Nuôi cấy mô tế bào đã được thí nghiệm ở thế kỷ XVII nhưng chỉ thành công sau những sưu tầm về môi trường nuôi cấy của White và Gautheret [13].
Trung Quốc là một nước thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ được nuôi cấy như: Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (cây Hông)... Là một trong những nước ứng dụng sớm và thành công nuôi cấy mô tế bào vào trồng rừng trên diện rộng. Đến nắm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, người ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và dòng lai được chọn lọc. Những cây mô này được dùng như là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn ươm địa phương và dùng thẳng vào trồng rừng [25].
Hiên nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng dòng vô tính. Một số loài thông đã được nuôi cấy thành công đó là: Pinus nigra, P. Caribeea, P. Pinaster... Có tới 30 loài trong số loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt được những thành công bước đầu, trong
đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh... Trong số 30 loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô, có 4 loài được đưa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempviriens) ở Pháp, Thông P. Radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. Taera và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [25].
Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao > 0,5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% [17].
Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng [25].
Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona grandis). Gupta và cs (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm. Perhtani đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử [10].
Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung quốc, các loài Bạch đàn ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Văn sam (Picea), Thông Ridiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribe (Pinus caribaea) và Thông lai [27].
Nitiwattanachai đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) + 10 µM BAP + 0,5 µM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) + 2 µM IBA + 1 µM NAA [25].
Cùng với cây Keo tai tượng, Hartney và cs (thuộc Division of Forest Research) đã sản suất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là WPM +3% Sucrose + 0,8 agar + 1 µM BAP + 1 µM NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250
C (± 40C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút [25].
1.3.2. Nhân giống cây thân gỗ bằng phƣơng pháp in vitro ở Việt Nam.
Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phú Ninh Phú Thọ, Công ty giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp… Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu.
Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và Keo lai có năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Keo lai, Bạch đàn và một số cây rừng khác [10]
Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô Keo lai đã được giới thiệu khi tổng kết đề tài KH03.03 năm 1996 (Lê Đ nh Khả, 1996) trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu của Nguy n Ngọc Tân và cs (1996), Đoàn Thị Mai và cs đã
thực hiện nghiên cứu bổ sung cho một số dòng Keo lai đã được đánh giá và thu được một số kết quả như sau: khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 8 – 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nẩy chồi là BAP (2ppm) và BAP (2ppm) + Kn (0,5 ppm) và môi trường MS là công thức cho mẫu vật đẻ chồi nhiều nhất. Ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là: IBA (3ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80 – 92%) đối với BV10, BV29, BV32, BV33. Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV16 (65%), BV5 (50%) [16].
Dương Mộng Hùng tại trường Đại học Lâm nghiệp đã nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài Bạch đàn E. camaldulensis và E. uronphylla
từ cây trội của 2 loài đã được một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1- 2 lần [7].
Đoàn Thị Mai và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống Bạch đàn lai U19C23. Kết quả cho thấy thời kì mẫu bị nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5 – 8. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm). Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8% [16].
Mai Đình Hồng (1995) đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây bạch đàn dòng U6 là: môi trường nhân chồi (MS +3% đường + 4,5% agar + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trường tạo rễ (1/4 MS + 1,5% đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA) [16].
Đoàn Thị Nga, thuộc viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh – Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng PN2. Tác giả cho rằng, môi trường thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA. Môi trường ra rễ tối ưu là 1/4 MS + 1 mg/l IBA [7].
Đoàn Thị Mai đã đề xuất môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng UE35 với chất khử trùng thích hợp là chất kháng sinh với nồng độ 4,5 mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian là 12 phút. Môi trường là MS + BAP 0,5 mg/l + NAA 0,3 mg/l + các phụ gia khác [16].
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. V
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Hạt Ban (4 tháng kể từ ngày thụ phấn), hạt tốt, chắc, mẩy, không dị tật, có đường kính từ 4 – 5 mm thu từ cây Ban
.
ng MS, bổ sung agar 7g/l, đường
saccarose 30 g/l, .
Chồi non cây Ban sinh trưởng tốt, không sâu bệnh được
20 ngày tuổi,. Chồi được cắt bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá. Mẫu có chiều dài từ 1,5 – 3 cm, đường kính từ 2 – 3 mm mang 1 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 – 6.
2.1.2.
Hóa chất:
- Hóa chất khử trùng: Javen thương phẩm (chứa 0,5% NAOCl)
- Môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), bổ sung agar 7g/l, đường saccarose 30 g/l.
- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin, chất hữu cơ tự nhiên, than hoạt tính bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm.
: - Máy đo pH. - Máy khuấy từ. - Cân phân tích. - Bếp điện. - Lò vi sóng.
- Máy cất nước. - Tủ sấy.
- Nồi hấp vô trùng. - Tủ cấy vô trùng.
2.1.3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu phương pháp tạo vật liệu vô trùng, khả năng tái sinh, khả năng nhân nhanh và ra rễ của hoa ban bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2.1.4. Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu
Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật – Khoa Sinh – Kĩ , Trường Đại học Sư phạm- Thái Nguyên, từ tháng 6/2013 đến tháng 6/2014.
2.2. P
2.2.1. Giai đoạn tạo mẫu vô trùng
2.2.1.1.Phương pháp khử trùng
Hạt Ban còn nguyên vẹn sau khi thu hái về được rửa sạch bằng dung dịch xà phòng loãng (khoảng 5%), tráng sạch bằng nước máy rồi dùng bông lau sạch bên ngoài và đưa vào tủ cấy vô trùng. Khử trùng trong tủ cấy vô trùng:
Khử trùng bằng hóa chất: sử dụng dung dịch NaOCl (nước Javen thương phẩm chứa 5% NaOCl) với nồng độ khác nhau và được bổ sung 1 – 2 giọt tween (làm giảm sức căng bề mặt). Hạt Ban được ngập hoàn toàn trong dung dịch NaOCl. Khử trùng trong bình tam giác 500ml đã được hấp vô trùng, thường xuyên lắc đều bình tam giác đến hết thời gian khử trùng, sau đó tiến hành rửa hạt bằng nước cất và tiến hành tách lớp vở bên ngoài lấy phôi đem gieo vào bình môi trường đã được hấp vô trùng.
Hạt Ban được gieo vào các bình môi trường hình tam giác 250 ml. Nuôi cấy trong phòng nuôi cây của .
2.2.1.2. Phương pháp theo dõi:
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Số mẫu nhiễm (mẫu) x 100% Tổng số mẫu (mẫu)
Tỷ lệ mẫu không nhiễm (%) =
Số mẫu không nhiễm(mẫu)
x 100% Tổng số mẫu (mẫu)
Mẫu sống không nhiễm = Tổng số mẫu không nhiễm - Tổng số mẫu không nhiễm bị chết.
Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu chết (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Tỷ lệ mẫu không nhiễm - Tỷ lệ mẫu chết - Đánh giá cảm quan chất lượng hạt (sau 45 ngày)
+ Hạt tốt: hạt lên có mầu xanh, nảy mầm đều, khỏe
+ Hạt trung bình: có mầu xanh, khỏe, không nảy mầm đều + Hạt kém: nẩy mầm ít, có màu nâu nhạt
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng tới hiệu quả khử trùng hạt Ban.
Thí nghiệm gồm 4 công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại sử dụng 9 hạt Ban gieo vào 3 bình môi trường MS có bổ sung agar 8 g/l, đường 30g/l.
+ CT1: (Đ/C) Chỉ rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy + CT2: Ngâm trong dung dịch Javen 10%
+ CT3: Ngâm trong dung dịch Javen 30% + CT4: Ngâm trong dung dịch Javen 50%
Thời gian khử trùng 20 phút. - Theo dõi sau 10 ngày. - Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) + Tỷ lệ mẫu sống (%)
2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh
Phương pháp nhân nhanh:
Sử dụng môi trường nền: MS , bổ sung agar 7 g/l, đường saccarose 30g/l.
Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy: 5,8 - 6,0.
Thể tích dung dịch dinh dưỡng trong bình nuôi cấy là 50 – 70 ml/ bình.
Phương pháp theo dõi:
Hệ số nhân chồi (%) =
Số chồi bật (chồi)
x 100% Số chồi cấy (chồi)
Đánh giá chất lượng chồi bật:
Chồi tốt: chồi khỏe, mập, cao, hình thái bình thường, không dị dạng. Chồi trung bình: chồi sinh trưởng bình thường
Chồi yếu: chồi bị dị dạng, sinh trưởng kém.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến quá trình nhân nhanh và chất lượng của chồi Ban
* Kiểu I: Sử dụng vật liệu là chồi Ban lấy từ cây ban nuôi cấy mô (lấy từ hạt đã khử trùng và đem nuôi cấy ở thí nghiệm 1).
Cách bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là ba bình, mỗi bình cấy 3 chồi. Môi trường nền (MT nền): MS bổ sung đường 30 g/l, agar 7 g/l.
Chất điều tiết sinh trưởng: kinitin (K) được bố trí thành một dải nồng độ trên 6 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 3 bình nuôi cấy đã vô trùng. nghiệm: + CT1: MT nền ( Đ/C) + CT2: MT nền + 0,1 mg K/l + CT3: MT nền + 0,2 mg K/l + CT4: MT nền + 0,3 mg K/l + CT5: MT nền + 0,4 mg K/l + CT6: MT nền + 0,5 mg K/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: + Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình nhân và chất lượng của chồi Ban.
Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 3 bình, mỗi bình cấy 3 chồi.
Công thức thí nghiệm: + CT1: MT nền + CT2: MT nền + BAP 0,1 mg/l + CT3: MT nền + BAP 0,2 mg/l + CT4: MT nền + BAP 0,3 mg/l + CT5: MT nền + BAP 0,4 mg/l + CT6: MT nền + BAP 0,5 mg/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: + Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
* Kiểu II: Sử dụng vật liệu nghiên cứu là 2 lá mầm của hạt hoa ban sau 7 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi bật của nách lá mầm hạt Ban.
Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là ba bình, mỗi bình cấy 3 chồi. Môi trường nền: MS bổ sung đường 30 g/l, agar 7 g/l, than hoạt tính (THT) 1 g/l.
- Chất điều tiết sinh trưởng: Kinetin được bố trí thành một dải nồng độ trên 6 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 3 bình nuôi cấy đã vô trùng.
Công thức thì nghiệm:
+ CT2: MT nền + 0,1 mg K/l + CT3: MT nền + 0,2 mg K/l + CT4: MT nền + 0,3 mg K/l + CT5: MT nền + 0,4 mg K/l + CT6: MT nền + 0,5 mg K/l - Theo dõi sau 45 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: + Số lượng (chồi)
+ Chất lượng chồi (tốt, trung bình, yếu)
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân
nhanh và chất lượng chồi bật từ nách lá mầm hạt Ban.
Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 6 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 3 bình, mỗi bình cấy 3 chồi.
- Môi trường nền (MT nền): MS + đường 30 g/l, agar 7 g/l, THT 1 g/l. Công thức thí nghiệm: + CT1: MT nền + CT2: MT nền + 0,1 mg BA/l + CT3: MT nền + 0,2 mg BA/l + CT4: MT nền + 0,3 mg BA/l + CT5: MT nền + 0,4 mg BA/l + CT6: MT nền + 0,5 mg BA/l - Theo dõi sau 45 ngày