Nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro cây lan hài hồng (paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí hiếm của việt nam

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Lê Quang Luân, người không hướng dẫn em bước đầu đường nghiên cứu khoa học mà cịn dìu dắt em ngưỡng cửa bước vào đời Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu q thầy trường Đại học Nha Trang, đặc biệt thầy cô khoa Chế biến dạy dỗ em suốt thời gian vừa qua Xin cảm ơn cô Hà, cô Nụ chị Vang Phịng Sinh học ln quan tâm, bảo giúp đỡ thời gian làm luận văn tốt nghiệp Xin cảm ơn tập thể lớp 45SH, cảm ơn người bạn sánh bước giảng đường đại học Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình người thân yêu ni dưỡng, u thương, quan tâm chăm sóc người Tp Hồ Chí Minh, ngày 30/10/2007 Sinh viên thực Hồ Ngọc Văn MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ảnh Lời mở đầu Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Khái quát phương pháp vi nhân giống 1.1.1 Khái niệm phương pháp nhân giống in vitro 1.1.2 Môi trường nuôi cấy 1.1.2.1 Các muối khoáng đa lượng 1.1.2.2 Các muối khoáng vi lượng 1.1.2.3 Các vitamin 1.1.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 1.1.2.5 Các chất bổ sung 1.1.3 Những vấn đề thường găp nhân giống in vitro 1.1.3.1 Tính bất định mặt di truyền 1.1.3.2 Sự nhiễm mẫu 10 1.1.3.3 Sự hóa thủy tinh thể 10 1.1.3.4 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu 10 1.1.4 Các ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô 11 1.1.4.1 Ưu điểm 11 1.1.4.2 Nhược điểm 12 1.1.5 Các ứng dụng nuôi cấy in vitro nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp 12 1.1.5.1 Vi nhân giống 12 1.1.5.2 Sản xuất bảo quản giống bệnh 13 1.1.5.3 Bảo quản giống in vitro 13 1.1.5.4 Biến dị tế bào soma 13 1.1.5.5 Lai đơn bội 13 1.2 Khái quát Lan hài 13 1.2.1 Giới thiệu họ Lan 13 1.2.2 Giới thiệu Lan hài 14 1.2.2.1 Nguồn gốc quan hệ họ hàng Lan hài 15 1.2.2.2 Hình thái Lan hài 15 1.2.2.3 Vòng đời 18 1.2.2.4 Sinh thái 19 1.2.2.5 Phân bố địa lý 20 1.2.2.6 Hiện trạng Lan hài Việt Nam 21 1.2.3 Giới thiệu vài loài Lan hài đặc hữu Việt Nam 24 1.2.3.1 Paphiopedilum vietnamense 24 1.2.3.2 Paphiopedilum helenae 25 1.2.3.3 Paphiopedilum villosum 26 1.2.3.4 Paphiopedilum hangianum 27 1.2.3.5 Vài nét Lan hài hồng 28 Chương Vật liệu phương pháp 34 2.1 Vật liệu 34 2.1.1 Mẫu cấy 34 2.1.2 Địa điểm thực đề tài 34 2.1.3 Phịng thí nghiệm dụng cụ 34 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 35 2.1.5 Điều kiện nuôi cấy 35 2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 35 2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 35 2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường MS, VW KC kết hợp với IBA đến khả nẩy mầm hạt hài hồng 37 2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp chất ĐHST 2,4D TDZ đến khả tạo callus Lan hài hồng 38 2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng chất ĐHST 2,4D, BA, NAA TDZ đến khả nhân nhanh PLB Lan hài hồng 40 2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng chất ĐHST BA, TDZ NAA đến trình nhân nhanh chồi Lan hài hồng 41 2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường khác đến khả tái sinh hoàn chỉnh Lan hài hồng 42 2.2.7 Xử lí thống kê số liệu 43 Chương Kết thảo luận 44 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 44 3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng loại môi trường MS, VW KC kết hợp với IBA đến khả nẩy mầm hạt hài hồng 47 3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng kết hợp chất ĐHST 2,4D TDZ đến khả tạo callus Lan hài hồng 49 3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng loại ĐHST thực vật 2,4D, BA, NAA TDZ đến khả nhân nhanh PLB Lan hài hồng 51 3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất ĐHST BA, TDZ NAA đến trình nhân nhanh chồi Lan hài hồng 53 3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng loại môi trường khác đến khả tái sinh hoàn chỉnh Lan hài 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 57 Kiến nghị 58 Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm Lan hài Việt Nam xếp theo thứ hạng bảo tồn IUCN .22 Bảng 2.1 Nghiệm thức khử trùng đỉnh sinh trưởng Lan hài hồng 36 Bảng 2.2 Nghiệm thức khử trùng mẫu cành phát hoa Lan hài hồng 36 Bảng 2.3 Nghiệm thức khử trùng trái Lan hài hồng dùng Ca(Ocl)2 37 Bảng 2.4 Nghiệm thức ảnh hưởng loại môi trường khác đến khả nẩy mầm hạt hài hồng 38 Bảng 2.5 Nghiệm thức ảnh hưởng phối hợp chất ĐHST đến khả tạo callus Lan hài hồng 39 Bảng 2.6 Nghiệm thức ảnh hưởng loại ĐHST đến khả nhân nhanh PLB Lan hài hồng 40 Bảng 2.7 Nghiệm thức ảnh hưởng loại ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Lan hài hồng 41 Bảng 2.8 Nghiệm thức loại môi trường ảnh hưởng đến khả tái sinh Lan hài hồng 42 Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng Lan hài hồng sau khử trùng 44 Bảng 3.2 Tình trạng mẫu cành phát hoa Lan hài hồng sau khử trùng nuôi cấy tuần 45 Bảng 3.3 Tình trạng mẫu trái Lan hài hồng qua khử trùng gieo hạt sau 10 tuần 46 Bảng 3.4 Kết ảnh hưởng loại môi trường khác đến khả nẩy mầm hạt hài hồng 48 Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng chất ĐHST ảnh hưởng đến khả tạo callus Lan hài hồng 50 Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng loại ĐHST đến khả nhân nhanh PLB Lan hài hồng 52 Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng loại ĐHST đến khả nhân chồi Lan hài hồng 54 Bảng 3.8 Kết ảnh hưởng loại môi trường đến khả tái sinh Lan hài .56 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học auxin Hình 1.2 Cấu trúc hóa học cytokinin Hình 1.3 Nữ hài hiệp – Loài Lan hài bị tuyệt chủng 23 Hình 1.4 Hoa Paphiopedilum vietnamense 24 Hình 1.5 Hoa Paphiopedilum helenae 25 Hình 1.6 Hoa Paphiopedilum villosum .26 Hình 1.7 Hoa Paphiopedilum hangianum 27 Hình 1.8 Cây hoa Lan hài hồng .28 Hình 1.9 Hình thái Lan hài 29 Hình 1.10 Hoa Paphiopedilum ngồi tự nhiên 30 Hình 2.1 Hoa Lan hài hồng 34 Hình 3.1 Mẫu Lan hài sống phát triển tốt sau vào mẫu 47 Hình 3.2 Sự hình thành callus Lan hài 51 Hình 3.3 Sự hình thành PLB mẫu Lan hài .52 Hình 3.4 Sự hình thành cụm chồi Lan hài 54 Hình 3.5 Cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) tái sinh hoàn chỉnh ống nghiệm 56 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D: acid 2,4 Dichlorophenoxy acetic BA: 6-Benzylaminopurine ĐHST: Điều hòa sinh trưởng IAA: 3-Indolacetic acid IBA: 3-Indolbutyric acid IUCN: Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế KC: Knudson C LS: Linsmainer Skoog, 1965 MS: Murashige Skoog, 1962 NAA: Naphtalenacetic acid TDZ: 1-phenyl-1-3-(1,2,3-Thiathidiazol-5-yl) urea VW: Vacin Went, 1949 Lời mở đầu Đã từ lâu, người phương Đông tôn hoa Lan “vương giả chi hoa” người phương Tây tôn hoa Lan “nữ hoàng loài hoa” Hoa Lan thực chinh phục người phương Đông người phương Tây cấu trúc kì diệu đa dạng màu sắc, hình dáng hương thơm quyến rũ Hiện nay, nhu cầu trồng thưởng thức hoa Lan người ngày cao khơng điều nêu mà cịn độ bền hoa, giữ điều kiện nhiệt độ, độ ẩm hoa Lan cịn ngun hương nguyên sắc từ hai tuần hai tháng chí đến bốn tháng Trong số loại hoa Lan Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) loại Lan đặc biệt cấu trúc hoa có khơng hai chúng Cánh hoa hình hài nằm vị trí thấp hoa tạo nên vẻ ngồi đặc sắc, màu sắc hoa tốt lên vẻ mềm mại quyến rũ Không hoa mà Lan hài hồng dặc sắc khảm xanh tím tựa vải nhung gấm Những điều tạo cho Lan hài hồng nét đẹp cao sang quý phái Và đặc biệt loài đặc hữu quí Việt Nam Vẻ đẹp Lan hài hồng làm cho chúng ưa chuộng thị trường giới Cũng vẻ đẹp giá trị dẫn đến việc thu thập khai thác Lan hài hồng diễn cách ạt làm cho loài hoa quý ngày cạn kiệt tự nhiên Đã từ lâu, người ta tiến hành nhân giống loài Lan nhiều phương pháp khác gieo hạt, tách mầm phương pháp nhiều nhược điểm chất lượng không đồng đều, chất lượng thấp số lượng ít,…Để khắc phục điều này, người ta tiến hành nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro để tạo số lượng lớn, chất lượng cao, đồng bệnh Đây điều mà phương pháp truyền thống không thực Hiện nay, nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển mạnh mẽ, đặc biệt Đà Lạt, nơi mà điều kiện khí hậu phù hợp cho việc nhân giống in vitro Đối với Lan hài, có số cơng trình cơng bố kết vi nhân giống loại đa số nhà khoa học giới cho việc nhân giống in vitro Lan hài khó khăn Ở Việt Nam, vấn đề quan tâm có kết nghiên cứu bước đầu chủ yếu tập trung vào kỹ thuật gieo hạt ống nghiệm Việc nhân giống lồi cịn nhiều vấn đề phải giải Đối với Lan hài hồng, nhiều tài liệu cho thấy, việc nhân giống loài hoa chủ yếu thực phương pháp tách mầm gieo hạt in vitro Cho đến chưa có tài liệu cơng bố qui trình hồn chỉnh phục vụ nhân giống in vitro loại quý Chính vậy, đề tài “nghiên cứu hồn thiện qui trình nhân giống in vitro Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí Việt Nam” vấn đề cần thiết cấp bách nhằm bảo tồn nguồn tài nguyên quốc gia quí tạo tiền đề cho việc nhân giống đại trà loại hoa có giá trị cho thị trường nước xuất Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát phương pháp vi nhân giống 1.1.1 Khái niệm phương pháp nhân giống in vitro Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” dùng cách rộng rãi để nói việc ni cấy tất phần thực vật (mô, quan, tế bào đơn) điều kiện vô trùng Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật thường dùng để nghiên cứu tất vấn đề liên quan đến thực vật sinh lí học, sinh hóa học, di truyền học cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật mở rộng để nhân giống vô tính cách kinh tế loại trồng quan trọng có giá trị kinh tế Ni cấy mơ nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp (như đường, muối khống, vitamin chất điều hịa sinh trưởng) điều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi quan từ mô lá, hoa rễ Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô sử dụng rộng rãi công tác giống trồng, cung cấp loại giống trồng chất lượng cao 1.1.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường sử dụng nuôi cấy mô thực vật tổ hợp gồm nhiều thành phần: muối, vitamin, axit amin, chất điều hòa sinh trưởng, đường, agar hay gelrite nước Tất thành phần thực hay nhiều chức trình phát triển in vitro thực vật Các chất khống có mặt môi trường nuôi cấy tế bào thực vật sử dụng yếu tố để tổng hợp nên phân tử hữu chất xúc tác phản ứng enzyme Các dạng ion muối đóng vai trị quan trọng việc vận chuyển phân tử ion hóa thể thực vật, việc điều hòa áp suất thẩm thấu trì điện [7], [16] Tùy theo loại khác mà thành phần mơi trường thay đổi để thích hợp với loại Mơi trường cịn thay đổi tùy theo phát triển phân hóa mơ ni cấy, tùy thuộc vào mục đích ta muốn trì mơ trạng thái mơ sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái si h hồn chỉnh, mơi trường ni cấy n phải thay đổi nhiều hay 50 Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) khơng phải mẫu ban đầu thích hợp cho q trình ni cấy tạo callus Bảng 3.5 Nghiệm thức ảnh hưởng chất ĐHST ảnh hưởng đến khả tạo callus Lan hài hồng Nghiệm 2,4D, TDZ, % mẫu % mẫu % mẫu thức mg/l mg/l tạo callus tạo PLB chết C1 0 97 C2 0,1 95 C3 0,5 93 C4 1,0 96 C5 1,0 0,1 50 47 C6 1,0 0,5 44 52 C7 1,0 1,0 42 53 C8 5,0 0,1 52 46 C9 5,0 0,5 54 42 C10 5,0 1,0 56 39 C11 10 0,1 96 2 C12 10 0,5 82 12 C13 10 1,0 80 12 Qua thí nghiệm chúng tơi nhận thấy so với nhiều đối tượng khác việc tạo callus Lan hài khó khăn, khơng u cầu điều kiện ni cấy tối mà thời gian hình thành callus Lan hài dài (khoảng 90 ngày) Các mẫu callus hình thành thí nghiệm chuyển sang mơi trường khống MS khơng bổ sung ĐHST kết cho thấy hầu hết mẫu hình thành PLB khoảng thời gian 8-12 tuần ni cấy điều kiện có ánh sáng 51 Như từ kết nhận nêu kết luận nồng độ bổ sung 2,4D với hàm lượng 10mg/l phối hợp với 0,1mg/l TZD thích hợp cho q trình tạo callus từ mẫu PLB ban đầu Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) Hình 3.2 Sự hình thành callus Lan hài 3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng loại ĐHST thực vật 2,4D, BA, NAA TDZ đến khả nhân nhanh PLB Lan hài hồng Protocorm like body (PLB) Lan cho cấu trúc sinh tạo quan Các tế bào bề mặt PLB chứa đựng tiềm tế bào phôi, từ chúng dễ phát sinh nhiều điểm sinh trưởng bất định Chính vậy, ngồi việc tạo mơ callus, từ PLB, thực trình nhân giống với hệ số nhân cao Việc tìm mơi trường thích hợp để nhân nhanh PLB có ý nghĩa lớn nhân giống in vitro Trong q trình thực nghiệm chúng tơi quan sát nhận thấy khả nhân nhanh PLB Lan hài khó khăn, bổ sung chất ĐHST BA, NAA TDZ riêng lẽ nồng độ cao đến 3mg/l hầu hết mẫu hình thành chồi thay tạo PLB Tuy vậy, phối hợp 2,4D với TDZ BA với NAA khả tạo PLB Lan hài hiệu Kết Bảng 3.6 cho thấy nghiệm thức phối hợp 2,4D với nồng độ 5mg/l 52 TDZ với nồng độ 0,1mg/l cho kết tốt hệ số nhân PLB Lan hài Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng loại ĐHST đến khả nhân nhanh PLB Lan hài hồng Nghiệm BA, mg/l D1 2,0 0,1 3,05 D2 2,0 0,2 2,21 D3 2,0 0,3 2,12 D4 2,0 0,5 2,33 thức NAA, mg/l TDZ, mg/l Hệ số 2,4D, mg/l LSD0,05 nhân PLB 0,39 D5 1,0 0 0,1 2,89 D6 1,0 0 0,2 2,51 D7 1,0 0 0,3 2,24 LSD0,05 0,33 D8 5,0 0 0,1 3,48 D9 5,0 0 0,2 2,99 D10 5,0 0 0,3 2,34 LSD0,05 Hình 3.3 Sự hình thành PLB mẫu Lan hài 0,21 53 3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ NAA đến trình nhân nhanh chồi Lan hài hồng Giai đoạn nhân cụm chồi giai đoạn tương đối quan trọng trình nhân giống in vitro hầu hết loại thực vật nói chung Lan hài hồng nói riêng Nếu ta tìm mơi trường nhân cụm chồi nhiều (tức hệ số nhân cao) chi phí giảm hiệu kinh tế cao Đối với Lan hài hồng đặc hữu Việt nam đặc biệt có ý nghĩa nhiều người mong đợi lẽ có hệ số nhân cao cho phép nhà cấy mơ nhân nhanh số lượng lớn Lan hài thời gian ngắn Chính vậy, thí nghiệm chúng tơi tiến hành khảo sát mơi trường hiệu cho mục đích nhân chồi Kết nhận hệ số nhân chồi sau 12 tuần nuôi cấy ghi nhận Bảng 3.7 Trong kỹ thuật nhân giống in vitro, Lan hài loại cho khó khăn vấn đề gia tăng hệ số nhân Chí h vậy, sở tham khảo n cơng trình trước nghiên cứu số đối tượng Lan hài khác [12], [15] lựa chọn mơi trường mơi trường bao gồm thành phần khống MS có bổ sung số chất cần thiết n niacine, myo-inositol, hư thiamine-HCl, chất ĐHST BA, TDZ, NAA Kết nhận từ Bảng 3.7 cho thấy Lan hài ni cấy mơi trường khơng có bổ sung chất ĐHST khả nhân chồi thể mức thấp 1,78, nghiệm thức có bổ sung chất điều hồ sinh trưởng BA, NAA TDZ cho kết cao hẳn so với đối chứng hệ số nhân chồi Hoạt chất BA thể tác động mức cao so với loại hoạt chất lại NAA TDZ, nghiệm thức bổ sung BA với hàm lượng 2,0mg/l cho hiệu nhân chồi cao 54 Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Lan hài hồng Nghiệm thức Chất ĐHST Nồng độ (mg/l) Hệ số nhân chồi E1 (ĐC) - 1,78 E2 BA 1,0 3,71 E3 BA 2,0 3,98 E4 BA 3,0 2,98 LSD0,05 0,43 E5 TDZ 0,5 3,09 E6 TDZ 1,0 3,13 E7 TDZ 1,5 2,91 LSD0.05 0,33 E8 NAA 1,0 2,48 E9 NAA 2,0 2,92 E10 NAA 3,0 2,13 LSD0,05 Hình 3.4 Sự hình thành cụm chồi Lan hài 0,23 55 3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng loại môi tr ường khác đến khả tái sinh hoàn chỉnh Lan hài hồng Nghiên cứu nhiều tác giả trước Lan hài cho thấy tái sinh hoàn chỉnh giai đoạn đơn giản công đoạn kỹ thuật nhân giống in vitro loại dễ dàng số loại hoa Lan khác [18] Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát tạo hoàn chỉnh Lan hài hai loại môi trường ½ khoáng MS LS đồng thời bổ sung đầy đủ vitamin chất khác nước dừa NAA Kết nhận Bảng 3.8 cho thấy hai loại mơi trường thích hợp cho Lan hài cụ thể kết cho thấy tất mẫu nuôi cấy hai loại môi trường nói hình thành rễ Ngay nghiệm thức F1 F6 dù mơi trường có thành phần khống, khơng bổ sung vitanim chất ĐHST rễ tạo thành Và việc bổ sung chất nước dừa, NAA có tác dụng gia tăng phát triển Lan hài hồng ống nghiệm Môi trường MS với hàm lượng vitamin cao tỏ thích hợp cho loại giai đoạn tái sinh 56 Bảng 3.8 Kết ảnh hưởng loại môi trường đến khả tái sinh Lan hài Nghiệm thức Tỷ lệ Số rễ, % Môi trường rễ/cây Chiều cao Chiều dài cây, cm rễ, cm F1 ½ khống LS 100 2,10,14 2,30,17 2,20,27 F2 ½ khống MS + Vitamin LS 100 2,20,15 2,30,25 2,50,20 F3 ½ khống MS + Vitamin 100 2,30,20 2,10,17 2,60,26 LS + nước dừa 10% F4 ½ khống MS + Vitamin LS + NAA 0,1mg/l 100 2,90,09 2,40,23 2,70,29 F5 ½ khống MS + Vitamin LS + NAA 0,1mg/l + nước dừa 10% 100 3,60,19 2,90,43 3,10,13 F6 ½ Khống MS 100 2,40,21 2,50,19 2,40,20 F7 ½ khống MS + Vitaminn MS 100 2,60,10 2,60,13 2,60,22 F8 ½ khốngMS+Vitamin MS + nước dừa 10% 100 2,50,13 2,80,23 2,90,16 F9 ½ khốngMS+Vitamin MS + NAA 0,1mg/l 100 3,10,08 2,80,30 2,70,17 F10 ½ khốngMS + Vitaminn MS + NAA 0,1mg/l + nước dừa 10% 100 3,80,13 3,20,16 3,20,15 Hình 3.5 Cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) tái sinh hoàn chỉnh ống nghiệm 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nhận đây, đến số kết luận sau : 1.1 Ca(OCl)2 với nồng độ 10% thích hợp cho q trình khử trùng mẫu Lan hài hồng thời gian xử lý hiệu đỉnh sinh trưởng 25 phút cành phát hoa 20 phút 1.2 Môi trường VW có bổ sung IBA nồng độ 0,2mg/l mơi trường phù hợp để gieo hạt Lan hài hồng 1.3 Nồng độ bổ sung 2,4D mức 10mg/l phối hợp với 0,1mg/l TDZ thích hợp cho mục đích tạo callus từ PLB Lan hài 1.4 Môi trường MS mơi trường thích hợp cho mục đích nhân nhanh PLB Lan hài BA chất ĐHST hiệu nồng độ hiệu chất 2,0mg/l 1.5 Sự phối hợp BA nồng độ 2m với NAA với TDZ có g/l nồng độ 0,1mg/l cho hiệu nhân nhanh PLB tốt so với trường hợp không phối hợp 1.6 Môi trường VW LS môi trường thích hợp cho mục đích nhân chồi bổ sung BA với hàm lượng 0,2mg/l cho hệ số nhân chồi cao cao chất điều hòa sinh trưởng khác TDZ, NAA 1.7 Môi trường tái sinh hồn chỉnh thích hợp cho Lan hài hồng môi trường với đầy đủ thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa (10%) NAA (0,1mg/l) 58 Kiến nghị Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên số thí nghiệm chúng tơi chưa tiến hành khảo sát Vì mà chúng tơi có số đề nghị sau: 2.1 Cần tiếp tục khảo sát trình khử trùng tái sinh mẫu sử dụng HgCl2 thời gian nồng độ khác thay cho Ca(OCl)2 2.2 Cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng khác môi trường cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng,… đến khả nẩy mầm củ hạt a Lan hài hồng 2.3 Cần khảo sát khả tạo callus từ đầu rễ ảnh hưởng điều kiện thành phần môi trường, pH, ánh sáng đến khả hình thành callus Lan hài hồng 2.4 Cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng phối hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân chồi tái sinh hoàn chỉnh Lan hài hồng 2.5 Cần thực giai đoạn chuyển vườn ươm để đánh giá khả sống phát triển Lan hài hồng nuôi cấy in vitro điều kiện ex vitro 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Trần Thị Thanh Bình (2006), Khảo sát quy trình nhân nhanh địa lan vàng ba râu (Cymbidium sayonara raritan) kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nha Trang Phạm Hoàng Hộ (1972), Cây cỏ miền Nam, Trung tâm học liệu, Sài Gòn P K Lộc, N.T Hiệp, L Averyanov, P Cribb (2004), Lan Hài Việt Nam Với phần giới thiệu hệ thực vật Việt nam (Phiên tiếng việt), NXB Giao thông Vận tải Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trần Văn Minh (1997), Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh công nghệ tế tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia Nguyễn Công Nghiệp (1985), Trồng hoa Lan , Nhà xuất Trẻ Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tá giống c trồng, NXB Nông nghiệp Bùi Trang Việt (2002), Sinh lí thực vật đại cương, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo tiếng Anh Y.H Lin, C Chang, W.C Chang (2000), "Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid", Plant Cell Tiss Org Cult., Vol 62, pp 21–25 10 Y Chen, C Piluek (1995), "Effect of thidiazuron and N6-benzylaminopurine on shoot regeneration of Phalaenopsis", Plant Growth Regul., Vol 16, pp 99–101 11 R Ernst (1994), "Effect of thidiazuron on in vitro propagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis (Orchidaceae)", Plant Cell Tiss Cult., Vol 39, pp 273–275 60 12 Huang, L.C., Lin, C.J Kuo, C Huang, B.L., Murashge, T (2000), I., i "Paphiopedilum conning in vitro", Sci Horctic., Vol 91, pp 111-121 13 Y Ishii, T Takamura, M Goi, M Tanaka (1998), "Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis", Plant Cell Rep., Vol 17, pp 446–450 14 Koshiro Kawase (2006), "Clonal propagation of Paphiopedilum by tissue culture in vitro culture of ovaries", Flower Stalks and Undevelop Flower Buds 15 S.Y Park, H.N Murthy, K.Y Paek (2002), "Rapid propagation of Phalaenopsis from oral stalk-derived leaves", In Vitro Cell Dev Biol Plan Vol 38, pp t, 168–172 16 Dr Oradee Sahavacharin (1996), Tissue culture micropropagation technology, Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Kasetsart University 17 Roberta H Smith (1992), Plant tissue culture-Techniques and Experiments, Academic press, Inc, The United States of America 18 M Tanaka, M Kumura, M Goi (1988), "Optimal conditions for shoot production from Phalaenopsis ower stalk cultures in vitro", Sci Hortic., Vol 35, pp 117–126 19 M Tanaka, Y Sakanishi (1977), "Clonal propagation of Phalaenopsis by leaf tissue cultures", Am Orchid Soc Bull., Vol 46, 733–737 20 K Tokuhara, M Mii (2001), "Induction of embryogenic callu and cell s suspension culture from shoot tips excised from ower stalk buds of Phalaenopsis (Orchidaceae)", In Vitro Cell Dev Biol Plant, Vol 37, pp 457–461 21 S.P Vij, P Pathak (1990), "Micropropagation of orchids though leaf r segments", J Orchid Soc India, Vol 4, pp 69–88 61 PHỤ LỤC Các thành phần môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962): a Khoáng đa lượng mg/l) e Vi lượng (mg/l) - Kali nitrat (KNO3) 1900 - Đồng sulfat (CuSO4 5H2O) 0,025 - Amoni nitrat (NH4NO3) 1650 - Coban sulfat (CoCl2 6H2O) 0,025 - Canxi clorua (CaCl2 2H2O) 440 - Magiê sulfat (MgSO4 7H2O 370 170 - Mangan sulfat (MnSO4 H2O) - Kẽm sulfat (ZnSO4.7 H2O) 37,3 27,8 g Vitamin (mg/l) - Glycine 2,0 - nicotinic acid 0,5 22,3 - Piridoxin – HCl (B6) 0,5 8,6 - Thiamin – HCl (B1) 0,1 c Khoáng vi lượng (mg/l) - Boric axit (H3BO3) - Na2 - EDTA - Sắt sulfat (FeSO4 7H2O) b Phosphat (mg/l) - Kali monophosphat (KH2PO4) f Sắt EDTA (mg/l) 6,2 - Myo – inositol d Khoáng vi lượng (mg/l) - Kali iốt (KI) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4 2H2O) 0,25 100 62 PHỤ LỤC Thành phần môi trường VW (Vacin & Went, 1949): b Khoáng đa lượng (mg/l) e Vi lượng (mg/l) - Kali nitrat (KNO3) 525 - Đồng sulfat (CuSO4 5H2O) 0,025 - Amoni sunfat (NH4)2SO4 500 - Coban sulfat (CoCl2 6H2O) 0,025 - Canxi photphat (Ca3(PO4)2 200 - Magiê sulfat (MgSO4 7H2O ) 250 250 37,3 27,8 g Vitamin (mg/l) - Thiamin - HCl (B1) c Khoáng vi lượng (mg/l) - Boric axit (H3BO3) 10 - Mangan sulfat (MnSO4 H2O) 19 - Kẽm sulfat (ZnSO4 H2O) 10 d Khoáng vi lượng (mg/l) - Kali iốt (KI) - Na2 - EDTA - Sắt tatrate b Phosphat (mg/l) - Kali monophosphat (KH2PO4) f Sắt EDTA (mg/l) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4 2H2O) 0,25 - Myo - inositol 0,4 100 63 PHỤ LỤC Thành phần môi trường LS (Linsmainer Skoog, 1965): c Khoáng đa lượng (mg/l) e Vi lượng (mg/l) - Kali nitrat (KNO3) 1900 - Đồng sulfat (CuSO4 5H2O) 0,025 - Amoni nitrat (NH4NO3) 1650 - Coban sulfat (CoCl2 6H2O) 0,025 - Canxi clorua (CaCl2 2H2O) 440 - Magiê sulfat (MgSO4 7H2O 370 170 6,2 - Mangan sulfat (MnSO4 4H2O) 22,3 - Kẽm sulfat (ZnSO4 7H2O) 8,6 d Khoáng vi lượng (mg/l) - Kali iốt (KI) 37,3 7,8 g Vitamin (mg/l) - Thiamin - HCl (B1) c Khoáng vi lượng (mg/l) - Boric axit (H3BO3) - Na2 - EDTA - Sắt sulfat (FeSO4 7H2O) b Phosphat (mg/l) - Kali monophosphat (KH2PO4) f Sắt EDTA (mg/l) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4 2H2O) 0,25 - Myo - inositol 0,4 100 64 PHỤ LỤC Thành phần mơi trường KC (Knudson C, 1964): Khống đa lượng (mg/l) - Amoni sunfat (NH4)2SO4 500 - Magiê sulfat (MgSO4 7H2O ) 250 - Kali monophosphat (KH2PO4) 250 - Canxi nitrat (Ca(NO3) 4H2O) 1000 ... thuật ni cấy in vitro Điều lí giải Việt Nam giới có cơng trình nghiên cứu lồi chưa có tài liệu cơng bố cách hồn chỉnh qui trình nhân giống in vitro Lan hài Nhân giống in vitro Lan hài chủ yếu... đề tài ? ?nghiên cứu hồn thiện qui trình nhân giống in vitro Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí Việt Nam? ?? vấn đề cần thiết cấp bách nhằm bảo tồn nguồn tài nguyên quốc gia quí tạo... trường khác đến khả tái sinh hoàn chỉnh Lan hài hồng Tái sinh hồn chỉnh cơng đoạn cuối quan trọng qui trình nhân giống in vitro Thực chất thí nghiệm trình rễ in vitro Nếu rễ in vitro thực tốt, tức