Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ THANH TÂM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẠCH CẬP (Bletilla striata) TỪ HẠT BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY MƠ TẾ BÀO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : K46 - CNSH Khóa học : 2014 – 2018 Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ THANH TÂM Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẠCH CẬP (Bletilla striata) TỪ HẠT BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K46-CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2014– 2018 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Tiến Dũng GS.TS Ngơ Xn Bình Thái Ngun – 2018 i LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái ngun, tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Thanh Tâm ii LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập em tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào” Trong trình thực tập để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ nhà trường với dạy tận tình thầy giáo khoa Công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Tiến Dũng, GS.TS Ngơ Xn Bình giáo Nguyễn Thị Tình tận tình bảo, giúp đỡ hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình tạo điều kiện vật chất tốt chỗ dựa tinh thần cho em trình thực tập; cảm ơn bạn bè giúp đỡ em thời gian vừa qua Mặc dù thân cố gắng thời gian thực đề tài có hạn nên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp chân thành từ thầy bạn để đề tài hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Thanh Tâm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.2 Thiết bị Dụng cụ 23 Bảng 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 31 Bảng 4.2 Kết nghiện cứu khả nảy mầm hạt số môi trường 33 Bảng 4.3 Kết nghiên ảnh hưởng nồng độ nước dừa tới khả nhân nhanh chồi 35 Bảng 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP khả nhân nhanh chồi 37 Bảng 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin tới khả khả nhân nhanh chồi 39 Bảng 4.5 kết nghiên cứu ảnh hưởng IBA tới khả rễ 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm 26 Hình 4.2 Ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt sau 34 Hình 4.3 Ảnh hưởng nước dừa tới khả nhân nhanh chồi 36 Hình 4.4.1 Ảnh hưởng BAP tới khả nhân nhanh chồi 38 Hình 4.5 Ảnh hưởng nồng độ IBA khác đến khả tạo rễ 41 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine GA3 : Gibberellic Acid IBA : Indole butyric acid MS : Murashige & Skoog (1962) CS : Cộng CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog (1962) MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid WHO : World Health Organization BAP : 6-benzylaminopurine IAA : Indole-3-acetic acid Kinetin : Furfurylaminopurine MỤC LỤC LỜI CAM KẾT i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn gốc phân loại phong lan 2.2 Đặc điểm sinh vật học hoa phong lan 2.3 Một số kết nghiên cứu nhân giống hoa phong lan phương pháp nuôi cấy mô 2.4 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào 2.4.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào 2.4.2 Tính tồn tế bào 2.4.3 Sự phân hóa tế bào phản phân hóa 10 2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật 11 2.5.1 Vật liệu nuôi cấy 11 2.5.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.6 Các giai đoạn nhân giống vơ tính in vitro 19 vii 2.6.1 Giai đoạn chuẩn bị 19 2.6.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 19 2.6.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 20 2.6.4 Tạo hoàn chỉnh 20 2.6.5 Giai đoạn đưa đất 20 2.7 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào lan Bạch Cập giới nước 21 2.7.1 Tình hình nghiên cứu ni cấy mơ lan Bạch Cập giới 21 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Bạch Cập nước 22 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 23 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 23 3.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 23 3.2.1 Hóa chất sử dụng 23 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành 24 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.4.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng HgCl2 tới khả tạo vật liệu vô trùng 24 3.4.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả mầm hạt 24 3.4.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nước dừa đến khả nhân nhanh chồi 25 3.4.4.Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng tới khả nhân nhanh chồi 25 3.4.5.Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả rễ 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu tiêu theo dõi 26 viii 3.6 Phương pháp xử lí số liệu 30 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Ảnh hưởng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 31 4.2.Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy tới khả nảy mầm hạt lan Bạch Cập 33 4.3 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa tới khả nhân nhanh chồi 34 4.4 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng tới khả nhân nhanh chồi 37 4.5 Kết nghiên cứu ánh hưởng IBA tới khả rể 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 41 CT3 tỷ lệ chồi tạo rễ với tỷ lệ chồi tạo rễ công thức Đ/C 76%, số chồi tạo rễ 23 chồi, CT4 tăng nồng độ IBA lên mg/l tỷ lệ chồi tạo rễ giảm 2% số chồi tạo rễ giảm chồi so với cơng thức Đ/C Hình thái rễ ngắn, nhỏ, có màu nâu số rễ bị dị dạng chất lượng rễ Như công thức cho số chồi rễ tốt thí nghiệm CT sử dụng nồng độ IBA 1,0 mg/l cho tỉ lệ tạo rễ 93 %, chất lượng rễ tốt A B C D E Hình 4.5 Ảnh hưởng nồng độ IBA khác đến khả tạo rễ A: Công thức Đ/C bổ sung ml/l IBA B: CT1 bổ sung 1,0 ml/l IBA C: CT2 bổ sung 2,0 ml/l IBA D: CT3 bổ sung 3,0 ml/l IBA E: CT4 bổ sung 4,0 ml/l IBA 42 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tiến hành thí nghiệm đề tài xin đưa số kết luận sau nhân giống lan Bạch Cập từ hạt phương pháp nuôi cấy mô sau: Nồng độ chất khử trùng HgCl2 khử trùng tốt nồng độ 0,1% thời gian 10 phút Môi trường phù hợp giúp cho hạt nảy mầm tốt mơi trường: ½ MS + 30g đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính + 5,5g/l agar ( tính để pha cho lít mơi trường ni cấy), pH = 5,8 Bổ sung (m/l) 150 vào mơi trường ½ MS + 30g đường + 150 ml nước dừa + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính + 5,5g/l agar, pH = 5,8 thích hợp cho q trình nhân chồi lan Bạch Cập Bổ sung Kinetin (mg/l) 0,5 + BAP (mg/l) 1,0 vào mơi trường ½ MS + 30g đường + 150 ml nước dừa + 1g pepton + 1g than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 thích hợp cho q trình nhân chồi lan Bạch Cập Bổ sung IBA (mg/l) 1,0 vào môi trường MS + 30 g saccarose/lít + 150 ml nước dừa + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính + 5,5g/l agar, pH = 5,8 mang lại hiệu rễ tốt giai đoạn tạo hoàn chỉnh từ lan Bạch Cập 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả nhân nhanh chồi lan Bạch Cập - Nghiên cứu thêm giá thể thích hợp cho sinh trưởng phát triển in vitro - Ứng dụng mơi trường thích hợp vào nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh lan Bạch Cập TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt Nguyễn công nghiệp (2000), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật Nxb Giáo dục, Hà Nội Trần Hợp (1990), Phong lan Việt Nam, tập 1, 2,Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứuvà nhận biết học thực vật bậc kín Việt Nam, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội Đỗ Năng Vịnh, (2005) Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng NXB Nơng Nghiệp Hồng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thu Hà (2010), Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng giống lan hài quý (Hài Hằng) thu thập Việt Nam, Tạp chí Khoa học phát triển, tập 8, số tr 194201 Võ Hà Giang (2010), Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa) phương pháp nuôi cấy mô tế bào Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp đại học Nông Lâm Thái Nguyên Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tuấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Lý (2014), Nghiên cứu ảnh hưởng số hợp chất hữu lên trình sinh trưởng phát triển lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro Tạp chí sinh học, 36(1se): 250-256 10 Ngô Thị Nguyệt, Tô Phương Thảo, Đặng Thị Chinh, Hoàng Thị Thế (2013), Thu thập, lưu trữ nguồn gen ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển số loài lan quý Quảng Ninh, Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ đề tài, Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm Nông nghiệp Quảng Ninh, tr 20-24 11 Lê Minh Nguyệt cộng (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh nhân nhanh giống Hoàng lan thuộc chi lan Kiếm ( Cymbidium), tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, số 3(12), tr 24-34 12 Trịnh Thị Tuyết (2016), Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoens) phương pháp in vitro, luận văn thạc sĩ ứng dụng Đại học Khoa Học, Đại học Thái Nguyên II Tài liệu tiếng anh 13 Hunming Wang, Jiantao Sun, Yi Luo, Weihua Xue, Huajia Diao, Lei Dong, Jiangning Chen & Junfeng Zhang (2006), A polysaccharide isolated from the medicinal herb Bletilla striata induces endothelial cells proliferation and vascular endothelial growth factor expression in vitro, Biotechnology Letters (2006) 28: 539–543 14 Singh, A., Duggal, S (2009) “ Medicinal Orchids - An Overview” Ethnobotanical Leaflets 13: 399-412 15 Croezen P (2002) “ In vitro orchid cultivation OrchidMania Inc” http://www.orchids.org/conservation/inVitro.html 16 Deb, C.R., Imchen, T (2010) “An efficient in vitro hardening technique of tissue culture raised plants” Biotechnology 9: 79-83 17 Sungkumlong and chitta Ranjan Deb (2007) Effects of different factors on immature embryo culture, PLBs diffrentiation and rapid mass miltiplication of Coelogyne suaveolens (Lindl) Hook Indian Journal of Experimental Biology, Vol.46,pp.243-248 18 Diaoa, H., Lia, X., Chena, J., Luoa, Y., Chena, X., Donga, L., Wanga, C., Zhanga, C., Zhanga, J (2008) “Bletilla striata Polysaccharide Stimulates Inducible Nitric Oxide Synthase and Proinflammatory Cytokine Expression in Macrophages” Journal of Bioscience and Bioengineering 105: 85-89 19 QiangPeng, MingLi, FengXue, HuajingLiu (2014).“Structure and immunobiological activity of a new polysaccharide from Bletilla striata” volum 107 Page 119-123 20 Xiang-gen Wu, Meng Xin, Hao Chen, Li-na Yang, Hao- ran Jiang (2010), Novel mucoadhesive polysaccharide isolated from Bletilla striataimproves the intraocular penetration and efficacy of levofloxacin in the topical treatment of experimental bacterial keratitis, volum 62, pages 1152-1157 PHỤ LỤC 1: CÁC MÔI TRƯỜNG NI CẤY Mơi trường MS ( Murashige-Skoog) St T N t hà ồn Đ a N 16 H 50 C 44 a M 37 g K 19 N 00 K 17 H Vi lư N 37 a2 ,3 Fe 27 S ,8 M 22 n ,3 H 6, 3B Z 8, n K 0, I 83 N 0, a2 25 C 0, u 02 C 0, o 02 Vi ta Gl yc Pi 0, ry M 10 es Ni 0, co T 0, hi 2.Môi trường KUNUDSON C ( KC) St T N t hà ồn Đ a C 24 a( 1, K 25 Cl M 12 g 2, N 50 H K 25 H ( 50 N Vi lư Fe 25 S M 5, n 68 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm : Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nảy mầm hạt BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE TN2 11/ 6/** 20:47 PAGE VARIATE V003 TL LN SO UR D MF ER SU E RA SQ S LN Q ==================== ==================== CT 19 5.1 04 * 37 RESIDU * TOTAL (CORRECTED) 20 16613.8 830.688 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 11/ 6/** 20:47 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT N O S 1 5 8 5 2 4 4 SE( N= ) 5%L 14 SD DF ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 11/ 6/** 20:47 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 21) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 28.822 19.245 TL 21 46.032 C OF V |CT % | | | | | | 41.8 0.0056 Thí nghiệm : Ảnh hưởng nước dừa tới khả nhân nhanh chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HS FILE TN3 11/ 6/** 8:20 PAGE VARIATE V003 HS LN SO UR D M F ER SU E RA SQ S LN S Q ============================================================================= CT 1.27304 * RESIDUAL 318259 204.59 0.000 10 155557E-01 155557E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 1.28859 920423E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 11/ 6/** 8:20 PAGE MEANS FOR EFFECT CT - C T N O H SE( N= ) 5%L 10 SD DF ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 11/ 6/** 8:20 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | N O O B 11.7 5956 HS BA SE TO TA 15) BA% SE RE SI DEVIATION C OF V |CT | | || || 2.2 0.0 Thí nghiệm : Ảnh hưởng BAP tới khả nhân nhanh chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HS FILE TN 11/ 6/** 12:44 PAGE VARIATE V003 HS LN SO UR D M F ER SU E RA SQ S LN S Q ============================================================================= CT 7.92426 * RESIDUAL 1.58485 ****** 0.000 12 162986E-01 135822E-02 * TOTAL (CORRECTED) 17 7.94056 467092 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN 11/ 6/** 12:44 PAGE MEANS FOR EFFECT CT - C T N O 3 3 SE( N= ) 5%L 12 SD DF ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN 11/ 6/** 12:44 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | N O O B 11.3 8500 HS BA SE TO TA 18) BA% SE RE SI DEVIATION C OF V |CT | | || || 2.7 0.0 Thí nghiệm : Ảnh hưởng kinetin tới khả nhân nhanh chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HS FILE TN44 11/ 6/** 8:25 PAGE VARIATE V003 HS LN SO UR D M F ER SU E RA SQ S LN S Q ============================================================================= CT 4.22179 * RESIDUAL 844358 526.10 0.000 12 192594E-01 160495E-02 * TOTAL (CORRECTED) 17 4.24105 249474 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN44 11/ 6/** 8:25 PAGE MEANS FOR EFFECT CT - C T N O 3 3 SE(N= 3) 0.231297E-01 5%LSD 12DF 0.712705E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN44 11/ 6/** 8:25 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HS GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | N O O B 11.0 8352 BA SE TO TA 18) BA% SE RE SI || || 3.9 0.0 DEVIATION C OF V |CT | | Thí nghiệm : Ảnh hưởng IBA tới khả tạo rễ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE TN5 11/ 6/** 8:27 PAGE VARIATE V003 TL LN SO UR D MF ER SU E RA SQ S LN Q ==================== ==================== CT 19 12.3 1 * 15 RESIDU * TOTAL (CORRECTED) 14 921.482 65.8201 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 11/ 6/** 8:27 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT N O S 7 SE( N= ) 5%L 10 SD DF ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 11/ 6/** 8:27 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TL GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | N O O B 180 5889 BA SE TO TA 15) BA % || SE RE || SI 4.9 0.0 DEVIATION C OF V |CT | | XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên ngày… tháng….năm… Người nhận xét phản biện (chữ ký ghi rõ họ tên) Người hướng dẫn (chữ ký ghi rõ họ tên) Th.S Nguyễn Thị Tình TS Nguyễn Tiến Dũng ... đề tài Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt kỹ thuật ni cấy mơ tế bào 1.2 Mục đích nghiên cứu - Xác định số yếu tố ảnh hưởng tới khả nhân nhanh lan Bạch Câp từ hạt như:... phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một yếu tố quan trọng tăng trưởng, phát triển hình thái tế bào mô thực vật nuôi cấy thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế. .. dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng phận khác thực vật với kích thước nhỏ Trong thực tế, nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô nhân giống in vitro hay nuôi cấy