Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật – Khoa Sinh – Kĩ , Trường Đại học Sư phạm- Thái Nguyên, từ tháng 6/2013 đến tháng 6/2014.
2.2. P
2.2.1. Giai đoạn tạo mẫu vô trùng
2.2.1.1.Phương pháp khử trùng
Hạt Ban còn nguyên vẹn sau khi thu hái về được rửa sạch bằng dung dịch xà phòng loãng (khoảng 5%), tráng sạch bằng nước máy rồi dùng bông lau sạch bên ngoài và đưa vào tủ cấy vô trùng. Khử trùng trong tủ cấy vô trùng:
Khử trùng bằng hóa chất: sử dụng dung dịch NaOCl (nước Javen thương phẩm chứa 5% NaOCl) với nồng độ khác nhau và được bổ sung 1 – 2 giọt tween (làm giảm sức căng bề mặt). Hạt Ban được ngập hoàn toàn trong dung dịch NaOCl. Khử trùng trong bình tam giác 500ml đã được hấp vô trùng, thường xuyên lắc đều bình tam giác đến hết thời gian khử trùng, sau đó tiến hành rửa hạt bằng nước cất và tiến hành tách lớp vở bên ngoài lấy phôi đem gieo vào bình môi trường đã được hấp vô trùng.
Hạt Ban được gieo vào các bình môi trường hình tam giác 250 ml. Nuôi cấy trong phòng nuôi cây của .
2.2.1.2. Phương pháp theo dõi:
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Số mẫu nhiễm (mẫu) x 100% Tổng số mẫu (mẫu)
Tỷ lệ mẫu không nhiễm (%) =
Số mẫu không nhiễm(mẫu)
x 100% Tổng số mẫu (mẫu)
Mẫu sống không nhiễm = Tổng số mẫu không nhiễm - Tổng số mẫu không nhiễm bị chết.
Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu chết (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Tỷ lệ mẫu không nhiễm - Tỷ lệ mẫu chết - Đánh giá cảm quan chất lượng hạt (sau 45 ngày)
+ Hạt tốt: hạt lên có mầu xanh, nảy mầm đều, khỏe
+ Hạt trung bình: có mầu xanh, khỏe, không nảy mầm đều + Hạt kém: nẩy mầm ít, có màu nâu nhạt
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng tới hiệu quả khử trùng hạt Ban.
Thí nghiệm gồm 4 công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại sử dụng 9 hạt Ban gieo vào 3 bình môi trường MS có bổ sung agar 8 g/l, đường 30g/l.
+ CT1: (Đ/C) Chỉ rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy + CT2: Ngâm trong dung dịch Javen 10%
+ CT3: Ngâm trong dung dịch Javen 30% + CT4: Ngâm trong dung dịch Javen 50%
Thời gian khử trùng 20 phút. - Theo dõi sau 10 ngày. - Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) + Tỷ lệ mẫu sống (%)
2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh
Phương pháp nhân nhanh:
Sử dụng môi trường nền: MS , bổ sung agar 7 g/l, đường saccarose 30g/l.
Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy: 5,8 - 6,0.
Thể tích dung dịch dinh dưỡng trong bình nuôi cấy là 50 – 70 ml/ bình.
Phương pháp theo dõi:
Hệ số nhân chồi (%) =
Số chồi bật (chồi)
x 100% Số chồi cấy (chồi)
Đánh giá chất lượng chồi bật:
Chồi tốt: chồi khỏe, mập, cao, hình thái bình thường, không dị dạng. Chồi trung bình: chồi sinh trưởng bình thường
Chồi yếu: chồi bị dị dạng, sinh trưởng kém.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến quá trình nhân nhanh và chất lượng của chồi Ban
* Kiểu I: Sử dụng vật liệu là chồi Ban lấy từ cây ban nuôi cấy mô (lấy từ hạt đã khử trùng và đem nuôi cấy ở thí nghiệm 1).
Cách bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là ba bình, mỗi bình cấy 3 chồi. Môi trường nền (MT nền): MS bổ sung đường 30 g/l, agar 7 g/l.
Chất điều tiết sinh trưởng: kinitin (K) được bố trí thành một dải nồng độ trên 6 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 3 bình nuôi cấy đã vô trùng. nghiệm: + CT1: MT nền ( Đ/C) + CT2: MT nền + 0,1 mg K/l + CT3: MT nền + 0,2 mg K/l + CT4: MT nền + 0,3 mg K/l + CT5: MT nền + 0,4 mg K/l + CT6: MT nền + 0,5 mg K/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: + Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình nhân và chất lượng của chồi Ban.
Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 3 bình, mỗi bình cấy 3 chồi.
Công thức thí nghiệm: + CT1: MT nền + CT2: MT nền + BAP 0,1 mg/l + CT3: MT nền + BAP 0,2 mg/l + CT4: MT nền + BAP 0,3 mg/l + CT5: MT nền + BAP 0,4 mg/l + CT6: MT nền + BAP 0,5 mg/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: + Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
* Kiểu II: Sử dụng vật liệu nghiên cứu là 2 lá mầm của hạt hoa ban sau 7 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi bật của nách lá mầm hạt Ban.
Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là ba bình, mỗi bình cấy 3 chồi. Môi trường nền: MS bổ sung đường 30 g/l, agar 7 g/l, than hoạt tính (THT) 1 g/l.
- Chất điều tiết sinh trưởng: Kinetin được bố trí thành một dải nồng độ trên 6 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 3 bình nuôi cấy đã vô trùng.
Công thức thì nghiệm:
+ CT2: MT nền + 0,1 mg K/l + CT3: MT nền + 0,2 mg K/l + CT4: MT nền + 0,3 mg K/l + CT5: MT nền + 0,4 mg K/l + CT6: MT nền + 0,5 mg K/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: + Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân
nhanh và chất lượng chồi bật từ nách lá mầm hạt Ban.
Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 3 bình, mỗi bình cấy 3 chồi.
- Môi trường nền (MT nền): MS + đường 30 g/l, agar 7 g/l, THT 1 g/l. Công thức thí nghiệm: + CT1: MT nền + CT2: MT nền + 0,1 mg BA/l + CT3: MT nền + 0,2 mg BA/l + CT4: MT nền + 0,3 mg BA/l + CT5: MT nền + 0,4 mg BA/l + CT6: MT nền + 0,5 mg BA/l - Theo dõi sau 45 ngày
+ Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
2.2.3. Giai đoạn cây hoàn chỉnh
Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh:
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được cấy chuyển từ môi trường ở giai đoạn nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài và chất lượng của chồi Ban.
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 1 bình, mỗi bình cấy 2 chồi.
- Môi trường nền (MT nền): MS + đường 30 g/l, agar 7 g/l, THT 1 g/l. Công thức thí nghiệm: + CT1: MT nền + CT2: MT nền + 0,1 mg GA3/l + CT3: MT nền + 0,2 mg GA3/l + CT4: MT nền + 0,3 mg GA3/l + CT5: MT nền + 0,4 mg GA3/l + CT6: MT nền + 0,5 mg GA3/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Chiều dài chồi (centimet)
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ của chồi Ban (45 ngày tuổi tính từ khi nuôi cấy)
Công thức thí nghiệm: + CT1: MT nền + CT2: MT nền + NAA 0,2 mg/l + CT3: MT nền + NAA 0,4 mg/l + CT4: MT nền + NAA 0,6 mg/l + CT5: MT nền + NAA 0,8 mg/l + CT6: MT nền + NAA 1,0 mg/l Cách bố trí thí nghiệm:
- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lân nhắc lại 5 mẫu/CT. Môi trường nền (MT nền): MS + đường 30 g/l, agar 7 g/l, THT 1 g/l.
- Chất điều tiết sinh trưởng: NAA được bố trí trên 6 công thức thí nghiệm. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần nhắc lại bố trí 3 bình, mỗi bình cấy 3 chồi.
- Theo dõi sau 45 ngày Chỉ tiêu theo dõi: + Số chồi tạo rễ (chồi) + Chiều dài rễ (centimet)
+ Chất lượng rễ (tốt, trung bình, yếu) Đánh giá chất lượng rễ:
- Rễ tốt: rễ to, dài, khỏe, có nhiều mầm lông hút hoặc lông hút. - Rễ trung bình: rễ bình thường, không nhìn rõ tầng lông hút. - Rễ kém: rễ dị dạng, ít hoặc chưa có lông hút.
Việc chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện tự nhiên bên ngoài vườn ươm là một giai đoạn rất quan trọng. Trong giai đoạn này, sự thay đổi đột ngột của điều kiện sống, từ môi trường dị dưỡng ra môi trường tự dưỡng hoàn toàn đòi hỏi cây phải có quá trình thích nghi. Sự thành công của giai đoạn này góp phần quan trọng cho sự thành công của phương pháp nhân giống.
Nhu cầu phù hợp về độ ẩm trong quá trình cây thích nghi với môi trường sống ngoài tự nhiên là rất cần thiết. Do đó để cho cây Ban con có quá trình thích nghi tốt cần được luyện cây trước khi đưa ra giá thể phù hợp.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây Ban con.
Cách bố trí thí nghiệm:
Cây tạo thành sau quá trình nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS được chuyển ra vườn ươm. Lựa chọn các cây in vitro có từ 4-5 lá, khỏe, không dị tật để triến hành thí nghiệm. Cây được theo dõi để duy trì độ ẩm phù hợp, tránh không để cây trong tình trạnh khô hạn hoặc ngập úng.
Thí nghiệm gồm 3 công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 10 cây Ban nuôi cấy mô.
Công thức thí nghiệm: CT1: Đất đồi
CT2: Đất ruộng CT3: Cát
Chăm sóc cho toàn thí nghiệm:
- Xếp cây Ban lên giàn cao 1 m, tưới nước giữ ẩm một lần/ngày vào chiều mát.
- Phòng trừ sâu bệnh: cắt bỏ phần lá bị bệnh, phun thuốc diệt nấm - Theo dõi sau 35 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi + Tỷ lệ sống (%)
+ Chất lượng cây con (tình trạng, màu sắc) Phương pháp theo dõi
Tỷ lệ sống (%) = Số cây sống x 100% Tổng số cây ban đầu
Đánh giá chất lượng cây:
- Cây tốt: cây khỏe, lá xanh, rễ không bị hỏng.
- Cây trung bình: cây khỏe, lá hơi úa vàng, rễ ít phát triển. - Cây yếu: cây yếu còi cọc, lá úa, rễ kém.
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel và chương trình xử lý số liệu nông học Irristat.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.
Khử trùng vật liệu cấy là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro [1]. Phương pháp dùng chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn được lựa chọn để nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố này đến khả năng khử trùng h t Ban. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1. nh hƣởng của nồng độ lệ tạo mẫu sạch
nấm, vi khuẩn sau 15 ngày nuôi cấy
Công thức Nồng độ dung dịch Javen (%) Tổng số bình nuôi cấy (bình) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ không nhiễm (%) CT1 0 9 27 100,00 0,00 0,00 CT2 10 9 27 76,54 0,00 23,45 CT3 30 9 27 12,34 11,10 76,54 CT4 50 9 27 2,46 32,09 65,43
Khi sử dụng dung dịch javen khử trùng, dung dịch tác động làm diệt nấm, khuẩn bên ngoài lớp vỏ, vỏ bảo vệ hạt không bị ảnh hưởng bởi dung dịch khử trùng, do đó hạt Ban không nhiễm có tỷ lệ sống gần như hoàn toàn. Phương pháp khử trùng bằng hóa chất nhiều công đoạn, thực hiện nhiều thao tác nên khả năng nhiễm do kỹ thuật thao tác lớn.
Theo bảng 3.1 Nồng độ javen có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả khử trùng hạt Ban. Kết quả cho thấy nồng độ javen ở công thức 3 cho hiệu quả khử trùng cao nhất với tỷ lệ không nhiễm đạt 76,54%. Mặc dù ở công thức 4 tỷ lệ mẫu nhiễm có nhỏ hơn so với công thức 3 nhưng tỷ lệ mẫu chết lại cao hơn, nguyên nhân là do nồng độ javen ở công thức 4 cao (50%) đã ảnh hưởng tới sự nảy mầm của hạt Ban.
Kết quả cho thấy, khi khử trùng bằng javen ở các nồng độ từ 30% đến 50% đều cho hiệu quả khử trùng tương đối tốt. Nhưng trong thí nghiệm, CT 3 với nồng độ javen 30% cho kết quả cây sống không nghiễm cao hơn CT 4 có nồng độ javen là 50%. Sau 20 ngày nuôi cấy đã thu được cây Ban nảy mầm từ hạt ban đã khử trùng, các chồi non được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo .
IN VITRO CÂY BAN 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của kinetin
non cây Ban
Các hợp chất thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào thực vật, làm tăng diện tích phiến lá. Khi hệ lá Ban phát triển, cây chuyển ra vườn ươm sẽ thực hiện tốt quá trình quang hợp và đủ trưởng thành để thích nghi với điều kiện sống mới. Ngoài ra trong nhân giống vô tính thì cytokinin tác dụng tăng sự phân hoá chồi .
Kinetin và BAP là chất thuộc nhóm cytokinin đã được lựa chọn để thực hiện thí nghiệm về sự ảnh hưởng độc lập của các chất này lên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi. giá kết quả dựa trên các chỉ tiêu về hệ số nhân và chất lượng chồi trên môi trường MS có bổ sung đường 30 g/l , agar 7 g/l , kinetin 0 – 0,5 mg/l, kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả ảnh hƣởng của kinetin đến hệ số nhân chất lƣợng chồi Ban sau 45 ngày
Công thức Hàm lƣợng kinetin (mg/l) Số cấy (chồi) Số chồi thu đƣợc (chồi) Hệ số nhân chồi (lần) Chất lƣợng chồi CT1 (Đ/C) 0,0 5 15 1,04 ++ CT2 0,1 5 16 1,09 ++ CT3 0,2 5 18 1,22 ++ CT4 0,3 5 22 1,49 ++ CT5 0,4 5 25 1,71 ++ CT6 0,5 5 23 1,58 ++
Ghi chú: (+): chồi yếu ; (++): chồi trung bình ; (+++): chồi tốt
K 3.2 cho thấy khi bổ sung kinetin với hàm lượng khác nhau (0 – 0,5 mg K/l) cho hệ số nhân chồi không lớn, hệ số nhân giữa các công thức không có sự sai khác rõ rệt. Kết quả thí nghiệm cho biết, trong thí nghiệm, khi bổ sung kinetin với hàm lượng khác nhau cho hệ số nhân chồi không được cao, bổ sung kinetin với hàm lượng 0,4 mg/l cho hệ số nhân cao nhất là 1,71 lần với chất lượng chồi ở mức trung bình.
Theo quan sát và đánh giá cảm quan theo chỉ tiêu phân loại chất lượng chồi nhận thấy, chất lượng chồi bật khi sử dụng chất kích thích sinh trưởng kinetin không có sự khác biệt giữa các công thức.
c , kinetin ít ảnh hưởng tới hệ số nhân và chất
lượng chồi cây Ban in vitro .
ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng