm sau 04 tuần với độ che sáng 75% Cây Song mật vườn ươm sau 08 tuần Cây Song mật vườn ươm đủ tiêu chuẩn trồng rừng 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta, lâm sản gỗ có vai trị đặc biệt quan trọng phát triển kinh tế - xã hội đất nước Song mật loài lâm sản gỗ có giá trị kinh tế cao Nghề gây trồng, chế biến kinh doanh sản phẩm từ Song mây, có Song mật, tạo nhiều việc làm tăng thu nhập, cải thiện đời sống cho người dân Trong năm gần đây, việc khai thác Song mật tự nhiên diễn mức, bất hợp lý làm cho khu phân bố sản lượng ngày suy giảm, nhiều nơi giống Nguồn Song mật ngun liệu tự nhiên khơng cịn đủ đáp ứng cho sở sản xuất để tạo thành sản phẩm phục vụ cho nhu cầu sử dụng nước xuất Vì vậy, hàng năm phải nhập lượng lớn nguyên liệu từ nước ngồi Hiện nay, nhiều địa phương có chương trình mở rộng diện tích trồng Song mật ngun liệu, nhu cầu thị trường giống chất lượng cao ngày lớn Song mật loài có giá trị kinh tế cao nên người dân thường khai thác trước hoa, kết Bên cạnh đó, hạt Song mật có độ ẩm cao, thường bị giảm khả nảy mầm nhanh, nên khó bảo quản Sự thiếu hụt hạt giống yếu tố cản trở lớn cho việc mở rộng diện tích gây trồng Mặt khác, quần thể trồng từ thực sinh có tượng phân li hữu tính, nên khả sinh trưởng phát triển, cho số lượng chất lượng sản phẩm chun dụng khơng đồng Điều có ảnh hưởng khơng nhỏ đến việc gây trồng, chăm sóc, khai thác chế biến Việc áp dụng kỹ thuật tạo Song mật phương pháp nuôi cấy in vitro - phương pháp nhân giống sinh dưỡng tiên tiến nhằm chủ động tạo số lượng lớn có phẩm chất di truyền tốt đồng đều, thời gian ngắn thực việc làm cần thiết có nhiều ý nghĩa Vì vậy, chúng tơi thực đề tài Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Một số phương thức nhân giống in vitro 1.1 Nhân giống từ mô quan tách rời Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi nho dại, với số tác giả khác, ông chứng minh phận nuôi cấy gặp điều kiện thuận lợi Lon Ball (1946) với thí nghiệm ni cấy đỉnh chồi măng tây (Asparagus) cho thấy nuôi phận lá, thân, hoa, thân có khả tạo mô sẹo nhiều [7,12,14,17] - Nguyên liệu sử dụng phương thức nhân giống khối mô quan tách rời như: mảnh lá, chồi, đoạn thân, rễ, nhánh củ, phận - hoa, Các bước tiến hành nhân giống từ mô quan tách rời sau: + Chọn mẹ để lấy mẫu mô quan nuôi cấy thích hợp; + Chọn mẫu thích hợp: bánh tẻ, cành bánh tẻ, đầu rễ non; + Khử trùng mẫu với chế độ khử trùng thích hợp loại mô quan cụ thể; + Cấy mẫu khử trùng vào môi trường vào mẫu thích hợp lọai mơ, quan loại nuôi cấy Sau thời gian định từ mẫu mô quan nuôi cấy hình thành nên chồi cụm chồi; + Nhân nhanh chồi hình thành mơi trường nhân nhanh chồi thích hợp loại cây; + Cấy chồi vào mơi trường tạo rễ thích hợp để tạo hoàn chỉnh; Nhu cầu dinh dưỡng nuôi cấy khác khác thấy số yêu cầu chung nguồn bon dạng đường muối nguyên tố đa lượng (nitơ, photpho, kali, canxi vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co ) Ngoài cần số chất vô đặc biệt vitamin (B1, B6, axit nicotinic) chất điều hòa sinh trưởng Muốn trì sinh trưởng phát triển quan nuôi cấy cần thường xuyên chuyển sang môi trường [7,12,14,17] Đối