Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhângiống lan Bạch Cập bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giáđược ảnh hưởng của các chất kích t

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẠCH CẬP (Bletilla striata)

TỪ HẠT BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : K46 - CNSH Khóa học : 2014 – 2018

Thái Nguyên - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

Tê n đ ề tà i:

TRẦN THỊ THANH TÂM

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẠCH CẬP (Bletilla striata)

TỪ HẠT BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực vàchưa được công bố trong bất kì công trình nào khác

Thái nguyên, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Trần Thị Thanh Tâm

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệmkhoa Công nghệ Sinh học và công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập

em đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào”.

Trong quá trình thực tập để hoàn thành khóa luận ngoài sự nỗ lực củabản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của nhà trường cùng với sự chỉdạy tận tình của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học và côngnghệ thực phẩm

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Tiến Dũng, GS.TS.Ngô Xuân Bình và cô giáo Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ vàhướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất cóthể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn

bè đã giúp đỡ em trong thời gian vừa qua

Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhưng do thời gian thực hiện đề tài

có hạn nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mongnhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tàiđược hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2018

Sinh viên Trần Thị Thanh Tâm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.2 Thiết bị và Dụng cụ 23Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 đến khả năng tạo vậtliệu vô trùng 31Bảng 4.2 Kết quả nghiện cứu khả năng nảy mầm của hạt trên một số môitrường 33Bảng 4.3 Kết quả nghiên ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới khả năngnhân nhanh chồi 35Bảng 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP khả năng nhân nhanhchồi 37Bảng 4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng khả năngnhân nhanh chồi 39Bảng 4.5 kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm 26Hình 4.2 Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau 34Hình 4.3 Ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi 36Hình 4.4.1 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng nhân nhanh chồi 38Hình 4.5 Ảnh hưởng của các nồng độ IBA khác nhau đến khả năng tạo rễ 41

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BAP : 6-Benzylaminopurine

GA3 : Gibberellic Acid

IBA : Indole butyric acid

MS : Murashige & Skoog (1962)

CS : Cộng sự

CT : Công thức

CV : Coeficient of Variation

Đ/c : Đối chứng

LSD : Least Singnificant Difference Test

MS : Murashige & Skoog (1962)

MT : Môi trường

NAA : α-Naphthalene acetic acid

WHO : World Health Organization

BAP : 6-benzylaminopurine

IAA : Indole-3-acetic acid

Kinetin : Furfurylaminopurine

MỤC LỤC

LỜI CAM KẾT i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

2.1 Nguồn gốc và phân loại phong lan 4

2.2 Đặc điểm sinh vật học của cây hoa phong lan 5

2.3 Một số kết quả nghiên cứu về nhân giống của hoa phong lan bằng phương pháp nuôi cấy mô 7

2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 9

2.4.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào 9

2.4.2 Tính toàn năng của tế bào 9

2.4.3 Sự phân hóa tế bào và phản phân hóa 10

2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.5.1 Vật liệu nuôi cấy 11

2.5.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

11 2.6 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro 19

2.6.1 Giai đoạn chuẩn bị 19

2.6.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 19

2.6.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 20

2.6.4 Tạo cây hoàn chỉnh 20

2.6.5 Giai đoạn đưa cây ra đất 20

2.7 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào lan Bạch Cập trên thế giới và trong nước 21

2.7.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Bạch Cập trên thế giới 21

2.7.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Bạch Cập trong nước 22

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 23 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 23

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 23

3.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 23

3.2.1 Hóa chất sử dụng 23

3.3 Địa điểm và thời gian tiến hành 24

3.4 Nội dung nghiên cứu 24

3.4.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 tới khả năng tạo vật liệu vô trùng 24

3.4.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng này mầm của hạt 24

3.4.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi 25

3.4.4.Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh chồi 25

3.4.5.Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 26

3.6 Phương pháp xử lí số liệu 30

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Ảnh hưởng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 31

4.2.Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng nảy mầm của hạt lan Bạch Cập 33

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi 34

4.4 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh chồi 37

4.5 Kết quả nghiên cứu ánh hưởng của IBA tới khả năng ra rể 40

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

1

Việt Nam là quốc gia được đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú,phong lan Việt Nam đa dạng về số loài, màu sắc và chủng loại với trên 140loại phong lan chia ra thành 1000 giống nguyên thủy Chúng thường phân bố

ở các vùng rừng núi Cao Bằng, Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hải Vân, Quy Nhơn,Kontum, Pleiku, Ban Mê Thuật, Phan Rang, Đà Lạt, Di Linh, v.v Trong sốcác loài lan của Việt Nam có rất nhiều cây quý hiếm điển hình là giống lan

Bạch Cập (Bletilla striata)

Lan Bạch Cập (Bletilla striata) thuộc họ lan Orchidaceae là một trong

những họ lớn nhất và cũng mang nhiều giá trị kinh tế, khoa học Lan Bạch

Cập (Bletilla striata) có phạm vi phân bố hẹp chỉ có ở một số tỉnh miền núi

phía bắc Việt Nam như Cao Bằng, Lạng sơn, Lào Cai

Hoa lan không với tác dụng làm đẹp, đồng thời cũng là một dược liệuthiên nhiên để hỗ trợ cho nhiều căn bệnh Trong thời gian gần đây, các nhàkhoa học đã nghiên cứu nhằm tạo ra được giống lan có chất lượng cao, chonăng suất và phẩm chất tốt mà giá thành hợp lý để triển khai vào sản xuất ởquy mô thương mại Vì thế ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất là cầnthiết

Đặc thù riêng của lan Bạch Cập là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầmcủa hạt trong tự nhiên thấp ,vì vậy việc nghiên cứu nhân giống Bạch Cập rấtđược chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn gen thực vật

quý hiếm Trước đây các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lanBạch Cập bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưngnhững phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây thấp,không đồng đều và số lượng cây ít Để khắc phục được điều này, phươngpháp nhân giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên.Phương pháp này cho số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạchbệnh, đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được Hiệnnay nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ cóthể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền trong mộtthời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chăng của thị trường được coi làmột giải pháp lý tưởng mà không thể thay thế được

Xuất phát từ thực tiễn đó mà chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào”.

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh lanBạch Câp từ hạt như: HgCl2 , BAP, kinetin, IBA, nước dừa

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng HgCl2 tới khả năng tạo vật liệu vô trùng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng nảy mầmcủa hạt lan Bạch Cập

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới khả năng nhânnhanh chồi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP va kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhângiống lan Bạch Cập bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giáđược ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trườngnuôi cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây lan khác

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ cố gắng cung cấp được số lượng cây giống cóchất lượng cao, đồng đều cho sản xuất

PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Nguồn gốc và phân loại phong lan

Trên khắp trái đất, hầu như nơi nào có thực vật là có phong lan Tuynhiên số lượng nhiều ít khác nhau Ở Columbie có trên 3000 loài, khoảng 100loài ở Mỹ và Alasca chỉ có 14 đến 15 loài Mỗi loài có một cách phân bố vàphát triển rất riêng biệt cho kiểu dáng và kích cỡ của cây lan khác nhau rấtnhiều, sự khác biệt đó không chỉ vì xuất xứ từ các lục địa khác nhau mà còn

có khi ở ngay trong một vùng địa lý vài kilomet vuông

Hoa phong lan là một họ rất lớn thuộc lớp đơn tử diệp, phân bố khắpnơi trên thế giới, nhưng phong phú nhất ở các rừng ẩm nhiệt đới, các vùngĐông Nam Á và Trung Mỹ Họ lan phân bố từ 68 độ bắc tới 56 độ vĩ nam

Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan, một số loàihoại sinh không diệp lục và sống vào chất mục nát trong đất Có loài ở châu

Úc có thể sống ngầm dưới đất như nấm

Ở vùng nhiệt đới ta sẽ gặp nhiều loại phụ sinh sống trên cây khác nhưcattleya, oncidium, laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ, ở Đông Nam Áđặc sắc nhất là Denbrodium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis,Cymbidium có nguồn gốc ở Inđônêsia

Cây lan có thể chia thành hai nhóm: Nhóm đơn thân và nhóm đa thân

* Nhóm đơn phân chia làm hai nhóm phụ:

- Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): Nhóm này lá được xếp thànhhai hàng mọc đối nhau

Gồm các giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis

- Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe,Luisia

* Nhóm đa thân: Gồm những cây tăng trưởng liên tục Căn cứ vào cách

ra hoa nhóm này chia thành hai nhóm phụ:

- Nhóm ra hoa phía trên như: lan Kiếm (Cymbidium), lan Hoàng Thảo (Dedrobium), lan Vũ Nữ (Oncidium)

- Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cát Lan (Cattleya),chi Trúc Lan (Epidendrum)

Cây hoa Phong Lan có tên khoa học là Orchidaceae Theo hệ thống họcthực vật mới nhất, cây hoa Lan được phân loại như sau:

2.2 Đặc điểm sinh vật học của cây hoa phong lan

- Thân [6];[8];[11]: lan có hai loại thân: Đa thân và đơn thân

Đa thân đại diện các chi lan Kiếm (Cymbideam), chi lan Hài (paphiopeclilum), chi Cát Lan (Cattleya),

Đơn thân các chi lan Vanda, Hồ Điệp (Phaleanopsis), Phượng vĩ (Renanthera), Giáng hương (Aerides)

Củ giả: có hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hoặc rải rác đềuhoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả Củ giả gồm nhiều

mô mềm chứa nhiều dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày ,nhẵn bóng bảo vệ tránh sự mất nước do ánh sáng mặt trời Đa số củ giả đều cómàu xanh bóng nên cùng với nó là làm nhiệm vụ quang hợp [8];[11]

- Căn hành ( thân, rễ): chỉ gặp ở lan đa thân, căn hành là nơi cấu tạo các

cơ quan dinh dưỡng mới, trên căn hành có nhiều mắt sống, chết Mắt lá nơihình thành cũng mang rất nhiều rễ để nuôi sống cây lan [8];[11]

- Rễ: đa số rễ của các loài lan có lớp mô xốp màu trắng ngà với nhiềucông dụng khác nhau như: bảo vệ nguồn dẫn nước bên trong của rễ, hút nước

và các muối khoáng bám trên bề mặt rễ và hấp thụ cả hơi nước trong khôngkhí ẩm, chúng có khả năng bám chạt vào các vật mà chugn1 tiếp xúc Ruộtcủa rễ các loại lan là một sợi dây rất chắc và khá dài như sợi cước, chính vìvậy rễ lan đảm bảo cho cây lan có thể bám chắc chăn trên ngọn cây cao haytrên vách núi mà không sợ bị gió cuốn đi Miền chóp rễ có chứa các chất diệplục nên rễ cũng làm phần chức năng quang hợp của lá [1];[8];[11]

- Lá : đa số các loài phong lan lá cây tự dưỡng, nó phát triễn đầy đủ hệthống lá Hình dạng cảu lá thay đổi rất nhiều từ loại lá mọng nước đến láphiến mỏng, phiến lá trải rộng khắp hay gấp lại theo gân vòng cung hay chỉgấp lại theo gân hình chữ V Màu sắc lá thường xanh bóng nhưng có trườnghợp hai mặt lá màu khác nhau, thường màu lá dưới có màu xanh đậm hay tía,mặt trên lại khảm nhiểu màu sắc sặc sỡ [5];[8];[11]

- Hoa: đối xứng qua một mặt phẳng, bên ngoài có 6 cánh, trong có 3cánh dài ở ngoài cùng, thường có màu sắc và kích thước giống nhau Mộtcánh dài nằm phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, 2 cánh dàinằm 2 bên gọi là cánh đài cạnh Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là

3 cánh hoa Chúng giồng nhau về hình dáng, kích thước , màu sắc Cánh cònlại nằm phái trên hay phái dưới có màu sắc và hình dạng khác hẳn với cáccánh còn lại gọi là cánh môi, cánh môi quyết định giá trị thầm mĩ của lan Ởgiữa hoa có một trụ nổi lên bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòigiống Trụ gồm nhiều nhụy và nhị, sau khi thụ phấn các cánh hoa héo, cuốnghoa hình thành quả lan [4];[8];[11]

- Quả và hạt: quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-4 đường nứt dọc,quả có dạng cài dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín quả nở ra vàmảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía dỉnh và phái gốc[8];[11].

Hạt lan rất nhiều, hạt nhỏ li ti Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phânhóa, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thành sau2-18 tháng Hạt phong lan không có nội nhũ nên khó phát triển thành cây Cácloài lan rừng chủ yếu nhờ nấm để phát triển thành cây[8];[11]

2.3 Một số kết quả nghiên cứu về nhân giống của hoa phong lan bằng phương pháp nuôi cấy mô.

Các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước đã đưa ra một số môi trườngnuôi cấy phong lan phổ biến là Vanci and went, Knudson C, Murashige &Skoog (1962)

- Năm 2009 Lê Minh Nguyệt và cộng sự [13] đã nghiên cứu ảnh hưởngcủa môi trường và chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân

nhanh giống hoàng lan thuộc chi lan Kiếm (Cymbidium) Các tác giả đã khẳng

định : môi trường nhân nhanh bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộcnhóm auxin và cytokinin có tác dụng tốt tăng hệ số nhân và chất lượng chồiđối với hai giống lan CD5 và CD9 Môi trường cho hệ số nhân và chất lượngchồi cao nhất với giống CD5 là môi trường cơ bản MS bổ sung 1mg/l BAP và0,3mg/l NAA Môi trường tốt nhất cho giống CD9 là môi trường cơ bản MS

bổ sung 1mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA

+ Môi trường tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất cho CD5 và CD9 là môitrường MS + 1g/l than hoạt tính + 0,5mg/l NAA, tạo ra số lượng rễ nhiều nhất

và chất lượng rễ tốt nhất

+ Giá thể tốt nhất để ra cây con sau giai đoạn in vitro là dớn đối với cảhai giống, tuy nhiên có thể dùng hỗn hợp dong biển và xơ dừa với tỉ lệ 1:1nhằm giảm chi phí giá thể trong nhân giống

- Năm 2016 Trịnh Thị Tuyết [13] thực hiện đề tài nghiên cứu nhân

nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoens) bằng phương pháp in vitro.

+ Công thức tốt nhất để nhân nhanh chồi lan Hài Giáp: MS cơ bản +

BA 2 mg/l + NAA 0,3 mg/l cho hệ số nhân đạt 3,16 lần Khi bổ sung 100 g/ldịch chiết chuối vào môi trường cho hệ số nhân cao nhất so với các công thứccòn lại

+ Môi trường thích hợp cho sự tạo rễ của chồi lan Hài Giáp trong ốngnghiệm là: MS cơ bản + NAA 0,4 mg/l + than hoạt tính 1 g/l

+ Giá thể thích hợp cho cây con sau in vitro là dớn + trấu hun (2:1) cho

tỷ lệ sống đạt 90,44%

- Năm 2010 Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch HồngThắm, Đỗ Thu Hà [7] Viện sinh học nông nghiệp (Trường Đại học NôngNghiệp Hà Nội) đã nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài

quý P.hanggianum Perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam Kết quả

hạt lấy từ quả 6 tháng tuổi đem khử trùng bằng cồn 700 và HgCl2 trong 5 phútrồi gieo vào môi trường MS, ½ MS, RE, V1 trong đó môi trường RE thíchhợp cho hạt nảy mầm 58-67% Môi trường nhân nhanh protocom là RE có bổsung 150ml/l nước dừa và 100g/l chuối cho hệ số nhân chồi cao nhất là 4,3lần Môi tường này cũng rất có hiệu quả để tạo chồi Môi trường ra rễ tốt nhấtkhi bổ sung NAA nồng độ 0,4-0,6ml/l, khi cây cao 3-4cm, có 3-4 lá và 4-5 rễthì đưa ra vườn ươm trồng trên giá thể dớn, chế độ dinh dưỡng NPK là(30:10:10) với lượng bón 1g/l và chế độ phun 2 lần/ tuần

- Năm 2010 Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình [8] nghiên cứu nhân giống

phong lan đuôi chồn (Rhynchotylis retunsa [L] Blume) bằng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào Các tác giả đã nghiên cứu môi trường gieo hạt và nhânchồi cho kết quả như sau: bổ sung BAP 0,3 mg/l và kinetin 0,1mg/l cho tỷ lệhạt nảy mầm cao nhất đạt 86,7%, bổ sung 0,5mg/l kinetin và 0,3mg/l BAPcho hệ số nhân chồi đạt 5-6 cụm chồi và 5-7 chồi/cụm

2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

2.4.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trìnhnuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vôtrùng

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho

việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các

bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy

mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các

phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đíchkhác nhau

2.4.2 Tính toàn năng của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó làtính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Haberlandtlần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đabào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi

tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết

và đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều cóthể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào

2.4.3 Sự phân hóa tế bào và phản phân hóa

Sự phân chia và giãn của tế bào là hai giai đoạn sinh trưởng của tếbào thực vật, trong giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng rẽ

về cấu trúc và chức năng của các tế bào gần như giống nhau

Sau đó các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa đảmnhiệm các chức năng khác nhau Các tế bào trong giai đoạn này đã có cácđặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng; ví dụ tế bào mô bì có ngấncuti hay bần, sáp… làm nhiệm vụ che chở, mô dậu có chứa lục lạp và diệplục làm nhiệm vụ quang hợp một số tế bào mất chất nguyên sinh va hóa gỗ

dể làm nhiệm vụ dẫn truyền nước và chống đỡ… thực vật có khoảng 15 môchuyên hóa khác nhau nhưng chúng đều có chung nguồn gốc từ một tế bàoban đầu phân hóa thành Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyễnhóa tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa

Sự phản phân hóa tế bào diễn ra ngược lại với sự phân háo tế bào.Các tế bào đã được phân hóa trong các mô chức năng không mất đi khảnăng phân chia cảu mình mà trong các điều kiện nhất định chúng có thểquay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo

ra tế bào mới Chẳng hạn có thể lấy một mẫu tế bào nào đó của cây (đãphân hóa) cho vào nuôi cấy trong môi trường thích hợp chúng lại phân chia

để cho ra các tế bào mới hình thành mô sẹo rồi từ đó phân hóa thành các cơquan như rễ chồi Lúc giâm cành, chiết cành từ các mô đã chuyên hóa khiđược kích thích bằng cách cắt rời khỏi cơ thể mẹ, bằng khoanh vỏ, bằng xử

lý hóa chất hay bó bầu… các tế bào đó quay trở lại phân chia mạnh mẽ đểcho ra các tế bào mới là cơ sở của rễ mới

2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.5.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tếbào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầuhết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), cáccấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thânrễ…)

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khácnhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trìnhnuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng tháisinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu,mục đích và khả năng nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phương phápphổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khảnăng tiêu diệt vi sinh vật Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảmbảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đốivới mẫu Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâmnhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất Một số hóa chất thường được sửdụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin…)

2.5.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết địnhcho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

2.5.2.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a) Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bịnhiễm Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy

b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH

- Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tốnhư: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thờigian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thờigian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinhtrưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạochồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 -

7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh

hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân

chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì

sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của môsẹo Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồnánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnhquang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm

- Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọngảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳthuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp.Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây

là 25±20C

- PH

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môitrường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào pH của đa số môi trườngđược điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agarkhó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng

2.5.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, pháttriển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môitrường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳtheo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đadạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trườngnuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng

vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinhtrưởng Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phầnxác định (amino acid, EDTA, ) và một số chất có thành phần không xácđịnh như nước dừa, dịch trích nấm men…

a) Nước

Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môitrường dinh dưỡng Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệmnghiên cứu Nếu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào haymeristem thì nên dùng nước cất 2 lần Hoàn toàn không nên sử dụng nước

máy trong nuôi cấy mô Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sửdụng nước khử ion, mặc dù nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu

cơ và các loài vi khuẩn

b) Dinh dưỡng vô cơ

Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng

đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng Theo thống nhất của Hội sinh

lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng

độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng màthực vật cần có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng.Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật.Giống như cây trồng ngoài tự nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấytrong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy

đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển Trong tự nhiên câytrồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất cácnguyên tố sau:

- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K),canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S)

- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan(Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo)

Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem làcác nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật

Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡngkhoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng Hệ rễ thực vật lấydinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mônuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bịđộng là chính Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ đượcxây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô Môi

trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy

mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũngđược thiết lập dựa trên nguyên tắc này

c) Dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…

- Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuốixanh…

d) Đường

Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinhdưỡng nuôi cấy mô thực vật Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và pháttriển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sựsinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quanghợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối)

Các mô có màu xanh cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro Mặt

khác, quá trình quang hợp cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy.Trên thực tế việc bổ sung CO2 là rất khó khăn và tốn kém

Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đườngsaccharose ở nồng độ 1-5% Đường saccharose là dạng đường được tổnghợp và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôicấy Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy môthực vật Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy

e) Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau.Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết,

nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Cácvitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin(vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol.Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trongnhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môitrường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợpamino acid

- Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phảnứng trao đổi chất

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tếbào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổihydratcacbon

f) Agar

Agar là một loại polysacharit của tảo Agar là chất keo đông thườngđược sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phứcchất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành Nồng độ củathạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất

và mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độquá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếchtán để nuôi dưỡng mô cấy Ở 800C thì ngậm nước chuyển sang trạng tháisol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khácao: 6-12 gam/lít nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vậnchuyển dễ dàng

g) Chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trìnhphát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụthuộc vào: nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin vàcytokinin, ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham giađiều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

