Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các loại ĐHST thực vật 2,4D, BA, NAA

TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng

Protocorm like body (PLB) của Lan được cho là một cấu trúc sinh tạo cơ quan. Các tế bào bề mặt của PLB chứa đựng tiềm năng của các tế bào phôi, từ đây chúng dễ phát sinh nhiều điểm sinh trưởng bất định. Chính vì vậy, ngoài việc tạo mô callus, từ các PLB, chúng ta có thể thực hiện quá trình nhân giống với hệ số nhân cao. Việc tìm ra môi trường thích hợp để nhân nhanh các PLB có một ý nghĩa rất lớn trong nhân giống in vitro.

Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi cũng đã quan sát và nhận thấy rằng khả năng nhân nhanh PLB của cây Lan hài là rất khó khăn, nếu chỉ bổ sung các chất ĐHST như BA, NAA hoặc TDZ riêng lẽ mặc dù ở nồng độ cao đến 3mg/l thì hầu hết các mẫu đều hình thành chồi thay vì tạo các PLB. Tuy vậy, khi phối hợp giữa 2,4D với TDZ hoặc BA với NAA thì khả năng tạo PLB của cây Lan hài là rất hiệu quả. Kết quả Bảng 3.6 cho thấy nghiệm thức phối hợp giữa 2,4D với nồng độ 5mg/l

và TDZ với nồng độ 0,1mg/l đã cho kết quả rất tốt về hệ số nhân PLB của cây Lan hài.

Bảng 3.6. Kết quả ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng

Hình 3.3. Sự hình thành PLB của mẫu Lan hài Nghiệm thức 2,4D, mg/l BA, mg/l NAA, mg/l TDZ, mg/l Hệ số nhân PLB D1 0 2,0 0,1 0 3,05 D2 0 2,0 0,2 0 2,21 D3 0 2,0 0,3 0 2,12 D4 0 2,0 0,5 0 2,33 LSD0,05 0,39 D5 1,0 0 0 0,1 2,89 D6 1,0 0 0 0,2 2,51 D7 1,0 0 0 0,3 2,24 LSD0,05 0,33 D8 5,0 0 0 0,1 3,48 D9 5,0 0 0 0,2 2,99 D10 5,0 0 0 0,3 2,34 LSD0,05 0,21

3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ và NAA đến quá trình nhân nhanh chồi cây Lan hài hồng

Giai đoạn nhân cụm chồi là một trong những giai đoạn tương đối quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro của hầu hết các loại thực vật nói chung và đối với cây Lan hài hồng nói riêng. Nếu như ta tìm được môi trường nhân cụm chồi càng nhiều (tức hệ số nhân càng cao) thì chi phí sẽ càng giảm và hiệu quả kinh tế càng cao. Đối với cây Lan hài hồng đặc hữu của Việt nam thì đặc biệt có ý nghĩa và rất nhiều người mong đợi bởi lẽ khi có hệ số nhân cao nó cho phép các nhà cấy mô nhân nhanh số lượng lớn cây Lan hài trong thời gian ngắn. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát môi trường hiệu quả cho mục đích nhân chồi. Kết quả nhận được về hệ số nhân chồi sau 12 tuần nuôi cấy được ghi nhận trong Bảng 3.7.

Trong kỹ thuật nhân giống in vitro, cây Lan hài là loại cây được cho là rất khó khăn trong vấn đề gia tăng hệ số nhân. Chính vì vậy, trên cơ sở tham khảo những công trình trước đây đã nghiên cứu trên một số đối tượng Lan hài khác [12], [15] chúng tôi đã lựa chọn môi trường cơ bản chính là môi trường bao gồm thành phần khoáng MS và có bổ sung một số chất cần thiết như niacine, myo-inositol, thiamine-HCl, và các chất ĐHST như BA, TDZ, NAA. Kết quả nhận được từ Bảng 3.7 cho thấy đối với cây Lan hài khi nuôi cấy trong môi trường không có bổ sung chất ĐHST thì khả năng nhân chồi vẫn thể hiện ở mức thấp 1,78, trong khi đó các nghiệm thức có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng BA, NAA và TDZ đều cho kết quả cao hơn hẳn so với đối chứng về hệ số nhân chồi. Hoạt chất BA đã thể hiện tác động ở mức cao hơn so với 2 loại hoạt chất còn lại là NAA và TDZ, và nghiệm thức bổ sung BA với hàm lượng 2,0mg/l cho hiệu quả nhân chồi là cao nhất.

Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi Lan hài hồng

Nghiệm thức Chất ĐHST Nồng độ (mg/l) Hệ số nhân chồi

E1 (ĐC) - 0 1,78 E2 BA 1,0 3,71 E3 BA 2,0 3,98 E4 BA 3,0 2,98 LSD0,05 0,43 E5 TDZ 0,5 3,09 E6 TDZ 1,0 3,13 E7 TDZ 1,5 2,91 LSD0.05 0,33 E8 NAA 1,0 2,48 E9 NAA 2,0 2,92 E10 NAA 3,0 2,13 LSD0,05 0,23

3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan hài hồng năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan hài hồng

Nghiên cứu của nhiều tác giả trước đây về cây Lan hài cho thấy rằng mặc dù tái sinh cây hoàn chỉnh là giai đoạn đơn giản nhất trong các công đoạn của kỹ thuật nhân giống in vitro loại cây này nhưng không phải dễ dàng như một số loại hoa Lan khác [18]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát sự tạo cây hoàn chỉnh của cây Lan hài trên hai loại môi trường cơ bản là ½ khoáng MS và LS đồng thời bổ sung các đầy đủ vitamin và chất khác như nước dừa và NAA. Kết quả nhận được Bảng 3.8 cho thấy cả hai loại môi trường đều thích hợp cho cây Lan hài cụ thể ở đây kết quả cho thấy tất cả các mẫu nuôi cấy trên cả hai loại môi trường nói trên đều hình thành rễ. Ngay cả ở nghiệm thức F1 và F6 dù môi trường chỉ có thành phần khoáng, không bổ sung vitanim và các chất ĐHST nhưng rễ vẫn được tạo thành. Và việc bổ sung các chất như nước dừa, NAA đều có tác dụng gia tăng sự phát triển của cây Lan hài hồng trong ống nghiệm. Môi trường MS với hàm lượng vitamin cao hơn tỏ ra thích hợp cho loại cây này trong giai đoạn tái sinh.

Bảng 3.8. Kết quả ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng tái sinh cây Lan hài

Nghiệm thức Môi trường Tỷ lệ cây ra rễ, % Số rễ/cây Chiều cao cây, cm Chiều dài rễ, cm F1 ½ khoáng LS 100 2,10,14 2,30,17 2,20,27 F2 ½ khoáng MS + Vitamin LS 100 2,20,15 2,30,25 2,50,20 F3 ½ khoáng MS + Vitamin LS + nước dừa 10% 100 2,30,20 2,10,17 2,60,26 F4 ½ khoáng MS + Vitamin LS + NAA 0,1mg/l 100 2,90,09 2,40,23 2,70,29 F5 ½ khoáng MS + Vitamin LS + NAA 0,1mg/l + nước dừa 10% 100 3,60,19 2,90,43 3,10,13 F6 ½ Khoáng MS 100 2,40,21 2,50,19 2,40,20 F7 ½ khoáng MS + Vitaminn MS 100 2,60,10 2,60,13 2,60,22 F8 ½ khoángMS+Vitamin MS + nước dừa 10% 100 2,50,13 2,80,23 2,90,16 F9 ½ khoángMS+Vitamin MS + NAA 0,1mg/l 100 3,10,08 2,80,30 2,70,17 F10 ½ khoángMS + Vitaminn MS + NAA 0,1mg/l + nước dừa 10% 100 3,80,13 3,20,16 3,20,15

Hình 3.5. Cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) được tái sinh hoàn chỉnh trong ống nghiệm

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ các kết quả nhận được trên đây, chúng tôi đi đến một số kết luận như sau :

1.1. Ca(OCl)2 với nồng độ 10% thích hợp cho quá trình khử trùng mẫu Lan hài hồng thời gian xử lý hiệu quả đối với đỉnh sinh trưởng và quả là 25 phút và cành phát hoa là 20 phút.

1.2. Môi trường VW có bổ sung IBA nồng độ 0,2mg/l là môi trường phù hợp để gieo hạt Lan hài hồng.

1.3. Nồng độ bổ sung của 2,4D ở mức 10mg/l phối hợp với 0,1mg/l TDZ là thích hợp cho mục đích tạo callus từ các PLB của cây Lan hài.

1.4. Môi trường MS là môi trường thích hợp cho mục đích nhân nhanh PLB của cây Lan hài và BA là chất ĐHST hiệu quả nhất và nồng độ hiệu quả nhất của chất này là 2,0mg/l.

