đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan hài hồng
Tái sinh cây hoàn chỉnh là công đoạn cuối cùng nhưng hết sức quan trọng của qui trình nhân giống in vitro. Thực chất thí nghiệm này chính là quá trình ra rễ
in vitro. Nếu ra rễ in vitro thực hiện tốt, tức là tìm được môi trường có tỉ lệ ra rễ cao, số rễ nhiều, rễ phát triển tốt thì sẽ tạo thuận lợi cho cây phát triển tốt khi chuyển ra vườn ươm. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng hai loại môi trường cơ bản là MS và LS có bổ sung thêm một số thành phần như vitamin, nước dừa, NAA để đánh giá ảnh hưởng của chúng đến khả năng ra rễ của cây Lan hài.
Môi trường được pha chế theo nghiệm thức như ở Bảng 2.8 và bổ sung thêm: Đường 20g/l
Agar 12g/l
Than hoạt tính 1g/l pH = 5,8
Bảng 2.8. Nghiệm thức các loại môi trường ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây Lan hài hồng
Nghiệm thức Môi trường
F1 ½ khoáng LS
F2 ½ khoáng MS + Vitamin LS
F3 ½ khoáng MS + Vitamin LS + nước dừa 10% F4 ½ khoáng MS + Vitamin LS + NAA 0,1mg/l
F5 ½ khoáng MS + Vitamin LS + NAA 0,1mg/l + nước dừa 10%
F6 ½ Khoáng MS
F8 ½ khoáng MS + Vitaminn MS + nước dừa 10%
F9 ½ khoáng MS + Vitaminn MS + NAA 0,1mg/l
F10 ½ khoáng MS + Vitaminn MS + NAA 0,1mg/l + nước dừa 10%
Mẫu cấy là các chồi chưa ra rễ được tách từ các cây mẹ, các chồi đã đạt được chiều cao 4-5 mm, cấy trên các môi trường khác nhau theo từng nghiệm thức như trong Bảng 2.8, mỗi nghiệm thức cấy 9 mẫu, nuôi cấy ở điều kiện sáng. Tiến hành theo dõi và lấy số liệu sau 10-12 tuần nuôi cấy. Số liệu ghi nhận gồm các chỉ tiêu: tỉ lệ ra rễ, chiều cao cây, số rễ /chồi và chiều dài rễ.
2.2.7. Xử lý thống kê số liệu:
Các thí nghiệm được bố trí theo mô hình khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần và các số liệu sau khi thu thập được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA với text LSD0,05 và phân tích sai số chuẩn (SE) sử dụng các hàm tính toán trong Microsoft Excel.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫuTái sinh mẫu là bước đầu tiên nhưng rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro.
Đây chính là giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu in vitro ban đầu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Nếu như bước tái sinh mẫu không thành công thì qui trình nhân giống in vitro cũng không thể tiến hành. Để tái sinh mẫu trước hết cần phải tiến hành khử trùng mẫu cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau. Canxihypocloride (Ca(OCl)2) được cho là một trong những hóa chất thông dụng dùng để khử trùng hầu hết các loại mẫu thực vật [5], [16]. Trong thí nghiệm này chúng tôi cũng sử dụng hoạt chất này cho mục đích khử trùng mẫu đỉnh sinh trưởng, cành phát hoa và trái của cây Lan hài hồng. Qua tham khảo tài liệu cũng như tiến hành khử trùng mẫu trên nhiều đối tượng đều cho thấy ở nồng độ 10% thì Ca(OCl)2 cho hiệu quả khử trùng rất tốt. Đối với cây Lan hài hồng chúng tôi cũng tiến hành với nồng độ này trong các khoảng thời gian khác nhau và kết quả nhận được trình bày ở các Bảng 3.1, 3.2 và 3.3.
Bảng 3.1. Tình trạng mẫu đỉnh sinh tr ưởng cây Lan hài hồng sau khi khử trùng
Tình trạng mẫu Nghiệm thức Nồng độ Ca(OCl)2, % Thời gian khử trùng, phút % đạt % nhiễm % chết A1 10 0 88 12 A2 15 0 70 30 A3 20 2 50 48 A4 10 25 50 0 50
Đối với mẫu đỉnh sinh trưởng thì kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy nồng độ Ca(OCl)2 xử lý là 10% trong thời gian 10, 15 và 20 phút là chưa đủ để khử trùng. Điều này có lẽ do đỉnh sinh trưởng được thu nhận nằm sát mặt đất nên độ nhiễm các vi sinh vật là còn tương đối nhiều. Với thời gian xử lí là 25 phút thì hiệu quả khử trùng là tốt nhất và không còn mẫu nhiễm. Tuy nhiên nếu thời gian xử lí dài hơn sẽ làm gia tăng số lượng mẫu bị chết và không hiệu quả. Điều này có thể giải thích là
do tác động tiêu diệt vi sinh vật của Ca(OCl)2 nhưng đồng thời nó cũng gây tổn thương tế bào đối với mẫu thực vật được dùng để khử trùng.
Bảng 3.2. Tình trạng mẫu cành phát hoa cây Lan hài hồng sau khi khử trùng và nuôi cấy 6 tuần
Tình trạng mẫu Nghiệm thức Nồng độ Ca(OCl)2, % Thời gian khử trùng, phút % sống % nhiễm % chết A5 10 0 86 0 A6 15 0 74 0 A7 20 50 0 50 A18 10 25 30 0 70
Tương tự như đối với mẫu đỉnh sinh trưởng, chúng tôi cũng xử lí với Ca(OCl)2 10% trong các khoảng thời gian 10, 15, 20 và 25 phút đối với mẫu cành phát hoa. Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy thời gian xử lí 20 phút cho hiệu quả tốt nhất đối với mẫu cành phát hoa và có thể thấy rằng thời gian xử lý hiệu quả đối với cành phát hoa là thấp hơn so với mẫu đỉnh sinh trưởng. Điều đó có lẽ là do mẫu cành phát hoa nằm ở phía trên mặt đất nên độ nhiễm ít hơn. Tuy nhiên cũng từ kết quả Bảng 3.2 cũng cho thấy khả năng bị tổn thương của mẫu khi xử lý kéo dài là cao hơn so với mẫu đỉnh sinh trưởng. Mặc dù mẫu ở tình trạng tốt nhưng thời gian để thu nhận được callus hay chồi từ cành phát hoa là rất lâu. Trong suốt thời gian theo dõi khoảng 5 tháng thì mẫu của chúng tôi vẫn chưa thấy có hiểu hiện nào về sự biệt hóa. Hiện tại mẫu đang được tiếp tục theo dõi tại phòng thí nghiệm của Phòng Sinh học, Trung tâm hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh. Điều này cũng đã được khẳng định bởi nhà nghiên cứu người Nhật Koshiro Kawase (2006) khi tiến hành thí nghiệm tái sinh mẫu từ cành phát hoa để tạo được callus hoặc chồi từ phát hoa cây Lan hài thì thời gian tối thiểu là từ 360 đến 372 ngày kể từ khi cấy mẫu [14].
Bảng 3.3. Tình trạng mẫu trái Lan hài hồng qua khử trùng và gieo hạt sau 10
tuần
Tình trạng hạt sau khử trùng
Nghiệm
thức
Nồng độ
Ca(OCl)2, %
Thời gian khử
trùng, phút % đạt (1) % nhiễm
A9 20 80 20
A10
10
25 100 0
(1): Ở đây đạt có nghĩa là hạt sau khi khử trùng không bị nhiễm và có khả năng
nảy mầm.
Đối với mẫu là trái Lan hài, chúng tôi tiến hành thu nhận quả và xử lí khử trùng ngay sau đó để thu nhận hạt và gieo trong điều kiện in vitro. Kết quả nhận được ở Bảng 3.3 cho thấy khi xử lí trái Lan hài bằng dung dịch Ca(OCl)2 với nồng độ là 10% trong thời gian 25 phút cho hiệu quả là rất tốt đối với những quả không bị nứt nẻ trong quá trình thu nhận hoặc xử lí. Tuy nhiên, khi thời gian xử lí mẫu ngắn hơn thì hiệu quả khử trùng cũng không được đảm bảo. Cần lưu ý rằng đối với trái Lan hài do có nhiều lông tơ hơn so với một số trái Lan hài khác như Vân hài (P. Callosum), Kim hài, v.v. nên phương thức xử lý cần phải kỹ hơn và thời gian xử lý cũng cần phải được tiến hành lâu hơn. Mặt khác cũng từ kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng đối với những trái bị nứt hoặc bị tổn thương lớp vỏ bọc do va chạm hay do bị nhiễm bệnh thường rất khó để xử lí và gieo hạt tốt mà không bị nhiễm. Nếu xử lí những trái này bằng Ca(OCl)2 nồng độ 10% trong thời gian 25 phút sẽ làm cho hạt bị đen và hầu như không nẩy mầm được. Nhưng nếu như thời gian xử lí mẫu bị rút ngắn thì đại đa số mẫu bị nhiễm. Chính vì vậy mà vấn đề thu nhận trái để vào mẫu là rất quan trọng, cần thu nhận trái kịp thời tránh tình trạng để trái quá khô dẫn đến bị nứt gây khó khăn cho công tác khử trùng và tái sinh mẫu. Đồng thời quá trình xử lí trái cần tiến hành cẩn thận, nhẹ nhàng để không làm cho trái bị nứt.
Như vậy, so với một số đối tượng khác như địa lan, cẩm chướng, salem,… thì vào mẫu Lan hài khó khăn hơn nhiều. Điều này cũng đã được khẳng định bởi đa số các nhà khoa học khi tiến hành nghiên cứu trên rất nhiều đối tượng Lan hài khác nhau [12], [15], [19], [21].
Hình 3.1. Mẫu Lan hài sống và phát triển tốt sau khi vào mẫu; trong đó (a) là mẫu
từ sinh trưởng từ hạt sau 90 ngày nuôi cấy và (b) là mẫu tái sinh từ đỉnh sinh trưởng sau 30 ngày nuôi cấy
3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại môi trường MS, VW và KC kết hợp với IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng với IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng
Hạt Lan rất nhỏ và không có nội nhũ [3] nên chúng rất khó nẩy mầm ở ngoài tự nhiên. Trong nuôi cấy in vitro, chúng tôi tiến hành gieo hạt trên môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng để tạo thuận lợi cho hạt phát triển. Số lượng hạt trong một trái là rất lớn nhưng khi gieo lên môi trường thì tỉ lệ hạt nẩy mầm hầu như rất thấp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm gieo hạt trên các loại môi trường khác nhau để tìm ra môi trường gieo hạt phù hợp. Kết quả khảo sát bước đầu về ảnh hưởng của các loại môi trường có bổ sung chất ĐHST là IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt Lan hài được trình bày ở Bảng 3.4.
Qua đánh giá sơ bộ từ kết quả ở Bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy rằng trong các loại môi trường đã khảo sát là KC, 1/2MS và VW thì khi hạt được gieo trên môi trường môi trường VW nảy mầm sớm hơn cả (sau 30 ngày) và số lượng hạt nảy mầm trên bình cũng nhiều hơn so với 2 lọai môi trường còn lại. Môi trường KC tuy tỏ ra hiệu quả hơn môi trường MS nhưng vẫn thấp hơn so với môi trường VW.
Cũng từ kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy đa số các môi trường đều có hạt nẩy mầm sau 50 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, về mức độ nẩy mầm của hạt Lan thì kết quả cho thấy trên môi trường VW có bổ sung IBA với nồng độ 0,2mg/l cho hạt nẩy mầm là tốt nhất không chỉ ở mức độ số hạt nảy mầm nhiều hơn mà sức sống của hạt nảy mầm cũng tốt hơn.
Bảng 3.4. Kết quả Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng
Nghiệm thức Môi trường IBA, mg/l Sau 30 ngày Sau 50 ngày
B1 0 _ _ B2 0,1 _ B3 0,2 + ++ B4 0,3 _ B5 KC 0,5 + + B6 0 _ _ B7 0,1 _ B8 0,2 + B9 0,3 _ B10 MS 0,5 _ B11 0 _ _ B12 0,1 _ B13 0,2 + ++ B14 0,3 _ B15 1/2MS 0,5 _ B16 0 _ B17 0,1 + + B18 0,2 ++ +++ B19 0,3 + ++ B20 V W 0,5 + Ghi chú: : Hạt chưa nẩy mầm +: Số lượng hạt nẩy mầm < 50/bình ++: Số lượng hạt nẩy mầm từ 50 – 100/bình +++: Số lượng hạt nẩy mầm >100/bình
Như vậy, qua thí nghiệm này cho thấy rằng môi trường VW có bổ sung IBA với nồng độ 0,2mg/l là khá phù hợp cho mục đích gieo hạt cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii).
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của sự kết hợp các chất ĐHST 2,4D và TDZ đến khả năng tạo callus của Lan hài hồng khả năng tạo callus của Lan hài hồng
Để gia tăng hiệu quả của quá trình nhân nhanh các loại cây từ các mẫu đã tái sinh thì giai đoạn tạo callus là một trong những bước khá quan trọng đáp ứng cho mục tiêu này. Có thể nói rằng callus chỉ được hình thành trên môi trường có bổ sung auxin với nồng độ cao [4], trong đó 2,4D là chất thường được dùng để tạo callus đối với đa số các loại mẫu thực vật. Đối với cây Lan hài, nhiều tài liệu cũng cho thấy hoạt chất này cũng có khả năng tạo callus nhưng hiệu quả tác động của hoạt chất này sẽ thể hiện cao hơn nếu nó được phối hợp với NAA hoặc TDZ và hiệu quả nhất chính là sự phối hợp với TDZ [10], [11], [12], [13]. Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng sử dụng kết hợp giữa 2,4D và TDZ ở các nồng độ khác nhau để tạo callus cho cây Lan hài hồng và kết quả ghi nhận được trình bày ở Bảng 3.5.
Từ kết quả nhận được ở Bảng 3.5 cho thấy rằng 2,4D là tác nhân chính trong quá trình hình thành callus ở cây Lan hài. Khi môi trường không bổ sung 2,4D thì không xuất hiện hình thành callus ở tất cả các mẫu mặc dù hàm lượng TDZ có bổ sung đến 1mg/l. Hoặc khi sử dụng 2,4D ở nồng độ thấp thì mẫu callus được tạo thành với tỉ lệ khá thấp (< 50%).
Nồng độ bổ sung của 2,4D từ 5mg/l trở đi có tác dụng rõ đến sự hình thành callus của Lan hài. Điều thú vị ở đây là khi bổ sung phối hợp của chất này với TDZ không chỉ có tác dụng gia tăng tỷ lệ mẫu hình thành callus so với nghiệm thức không phối hợp và đồng thời còn làm cho mẫu không bị nâu vàng. Cũng từ kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy nồng độ bổ sung của 2,4D là 10mg/l phối hợp với 0,1mg TDZ cho kết quả hình thành callus là cao nhất đối với cây Lan hài hồng và ở nồng độ tối ưu này thì tỷ lệ mẫu hình thành callus là 96% . Các kết quả nhận được nêu trên cũng khá phù hợp với kết quả đã công bố của một số tác giả khi nghiên cứu trên đối tượng Paphiopedium khác trước đây [9], [13], [20].
Ngoài ra chúng tôi cũng đã tiến hành sử dụng mô lá cây Lan hài để tạo callus nhưng tất cả các mẫu lá cấy trên môi trường đều bị chết sau 1-2 tuần nuôi cấy. Như
vậy đối với cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) thì lá không phải là mẫu ban đầu thích hợp cho quá trình nuôi cấy tạo callus.
Bảng 3.5. Nghiệm thức ảnh hưởng các chất ĐHST ảnh hưởng đến khả năng tạo callus Lan hài hồng
Nghiệm thức 2,4D, mg/l TDZ, mg/l % mẫu tạo callus % mẫu tạo PLB % mẫu chết C1 0 0 0 97 3 C2 0 0,1 0 95 5 C3 0 0,5 0 93 7 C4 0 1,0 0 96 4 C5 1,0 0,1 50 47 3 C6 1,0 0,5 44 52 4 C7 1,0 1,0 42 53 5 C8 5,0 0,1 52 46 2 C9 5,0 0,5 54 42 4 C10 5,0 1,0 56 39 5 C11 10 0,1 96 2 2 C12 10 0,5 82 12 6 C13 10 1,0 80 12 8
Qua thí nghiệm này chúng tôi cũng nhận thấy rằng so với nhiều đối tượng khác thì việc tạo callus Lan hài là rất khó khăn, không chỉ yêu cầu điều kiện nuôi cấy tối mà thời gian hình thành callus của Lan hài cũng khá dài (khoảng 90 ngày).
Các mẫu callus được hình thành trong các thí nghiệm trên được chuyển sang môi trường khoáng MS không bổ sung ĐHST thì kết quả cho thấy hầu hết các mẫu đều hình thành PLB trong khoảng thời gian 8-12 tuần khi nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng.
Như vậy từ các kết quả nhận được nêu trên có thể kết luận rằng nồng độ bổ sung của 2,4D với hàm lượng 10mg/l phối hợp với 0,1mg/l TZD là thích hợp nhất cho quá trình tạo callus từ mẫu PLB ban đầu của cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii).
Hình 3.2. Sự hình thành callus của cây Lan hài
3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các loại ĐHST thực vật 2,4D, BA, NAA và TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng
Protocorm like body (PLB) của Lan được cho là một cấu trúc sinh tạo cơ quan. Các tế bào bề mặt của PLB chứa đựng tiềm năng của các tế bào phôi, từ đây chúng dễ phát sinh nhiều điểm sinh trưởng bất định. Chính vì vậy, ngoài việc tạo