với ni cấy mơ, ngồi thành phần dinh dưỡng nuôi cấy quan tách rời, cần bổ sung thêm chất hữu chứa nitơ dạng axit amin, đường, rượu inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, chất điều hịa PHỤ LỤC Biểu 01: Thành phần mơi trường MS 1962 + Nhóm chất khống đa lượng Hàm lượng chất khống Dung dịch mẹ Hố chất 1L mơi trường (mg) 100 L môi trường (mg) KNO3 NH4NO3 1900 1650 190.000 165.000 MgSO4.7H2O 370 37.000 lượng) KH2PO4 170 17.000 MS II CaCl2 332 33.200 MS I (muối đa (muối đa lượng) + Nhóm chất khống vi lượng Hàm lượng chất khoáng Dung dịch mẹ MS III (sắt) Hoá chất FeSO4.7H2O Na2EDTA ZnSO4 MS IV H3BO3 ( Muối vi lượng) Na2MoO4 CuSO4 CoCl2 KI MnSO4 H2O 1L môi trường (mg) 100L môi trường (mg) 27,84 37,24 2.784 3.724 8,6 6,2 0,25 0,025 0,025 860 620 25 2,5 2,5 0,83 16,9 83 1.690 + Nhóm chất vitamin Hàm lượng Vitamin Dung dịch mẹ Hố chất 1L mơi trường (mg) 100L môi trường (mg) MS V Thiamin HCl Pyridoxyl HCl 0,4 0,5 40 50 Nicotinic acid Glycine 0,5 50 200 Myo-Inositol 100 10.000 (Vitamin) Biểu 02: Thành phần môi trường MS* Thành phần chất khống đa lượng mơi trường MS 1962 Hàm lượng chất khoáng Dung dịch mẹ Hố chất 1L mơi trường 100 L mơi trường (mg) (mg) KNO3 3800 380.000 MS I (muối đa lượng) NH4NO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 3300 740 340 330.000 74.000 34.000 MS II (muối đa lượng) CaCl2 664 66.400 Phụ biểu 01: Ảnh hưởng loại hóa chất khử trùng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu chồi Song mật Lần CTKT Số mẫu TN Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu sạch (%) nảy mầm (%) lặp nảy mầm CM1 60 29 15 60 29 19 60 13 60 32 19 60 25 19 60 33 13 3 3 3 CM2 26 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 CM8 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 32 35 31 39 43 38 34 35 38 37 41 36 50 51 55 55 51 55 46.67 56.33 50 56.67 54.33 51.44 66.67 46.11 59.89 60.33 63.33 64.33 86.67 72.33 89.33 68.67 16 19 15 16 19 21 24 20 21 24 21 29 40 38 35 36 39 35 Kết phân tích phương sai: Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY Count Sum CM1 103 CM2 106.67 CM3 105.77 CM4 112.78 CM5 120.22 CM6 127.66 CM7 159 CM8 158 Tỷ lệ mẫu (%) 516.89 Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) 476.21 ANOVA Source of Variation SS df Rows 1804.04 Columns 103.429 Error 497.839 Total 2405.31 15 Average 51.5 53.335 52.885 56.39 60.11 63.83 79.5 79 64.61125 59.52625 MS 257.720211 103.4289 71.1198 Variance 46.6578 22.24445 4.17605 211.3568 0.0968 0.5 102.8178 213.4178 252.40807 76.4319410 F P-value 6.293275 0.0556 1.45429121 0.267 F crit 3.787 5.591 Phụ biểu 02: Ảnh hưởng đường kính gốc chồi đến khả tạo cụm chồi CTTN CC1 CC2 CC3 CC4 CC5 CC6 CC7 CC8 CC9 Đường kính gốc chồi măng ( cm) 1.5 ≥2 Chất điều hoà sinh trưởng BAP (mg/l) 4 TG mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (tuần) 10-13 10-13 10-14 Số lượng chồi TB/cụm 1.25 1.69 2.25 1.67 2.45 2.97 2.46 2.75 3.67 Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) Chất lượng chồi 78.56 Tốt 81.33 Tốt 82.67 Tốt Kết phân tích phương sai Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY Count Sum Average Variance CC1 CC2 CC3 2 79.81 80.25 80.81 39.905 40.125 40.405 2988.41805 2954.49845 2911.60805 CC4 CC5 CC6 2 83 83.78 84.3 41.5 41.89 42.15 3172.8578 3111.0272 3070.1448 CC7 CC8 CC9 Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi Số lượng chồi TB/cụm 2 9 85.13 85.42 86.34 727.68 21.16 42.565 42.71 43.17 80.85333333 2.351111111 3216.82205 3193.6032 3120.5 3.295075 0.553361111 ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total SS 23.00291111 27731.69502 7.784577778 27762.48251 df 8 17 MS 2.875363889 27731.69502 0.973072222 F 144 28499.1128 P-value 0.073216 1.7E-15 F crit 3.438101 5.317655 Phụ biểu 03: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo cụm chồi ĐC Ph1 Ph2 Ph3 Ph4 Ph5 Ph6 Ph7 Số chồi TB/cụm 2.13 2.67 3.46 4.5 4.55 2.63 3.45 Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) 89.25 91.33 92.45 94.35 94.47 90.25 93.67 Ph8 Ph9 Ph10 4.58 4.6 4.67 94.45 94.67 94.83 CTNC Kết phân tích phương sai Anova: Single Factor SUMMARY Groups Số chồi TB/cụm Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) ANOVA Source of Variation Count Sum Average Variance 37,24 3,385455 2,128027 11 11 929,72 SS Between Groups Within Groups Total df 36205,47956 7916,654873 44122,13444 84,52 789,5375 MS 36205,48 20 395,8327 21 F 91,466 P-value F crit 6,66144E-09 4,35 Phụ biểu 04: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi Môi trường nuôi cấy TG mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (tuần) Số lượng chồi Tb/cụm Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) Chất lượng chồi 1MS 2MS MS* 10-14 9-13 -12 1.87 2.43 2.97 91 95.67 96.67 Tốt Tốt Tốt Kết phân tích phương sai Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) 283.34 94.44667 9.159633 Số lượng chồi Tb/cụm 7.27 2.423333 0.302533 MS F P-value 2684.891 8.30272E-07 ANOVA Source of Variation SS df Between Groups 12702.44082 12702.44 Within Groups 18.92433333 4.731083 Total 12721.36515 F crit 7.708647 Phụ biểu 05: Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả tạo cụm chồi Nuôi tối (tuần) Nuôi sáng (tuần) - - Thời gian mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (tuần) 9 23 30 77 21 30 78 23 30 76 22 30 81 23 30 79 23 30 80 25 30 83 24 30 86 21 30 78 21 30 78 22 30 79 22 30 81 22 30 81 23 30 82 Số lần lấy số liệu Số mẫu tạo cụm chồi Số chồi ban đầu Số chồi sau tuần nuôi cấy 22 30 79 Chất lượng chồi chồi xanh, phân chồi rõ chồi xanh, phân chồi rõ chồi thon, xanh, phân chồi rõ chồi xanh nhạt, có mơ sẹo chồi xanh, phân chồi rõ Kết phân tích phương sai Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY Count Sum Average Variance ĐK1 131 43.66666667 952.3333333 ĐK1 130 43.33333333 862.3333333 ĐK1 129 43 939 ĐK2 129 43 829 ĐK2 133 44.33333333 1024.333333 ĐK2 132 44 931 ĐK3 133 44.33333333 966.3333333 ĐK3 138 46 1033 ĐK3 140 46.66666667 1169.333333 ĐK4 129 43 939 ĐK4 129 43 939 ĐK4 131 43.66666667 952.3333333 ĐK5 ĐK5 ĐK5 Số chồi ban đầu 3 15 133 133 135 450 44.33333333 44.33333333 45 30 1024.333333 1024.333333 1039 Số mẫu tạo cụm chồi 15 337 22.46666667 1.266666667 Số chồi sau tuần nuôi cấy 15 1198 79.86666667 6.552380952 ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total SS 51.1111111 29190.9778 58.3555556 29300.4444 df MS F P-value F crit 14 3.650793651 17.51713633 0.100561997 2.063540829 14595.48889 7003.166794 1.58317E-38 3.340385558 28 2.084126984 44 Phụ biểu 06: Ảnh hưởng BAP, Kinetin, IBA, NAA đến khả nhân nhanh chồi CTTN ĐC NC1 NC2 NC3 NC4 NC5 NC6 NC7 NC8 NC9 NC10 NC11 NC12 Chất điều hoà sinh trưởng ( mg/l) BAP 0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5 Kinetin 0.5 IBA 0.2 NAA 0.1 0.3 0.2 1.5 0.4 0.3 Hệ số nhân chồi (lần) Chất lượng chồi 1.87 2.65 3.07 4.03 2.33 3.35 3.97 4.95 2.45 3.86 4.77 4.93 ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ Phụ biểu 07: Ảnh hưởng BAP, Kinetin, NAA, GA3, đến khả kích thích tăng trưởng chồi Chiều cao TB chồi (cm) Chất ĐHST (mg/l) CTTN Kinetin KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 KT7 KT8 KT9 KT10 KT11 KT12 0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5 BAP NAA GA3 0.2 0.5 0.2 0.2 0.1 0.3 0.5 0.3 Trước cấy Sau cấy 1.68 1.67 1.65 1.67 1.68 1.7 1.67 1.67 1.65 1.6 1.58 1.65 4.33 4.67 4.85 5.05 5.33 5.35 5.67 5.75 5.8 5.67 5.68 5.77 Lượng tăng trưởng chồi (cm) 2.65 3.2 3.38 3.56 3.65 4.08 4.15 4.07 4.1 4.12 Hệ số nhân chồi (lần) 2.05 2.45 2.67 2.33 2.7 3.06 2.85 3.33 3.56 2.87 3.45 3.47 Kết phân tích phương sai nhân tố Lượng tăng trưởng chồi (cm) 12 43.96 3.663333 0.260097 Số TB/chồi 12 43.96 3.663333 0.260097 Hệ số nhân chồi ANOVA Source of Variation 12 34.79 2.899167 0.238154 SS df MS Rows 7.912297 11 Columns 4.671606 Error 0.429528 22 0.019524 Total 13.01343 35 F P-value F crit 0.7193 36.84184 1.35E-11 2.258518 2.335803 119.6376 1.51E-12 3.443357 Phụ biểu 08 : Ảnh hường IBA NAA đến khả tạo rễ Song mật Chất ĐHST (mg/l) CTTN NAA IBA 0.5 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 0.1 0.2 0.3 0.4 Thời gian chồi bắt đầu rễ (ngày) Số rễ TB/ chồi Chiều dài rễ (cm) 25 ÷ 34 25 ÷ 34 25 ÷ 34 24 ÷ 32 24 ÷ 32 25 ÷ 34 25 ÷ 34 24 ÷ 32 24 ÷ 32 1.85 1.9 1.98 2.45 2.67 2.33 2.46 2.65 2.33 2.67 2.7 2.76 2.85 2.36 2.65 2.75 2.83 0.5 Tỷ lệ chồi rễ (%) 58.67 60.05 63.56 66.05 70.25 61.33 63.15 65.67 70.15 Kết phân tích phương sai Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Tỷ lệ chồi rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Tỷ lệ chồi rễ (%) ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total Count 3 3 Sum 119.67 122.77 129.82 134.86 143.35 Average 39.89 40.92333333 43.27333333 44.95333333 47.78333333 Variance 1058.0652 1097.488133 1234.646533 1335.208033 1514.253333 3 3 9 125.02 128.95 134.09 143.13 578.88 23.9 578.88 41.67333333 42.98333333 44.69666667 47.71 64.32 2.655555556 64.32 1159.153633 1220.083333 1319.642133 1510.6608 16.8764 0.035452778 16.8764 MS 23,36575093 11407,51113 5,211250926 F 4,483712502 2189,015898 SS 186,926 22815,02 83,38001 23085,33 df 16 26 P-value 0,005199537 3,09068E-20 F crit 2,59109618 3,633723468 Phụ biểu 09: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả rễ chồi in vitro CTTN M1 M2 M3 Môi trường nuôi cấy MS MS1* 1/2MS* Lần TN Số mẫu cấy ban đầu 30 Thời gian chồi bắt đầu rễ (ngày) Số chồi rễ Số rễ Chiều