1.5. Sự phối hợp của BA ở nồng độ 2mg/l với NAA hoặc với TDZ có nồng độ 0,1mg/l cho hiệu quả nhân nhanh PLB tốt hơn so với trường hợp không phối hợp.

1.6. Môi trường VW hoặc LS là môi trường thích hợp cho mục đích nhân chồi và sự bổ sung BA với hàm lượng 0,2mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất và cao hơn những chất điều hòa sinh trưởng khácnhưTDZ, NAA.

1.7. Môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh thích hợp nhất cho cây Lan hài hồng là môi trường với đầy đủ các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa (10%) và NAA (0,1mg/l).

2. Kiến nghị

Do thời gian thực hiện của đề tài có giới hạn nên một số thí nghiệm chúng tôi chưa tiến hành khảo sát được. Vì vậy mà chúng tôi có một số đề nghị sau:

2.1. Cần tiếp tục khảo sát quá trình khử trùng tái sinh mẫu sử dụng HgCl2

ở các thời gian và nồng độ khác nhau thay cho Ca(OCl)2.

2.2. Cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng khác của môi trường như cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng,… đến khả năng nẩy mầm của hạt Lan hài hồng.

2.3. Cần khảo sát khả năng tạo callus từ lá và đầu rễ cũng như ảnh hưởng của các điều kiện về thành phần môi trường, pH, ánh sáng đến khả năng hình thành callus của cây Lan hài hồng.

2.4. Cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân chồi cũng như tái sinh cây hoàn chỉnh của cây Lan hài hồng.

2.5. Cần thực hiện giai đoạn chuyển cây ra vườn ươm để đánh giá khả năng sống và phát triển của Lan hài hồng nuôi cấy in vitro trong điều kiện

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt

1. Trần Thị Thanh Bình (2006), Khảo sát quy trình nhân nhanh cây địa lan vàng ba râu (Cymbidium sayonara raritan) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nha Trang.

2. Phạm Hoàng Hộ (1972), Cây cỏ miền Nam, Trung tâm học liệu, Sài Gòn.

3. P. K. Lộc, N.T. Hiệp, L. Averyanov, P. Cribb (2004), Lan Hài Việt Nam. Với phần giới thiệu về hệ thực vật Việt nam (Phiên bản tiếng việt), NXB Giao thông Vận tải.

4. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

5. Trần Văn Minh (1997), Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh công nghệ tế tế

bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.

6. Nguyễn Công Nghiệp (1985), Trồng hoa Lan , Nhà xuất bản Trẻ.

7. Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây

trồng, NXB Nông nghiệp.

8. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lí thực vật đại cương, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Tài liệu tham khảo tiếng Anh

9. Y.H. Lin, C. Chang, W.C. Chang (2000), "Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid", Plant Cell Tiss. Org. Cult., Vol. 62, pp. 21–25.

10.Y. Chen, C. Piluek (1995), "Effect of thidiazuron and N6-benzylaminopurine on shoot regeneration of Phalaenopsis", Plant Growth Regul., Vol. 16, pp. 99–101.

11.R. Ernst (1994), "Effect of thidiazuron on in vitro propagation of Phalaenopsis

12.Huang, L.C., Lin, C.J. Kuo, C.I., Huang, B.L., Murashige, T. (2000),

"Paphiopedilum conning in vitro", Sci. Horctic., Vol. 91, pp. 111-121.

13.Y. Ishii, T. Takamura, M. Goi, M. Tanaka (1998), "Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis", Plant Cell Rep., Vol. 17, pp. 446–450.

14.Koshiro Kawase (2006), "Clonal propagation of Paphiopedilum by tissue culture

in vitro culture of ovaries", Flower Stalks and Undevelop Flower Buds.

15.S.Y. Park, H.N. Murthy, K.Y. Paek (2002), "Rapid propagation of Phalaenopsis

from oral stalk-derived leaves", In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, Vol. 38, pp. 168–172.

16.Dr. Oradee Sahavacharin (1996), Tissue culture micropropagation technology, Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Kasetsart University.

17.Roberta H. Smith (1992), Plant tissue culture-Techniques and Experiments, Academic press, Inc, The United States of America.

18.M. Tanaka, M. Kumura, M. Goi (1988), "Optimal conditions for shoot production from Phalaenopsis ower stalk cultures in vitro", Sci. Hortic., Vol. 35, pp. 117–126.

19.M. Tanaka, Y. Sakanishi (1977), "Clonal propagation of Phalaenopsis by leaf tissue cultures", Am. Orchid Soc. Bull., Vol. 46, 733–737.

20.K. Tokuhara, M. Mii (2001), "Induction of embryogenic callus and cell suspension culture from shoot tips excised from ower stalk buds of Phalaenopsis

(Orchidaceae)", In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, Vol. 37, pp. 457–461.

21.S.P. Vij, P. Pathak (1990), "Micropropagation of orchids through leaf segments", J. Orchid Soc. India, Vol. 4, pp. 69–88.

PHỤ LỤC 1

Các thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962):

a. Khoáng đa lượng mg/l)

- Kali nitrat (KNO3) 1900

- Amoni nitrat (NH4NO3) 1650

- Canxi clorua (CaCl2. 2H2O) 440

- Magiê sulfat (MgSO4. 7H2O 370

b. Phosphat (mg/l) - Kali monophosphat (KH2PO4) 170

c. Khoáng vi lượng 1 (mg/l) - Boric axit (H3BO3) 6,2 - Mangan sulfat (MnSO4 .4 H2O) 22,3 - Kẽm sulfat (ZnSO4.7 H2O) 8,6 d. Khoáng vi lượng 2 (mg/l) - Kali iốt (KI) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4. 2H2O) 0,25

e. Vi lượng 3 (mg/l) - Đồng sulfat (CuSO4. 5H2O) 0,025 - Coban sulfat (CoCl2. 6H2O) 0,025 f. Sắt EDTA (mg/l) - Na2 - EDTA 37,3 - Sắt sulfat (FeSO4. 7H2O) 27,8 g. Vitamin (mg/l) - Glycine 2,0 - nicotinic acid 0,5 - Piridoxin – HCl (B6) 0,5 - Thiamin – HCl (B1) 0,1 - Myo – inositol 100

PHỤ LỤC 2

Thành phần cơ bản của môi trường VW (Vacin & Went, 1949):

b. Khoáng đa lượng (mg/l)

- Kali nitrat (KNO3) 525 - Amoni sunfat (NH4)2SO4 500 - Amoni sunfat (NH4)2SO4 500 - Amoni sunfat (NH4)2SO4 500 - Canxi photphat (Ca3(PO4)2 200 - Magiê sulfat (MgSO4. 7H2O ) 250

b. Phosphat (mg/l)

- Kali monophosphat (KH2PO4) 250

c. Khoáng vi lượng 1 (mg/l)

- Boric axit (H3BO3) 10 - Mangan sulfat (MnSO4 .4 H2O) 19 - Kẽm sulfat (ZnSO4. H2O) 10

d. Khoáng vi lượng 2 (mg/l)

- Kali iốt (KI) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4. 2H2O) 0,25

e. Vi lượng 3. (mg/l)

- Đồng sulfat (CuSO4. 5H2O) 0,025 - Coban sulfat (CoCl2. 6H2O) 0,025

f. Sắt EDTA (mg/l) - Na2 - EDTA 37,3 - Sắt tatrate 27,8 g. Vitamin (mg/l) - Thiamin - HCl (B1) 0,4 - Myo - inositol 100

PHỤ LỤC 3

Thành phần cơ bản của môi trường LS (Linsmainer và Skoog, 1965):

c. Khoáng đa lượng (mg/l)

- Kali nitrat (KNO3) 1900

- Amoni nitrat (NH4NO3) 1650

- Canxi clorua (CaCl2. 2H2O) 440

- Magiê sulfat (MgSO4. 7H2O 370

b. Phosphat (mg/l) - Kali monophosphat (KH2PO4) 170

c. Khoáng vi lượng 1 (mg/l) - Boric axit (H3BO3) 6,2 - Mangan sulfat (MnSO4 . 4H2O) 22,3 - Kẽm sulfat (ZnSO4. 7H2O) 8,6 d. Khoáng vi lượng 2 (mg/l) - Kali iốt (KI) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4. 2H2O) 0,25

e. Vi lượng 3 (mg/l) - Đồng sulfat (CuSO4. 5H2O) 0,025 - Coban sulfat (CoCl2. 6H2O) 0,025 f. Sắt EDTA (mg/l) - Na2 - EDTA 37,3 - Sắt sulfat (FeSO4. 7H2O) 7,8 g. Vitamin (mg/l) - Thiamin - HCl (B1) 0,4 - Myo - inositol 100

PHỤ LỤC 4

Thành phần cơ bản của môi trường KC (Knudson C, 1964):

Khoáng đa lượng (mg/l)

- Amoni sunfat (NH4)2SO4 500

- Magiê sulfat (MgSO4. 7H2O ) 250

- Kali monophosphat (KH2PO4) 250