Auxin: Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng

hợp Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA)

và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxyacetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chấtđiều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau:IAA, IBA, NAA và 2,4-D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trongquá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô.NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiênchất 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng rất nhạy đến sự phân chia

tế bào và hình thành callus

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trườngnuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cườngcác quá trình sinh tổng hợp, trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và thamgia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng

và đối tượng nuôi cấy mà tác động kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa

sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus) Nồng độ auxin thườngđược sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đốitượng nuôi cấy

Cytokinin: Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và

quyết định sự phân hóa chồi Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa

của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l

Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thànhchồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hayBenzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin(cytokinin tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùngphổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin làmột loạicytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợpđặc biệt do rất đắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một sốchất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ làmột cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh câythân gỗ

Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các

nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổnghợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển.Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinhlóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kíchthước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất.h) Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc.Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chấtphenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫunghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môitrường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinhtrưởng của rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóatốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các

chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường

2.6 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro

2.6.1 Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Có

thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như:CaOCl2, NaOCl, HgCl2,…

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệsống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả của giai đoạn này phụ thuộcvào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thườngđược chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạnthân…

Sharma G.J (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễcây địa liền và cây ngải máu Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2%trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu Dương Tấn Nhựt và

CS (2011) tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng cồn 70% trong

30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao

2.6.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này

cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinhtrưởng tốt Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sựphát triển của mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằngcác chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trườngnuôi cấy Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫuđem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinhcao hơn những mô đã chuyển hoá

2.6.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng sốlượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định vàtạo phôi vô tính Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vìthế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Đểtăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòasinh trưởng (auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa,dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thíchhợp Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường

độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta

có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhâncụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông quaviệc tạo thành cây từ phôi vô tính

2.6.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môitrường ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trởthành cây hoàn chỉnh Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trườngnuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormonthực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhómnày các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiềunhất để tạo rễ cho chồi

2.6.5 Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năngứng dụng của quá trình nhân giống invitro trong thực tiễn sản xuất Đây làgiai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàntoàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thểđạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất

2.7 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào lan Bạch Cập trên thế giới và trong nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Bạch Cập trên thế giới.

Thông thường lan có thể được nhân giống bằng tgieo trồng hạt haytách cây con đã trưởng thành từ cây mẹ Tuy nhiên các phương pháp này chohiệu quả nhân giống rất thấp nên không đáp ứng được nhu cầu của thị trường

Vì vậy phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho phép tạo ra một lượng lớn câycon trong thời gian ngắn, đáp ứng được nhu cầu của thị trường Lan Bạch Cậpphân bố chủ yếu ở Nhật bản, Trung Quốc, Việt Nam nhưng nghiên cứu vàphát triển giống cây này nhiều nhất là ở Trung Quốc nhưng chủ yếu là cácnghiên cứu về dược tính của giống lan này

Các tác dụng chữa bệnh của loai lan này được phát hiện và sử dụng từrất sớm, được nhắc tới rất nhiều trong các bài thuốc cổ truyền của trung quốcphải kể tới là “ Sổ tay lầm sàng trung dược”, “ Lâm sàng thường dụng trungdược thủ sách”

Năm 2006, Hunming Wang, Jiantao Sun, Yi Luo, Weihua Xue, HuajiaDiao, Lei Dong, Jiangning Chen & Junfeng Zhang đã thực hiện tách chiết mộtPolysaccharide có tên là BSP Polysaccharide này có tác dụng làm cho tăngsinh tế bào nội mô mạch máu được biểu hiện trong điều kiện in vitro [13]

Năm 2008, Diao H và các cộng sự nghiên cứu thành công cơ chế chữalành vết thương của chất Bletilla striata polysaccharide được phân lập từBletilla Striata [18]

Năm 2010, Xiang-gen Wu, Meng Xin, Hao Chen, Li-na Yang, ran Jiang đã nghiên cứu và thử nghiệm Polysaccharide mucoadhesive tiểuđơn phân lập từ Bletilla striata cải thiện sự thâm nhập nội nhãn và hiệu quảcủa levofloxacin trong điều trị tại chỗ viêm nhiễm vi khuẩn thực nghiệm thửnghiệm [20]

Năm 2014, QiangPeng, MingLi, FengXue, HuajingLiu đã nghiên cứu

và phát hiện cấu trúc, chức năng của một polysaccharide mới được phân lập

từ củ của Bletilla striata có tên gọi là BSPF2 [19]

2.7.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Bạch Cập trong nước

Mô tả: Cây thảo nhiều năm mọc đứng cao 20-30cm Hành giả hình củ,

xếp thành chuỗi nằm ngang màu trắng ngà có những đường vòng màu nâunhỏ do các vết tích của lá cũ và những mầm thân non đang phát triển Mỗinhánh mang 4-5 lá hình mác, có những nếp nhăn dọc, xếp ôm nhau ở góckhông có cuống Hoa 3-8 cái màu hồng tím khá to, mọc thành chùm ở ngọn;cánh môi màu tím đậm mang 5-7 mào uốn lượn Quả nang hình thoi 6 cạnh.Mùa hoa từ tháng 3 tới tháng 5, mùa quả từ tháng 7 tới tháng 9

Nơi sống và thu hái: Cây mọc trên đất rừng, đất đồi, rừng thứ sinh,

vùng núi Tây Bắc, Lào Cai, Hà Giang, Vĩnh Phú, Lạng Sơn Cũng thườngđược trồng làm cảnh, trồng bằng thân rễ Củ thu hái vào tháng 8-9, phơi khô,thường có màu trắng vàng, dỏng nhu con ốc dẹt trong có nhiều chất dính

Tại Việt Nam hiện nay việc nhân giống lan Bạch Cập chủ yếu từphương pháp tách chồi truyền thống và chưa có báo cáo nào về việc áp dụngphương pháp nuôi cấy mô trong nhân giống loài lan này

Hiện nay việc sử dụng vị thuốc Bạch Cập chủ yếu dựa trên các tài liệu

y học của Trung Quốc bên đó tại Việt Nam cũng có một vài nghiên cứu vềdược tính của vị thuốc Bạch Cập

Năm 2013, tác giả Lương Quang Anh đã nghiên cứu thành phần hóahọc và tác dụng kháng khuẩn invitro của vị thuốc Bạch Cập kết quả bước đầucho thấy: trong Bạch Cập có chứa chất nhầy, tinh dầu, flavonoid, phytosterol

và đường khử; xác định được flavonoid thuộc phân nhóm flavan bằng phổ tửngoại với pick đặc trưng là lmax bằng 277,5nm; dịch chiết nước (3/1), BạchCập có tác dụng khá mạnh đối với E.coli với MIC bằng 1/16, MBC bằng 1/8

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Bạch Cập được cung cấp bởi phòngthí nghiệm nuôi cây mô tế bào thực vật khoa CNSH – CNTP

- Vật liệu nghiên cứu: quả lan Bạch Cập

- Môi trường MS, đường sacharose, agar, than hoạt tính…

- Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, nhómcytokinin

3.3 Địa điểm và thời gian tiến hành

- Địa điểm: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô tế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trườngĐại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian tiến hành: thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2017 đếntháng 5/2018

3.4 Nội dung nghiên cứu

3.4.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl 2 tới khả năng tạo vật liệu vô trùng

CT1: Quả + HgCl2 0,1% ngâm trong 5 phút

CT2: Quả + HgCl2 0,1% ngâm trong 10 phút

CT3: Quả + HgCl2 0,1% ngâm trong 15 phút

CT4: Quả + HgCl2 0,15% ngâm trong 5 phút

CT5: Quả + HgCl2 0,15% ngâm trong 10 phút

CT6: Quả + HgCl2 0,15% ngâm trong 15 phút

CT7: Quả + HgCl2 0,2% ngâm trong 5 phút

CT8: Quả + HgCl2 0,2% ngâm trong 10 phút

CT9: Quả + HgCl2 0,2% ngâm trong 15 phút

3.4.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng này mầm của hạt.

CT1 (đ/c): môi trường thạch

CT2: MS + 30g/l đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính

CT3: ½ MS + 30g/l đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính

CT4: ¼ MS + 30g/l đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính

CT5: KC + 30g/l đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính

CT6:½ KC + 30g/l đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính

CT7: ¼ KC + 30g/l đường + 1g/l pepton + 1g/l than hoạt tính