dài rễ (cm) 24-32 120 29 2.5 30 126 28 2.7 30 119 24 81 8.2 156 30 30 30 142 27 2.6 30 122 26 420 83 8.6 150 30 2.8 24-32 30 30 142 27 2.6 30 154 27 3.2 446 84 8.6 24-32 Phụ biểu 10 : Ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống sinh trưởng vườn ươm Trấu hun (%) 45.67 11.12 Số trung bình/ (chiếc) Thành phần ruột bầu CTTN Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số rễ TB /cây (chiếc) G1 Đất tầng B (%) 100 G2 100 65.67 11.26 3.42 4.24 G3 0 100 56.33 11.18 3.28 4.02 G4 70 30 75.89 11.54 3.34 4.35 G5 50 50 78.96 11.68 3.75 4.58 G6 70 30 72.54 11.21 3.31 4.29 G7 50 50 76.33 11.39 3.56 4.41 G8 50 30 20 80.67 11.94 3.91 4.67 Cát (%) Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY Count G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 Tỷ lệ sống Chiều cao 4 4 4 4 8 Số rễ TB Số trung bình 8 Sum Average 63.79 15.9475 84.59 21.1475 74.81 18.7025 95.12 23.78 98.97 24.7425 91.35 22.8375 95.69 23.9225 104.19 26.0475 555.06 69.3825 91.32 11.415 27.57 34.56 3.44625 4.32 Variance 405.704092 893.381158 641.948692 1220.19607 1319.12589 1110.29009 1232.99289 1488.81349 163.268478 0.08148571 0.0825125 0.05697143 ANOVA Source of Variation SS df MS F Rows 318.173947 45.45342098 11.55243 Columns 24111.1049 8037.034978 204.269 Error 826.252191 21 39.34534241 Total 25255.5311 31 Pvalue 0.368 503 1.08E -15 Phụ biểu 11 : Ảnh hưởng chế độ che sáng đến tỷ lệ sống sinh trưởng vườn ươm Thời gian che (tuần) CTTN Tỷ lệ che bóng (%) Tỷ lệ sống (%) VCB1 25 62,34 VCB2 50 65,87 VCB3 75 79,96 VCB4 100 79,99 VCB5 25 64,02 VCB6 50 69,58 VCB7 75 81,56 VCB8 100 81,68 F crit 2.4876 3.0725 Kết phân tích phương sai Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY 25 50 75 100 tuần tuần ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total Count 2 2 4 SS 491,6007 9,4178 1,5835 502,602 Sum 126,36 135,45 161,52 161,67 288,16 296,84 df 3 Average 63,18 67,725 80,76 80,835 72,04 74,21 Variance 1,4112 6,88205 1,28 1,42805 86,02926667 78,36546667 MS 163,8669 9,4178 0,527833333 F 310,4519735 17,84237449 P-value 0,000308563 0,024262611 F crit 9,276628 10,12796 Ảnh Hình ảnh minh họa giai đoạn quy trình tạo Song mật kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ chồi măng trưởng thành Cây Song mật in vitro hoàn chỉnh Cây Song mật in vitro sau ngày cấy vào bầu Cây Song mật in vitro sau tuần cấy vào bầu Cây Song mật in vitro đủ tiêu chuẩn trồng rừng ... 2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu in vitro 17 2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro 17 2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh kích thích tăng trưởng chồi 18 2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật. .. xuất quy mơ cơng nghiệp Nghiên cứu tạo Song mật kỹ thuật nuôi cấy in vitro vấn đề Việt Nam Do vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống Song mật kỹ thuật ni cấy in vitro việc làm cần thiết... phương thức nhân giống in vitro Song mật Mặc dù nghiên cứu giới giải nhiều vấn đề liên quan tới việc ni cấy in vitro Song mật có tác giả nghiên cứu đầy đủ xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho