NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ CÂY LAN HÀI HỒNG (PAPHIOPEDILUM DELENATII) ĐẶC HỮU QUÝ HIẾM CỦA VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG BIẾN DỊ IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ CÂY LAN HÀI HỒNG (PAPHIOPEDILUM DELENATII) ĐẶC HỮU QUÝ HIẾM CỦA VIỆT NAM Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN HỒNG ÂN Niên khóa : 2007-2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ CÂY LAN HÀI HỒNG (PAPHIOPEDILUM DELENATII) ĐẶC HỮU QUÝ HIẾM CỦA VIỆT NAM Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ QUANG LUÂN NGUYỄN HỒNG ÂN Tháng 7/2011 ii LỜI CẢM ƠN Có kết ngày hôm nay, xin cảm ơn ba mẹ, sinh thành dưỡng dục nên người, cho học hành, ủng hộ làm chỗ dựa cho sống Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn, TS Lê Quang Luân, thầy tận tình hướng dẫn em thời gian thực tập hoàn thành đề tài tốt nghiệp Em xin cám ơn thầy trường Đại học Nơng Lâm nói chung Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học nói riêng, tận tâm dạy dỗ em suốt bốn năm đại học Em xin cám chị Uyên, chị Hạnh, chị Trang, chị Nhã giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập Phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin cám ơn tập thể lớp DH07SH, bạn đồng hành suốt năm đại học i iii TÓM TẮT Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) loài lan đặc hữu vơ q có nguy tuyệt chủng nhiều lý khác Với mong muốn góp phần bảo tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm ngun liệu cho cơng tác tạo giống lồi lan Hài quý này, đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro phương pháp chiếu xạ lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) đặc hữu quý Việt Nam” thực Mục tiêu đề tài xây dựng quy trình nhân giống in vitro Lan Hài Hồng tạo dòng biến dị in vitro phương pháp chiếu xạ Để đạt mục tiêu này, nội dung thực đề tài bao gồm: nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu, nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy in vitro lan Hài Hồng, chiếu xạ mẫu chọn lọc sau chiếu xạ Các kết đạt đáp ứng mục tiêu ban đầu đề ra, cụ thể xây dựng hồn chỉnh quy trình nhân giống in vitro lan Hài Hồng từ tạo vật liệu ban đầu đến tái sinh in vitro, khảo sát tác động xạ ion hóa lên sinh trưởng phát triển mẫu in vitro, gây tạo chọn lọc 12 dòng biến dị in vitro lan Hài Hồng Giới hạn đề tài: khảo sát biến dị kiểu hình lan Hài giai đoạn in vitro iv ii SUMMARY The study namely "Study on the generation of in vitro variations of rare and endemic orchid of Vietnam (Paphiopedilum delenatii) by irradiation P delenatii, a rare and endemic orchid species is under endangered condition by many resoons Wishing to contribute to preserving and creating in vitro variated materials for breeding of this rare orchid, the mention study was carried out The targets of the project: Build a process in vitro propagation for P delenatii and gemerating in vitro variated lines by irradiation method The main contents include study of steriled condition, the in vitro propagation process, irradiation and screening the variations of irradiated P delenatii The obtained results embraces a completed process for in vitro propagation of P delenatii was built up, observation of the effect of radiation ionization on the growth and development of in vitro sampled of P delenatii, 12 variations of P delenatii were selected Limitations of study: the study was only carried out for the phenotypic variation of P delenatii Keywords: Paphiopedilum delenatii, radiation ionization, in vitro propagation, mundation iii v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung 2.1.1 Lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1.1 Phân loại 2.1.1.2 Sinh thái 2.1.1.3 Hiện trạng lan Hài Việt Nam 2.1.2 Lan Hài Hồng 2.1.2.1 Giới thiệu 2.1.2.2 Phân loại 2.1.2.3 Hình thái học 2.1.2.4 Đặc điểm sinh thái 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái quát chung nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1 Các loại muối khoáng 2.2.2.2 Vitamin vi iv 2.2.2.3 Chất điều hòa sinh trưởng 2.2.2.4 Các chất bổ sung 2.2.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô nghiên cứu sản xuất 2.3 Chọn tạo giống trồng phương pháp chiếu xạ 10 2.3.1 Thành tựu chọn tạo giống đột biến phương pháp chiếu xạ 10 2.3.2 Khái quát chung đột biến 10 2.3.3 Cơ chế gây đột biến phóng xạ 12 2.3.3.1 Tác dụng xạ ion hóa lên thể sống 12 2.3.3.2 Cơ chế gây đột biến 13 2.3.4 Gây đột biến xạ ion hóa ứng dụng tạo giống 14 2.3.4.1 Nguyên tắc gây đột biến xạ ion hóa 14 2.3.4.2 Một số ưu nhược điểm phương pháp chọn tạo giống xạ 15 2.3.6.3 Chọn lọc dòng biến dị 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu 18 3.3 Các phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu 18 3.3.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy in vitro lan Hài 19 3.2.2.1 Khảo sát mơi trường hình thành callus lan Hài 19 3.3.2.2 Khảo sát môi trường nhân nhanh protocorm like body (PLB) 20 3.3.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi 21 3.3.2.4 Khảo sát môi trường tái sinh lan Hài in vitro 23 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng xạ ion hóa lên mẫu lan Hài in vitro 23 3.3.3.1 Chiếu xạ mẫu 24 3.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau chiếu xạ 24 3.3.3.3 Tạo xác định dòng biến dị 24 3.3.4 Chọn lọc sau chiếu xạ 24 3.3.5 Xử lý thống kê số liệu 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Khảo sát điều kiện khử trùng nuôi cấy mô lan Hài 26 vii v 4.1.1 Điều kiện khử trùng mẫu 26 4.1.2 Khảo sát môi trường tạo callus 27 4.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB 28 4.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi 30 4.1.5 Khảo sát khả tái sinh hoàn chỉnh 32 4.2 Chiếu xạ tạo dòng biến dị lan Hài Hồng điều kiện in vitro 33 4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chiếu xạ tia gamma chùm ion lên mẫu 33 4.2.1.2 Tác động xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro 35 4.2.2 Gây tạo chọn lọc biến dị in vitro 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC vi viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyladenine CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora DES Diethylsulfate DMS Dimethylsulfate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EL Ethylenimine EMS Ethylmetansulphonate FAO Food Argiculture Organization IAEA The International Atomic Energy Agency IUCN The International Union for Conservation of Nature KeV Kilo electron volt LD50 Lethal Dose of 50 MeV Mega electron volt MS Murashige and Skoog NAA α-naphthaleneacetic acid NMU Nitrozomethylurea OD Optical Density P Paphiopedilum PLB Protocorm lile body TBE Tris-Boric acid - EDTA TDZ Thidiazuron UV Ultraviolet ix vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Nghiệm thức ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo callus……… 20 Bảng 3.2 Nghiệm thức ảnh hưởng chất ĐHST lên hệ số nhân PLB ……… … 21 Bảng 3.3 Nghiệm thức ảnh hưởng chất ĐHST lên hệ số nhân chồi ……… … 22 Bảng 3.4 Khảo sát môi trường tái sinh lan Hài in vitro …………………………… 23 Bảng 4.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng tuần ………… … 26 Bảng 4.2 Tình trạng mẫu trái lan Hài sau khử trùng gieo hạt 10 tuần ……….… … 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo callus từ PLB ………… …… 28 Bảng 4.4 Ảnh hưởng chất ĐHST lên hệ số nhân PLB ……………………… …… 29 Bảng 4.5 Ảnh hưởng chất ĐHST lên hệ số nhân chồi lan Hài ………….… 31 Bảng 4.6 Khả tái sinh hoàn chỉnh lan Hài ………………………… …… 32 Bảng 4.7 Giá trị LD50 mẫu lan Hài Hồng ……………………………………… 34 Bảng 4.8 Khả biến dị in vitro lan Hài sau chiếu xạ Gamma ………… 37 Bảng 4.9 Các dạng biến dị in vitro lan Hài Hồng hệ M1V1 tia ion … 37 xviii Chúng nhận thấy so với nhiều đối tượng khác việc tạo callus lan Hài khó khăn không yêu cầu điều kiện nuôi cấy mà thời gian hình thành callus dài (khoảng 90 ngày) Kết phù hợp với nghiên cứu nhân giống đối tượng lan Hài trước (Lim ctv, 1999, Duong Tan Nhut ctv, 2005) Các mẫu callus hình thành chuyển sang mơi trường khống MS khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng kết cho thấy hầu hết mẫu hình thành PLB khoảng thời gian đến 12 tuần nuôi cấy điều kiện sáng Bảng 4.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo callus từ PLB STT Nồng độ ĐHST ( mg/l) % mẫu tạo % mẫu tạo % mẫu 2,4–D TDZ callus PLB chết 0 95 0,1 95 0,5 95 1,0 97 1,0 0,1 50 47 1,0 0,5 44 52 1,0 1,0 42 53 5,0 0,1 52 46 5,0 0,5 54 42 10 5,0 1,0 56 39 11 10,0 0,1 96 2 12 10,0 0,5 82 12 13 10,0 1,0 80 12 4.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB Protocorm like body (PLB) lan coi cấu trúc sinh tạo quan Các tế bào bề mặt PLB có tiềm tương tự tế bào phơi, từ chúng dễ phát sinh nhiều đỉnh sinh trưởng bất định (Nguyễn Quang Thạch, 2009) Chính vậy, từ PLB thực trình nhân giống với hệ số nhân cao 28 Trong q trình thực nghiệm, chúng tơi nhận thấy khả nhân nhanh PLB lan Hài tỏ hạn chế bổ sung chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ, kể bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nồng độ cao hầu hết mẫu hình thành chồi thay tạo PLB Nhưng phối hợp chất điều hòa sinh trưởng khả tạo PLB lan Hài cải cách thiện rõ rệt Bảng 4.4 Ảnh hưởng chất ĐHST lên hệ số nhân protocorm like body (PLB) Nồng độ chất điều hòa STT sinh trưởng (mg/l) Môi trường Hệ số nhân BA NAA 2,0 1,0 1/2 khoáng MS 2,0 0,1 5,8 + vitamin MS 2,0 0,2 5,1 + 20% nước dừa 2,0 0,3 4,9 2,0 0,5 4,8 0,7 LSD0,05 2,0 2,2 1/2 khoáng MS + vitamin MS 2,0 0,1 10,3 + 20% nước dừa 2,0 0,2 7,4 + 170 mg/l NaH2PO4 2,0 0,3 6,9 2,0 0,5 6,6 10 0,4 LSD0,05 11 12 1/2 khoáng MS + vitamin MS 13 + 20% nước dừa 14 + 170mg/l NaH2PO4 15 2,0 2,0 2,0 2,0 + 50 mg/l oligochitosan 2,0 3,24 0,1 11,8 0,2 8,9 0,3 7,5 0,5 7,1 0,5 LSD0,05 29 Các nghiên cứu nhân giống lan Hài Lê Quang Luân (2007) (Lê Quang Luân ctv, 2007, 2011) cho thấy sử dụng BA với nồng độ mg/l cho kết nhân nhanh PLB tốt Do thí nghiệm này, sử dụng BA mg/l kết hợp với NAA để khảo sát tác động phối hợp chất điều hòa sinh trưởng lên khả nhân nhanh PLB lan Hài Kết cho bảng 4.4 cho thấy nghiệm thức phối hợp BA với nồng độ mg/l NAA với nồng độ 0,1 mg/l cho kết tạo PLB tốt Kết cho thấy việc sử dụng kết hợp BA NAA cho hiệu tạo PLB cao sử dụng kết hợp 2,4–D TDZ nghiên cứu trước (Lin ctv, 2000) Đồng thời, kết cho thấy mơi trường có bổ sung NaH2PO4 170 mg/l oligochitosan 50 mg/l cho kết tốt mơi trường khơng bổ sung hai chất Hình 4.2 Mẫu protocorm like body lan Hài Hồng sau 10 tuần cấy môi trường bổ sung NaH2PO4 170 mg/l oligochitosan 50 mg/l 4.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi Trong kỹ thuật nhân giống in vitro, lan Hài loại cho khó khăn vấn đề gia tăng hệ số nhân Trên sở tham khảo cơng trình trước nghiên cứu số đối tượng lan Hài khác (Lin ctv, 2000, Kawase, 2006), môi trường lựa chọn môi trường 1/2 MS bổ sung niacine, myo-inositol, thiamine–HCl chất điều hòa sinh trưởng (BA, NAA TDZ) Kết ghi nhận bảng 4.5 Kết nghiệm thức trình bày bảng 4.5 Kết bảng 4.5 chứng tỏ mơi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho hệ số nhân chồi cao môi trường khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Đồng thời, kết cho 30 a thất chất TDZ thể tác động mức cao NAA BA bổ sung riêng lẻ Ngoài ra, kết từ bảng 4.5 cho thấy nghiệm thức phối hợp TDZ với hàm lượng 0,5 mg/l NAA 0,1 mg/l cho hiệu nhân chồi cao Bảng 4.5 Ảnh hưởng chất ĐHST lên hệ số nhân chồi lan Hài Hồng Nồng độ chất điều hòa sinh STT trưởng (mg/l) Môi trường BA TDZ NAA Hệ số nhân chồi 1/2 khoáng MS 0 2,4 + vitamin MS 1,0 0 4,1 + 20% nước dừa 2,0 0 5,1 + 170 mg/l NaH2PO4 3,0 0 3,5 0,3 LSD0,05 1/2 khoáng MS 0 2,4 + vitamin MS 0,5 7,9 + 20% nước dừa 1,0 6,0 + 170 mg/l NaH2PO4 1,5 5,1 0,3 LSD0,05 1/2 khoáng MS 0 2,4 10 + vitamin MS 0 0,1 3,1 11 + 20% nước dừa 0 0,5 3.0 12 + 170 mg/l NaH2PO4 0 1,0 2,4 0,3 LSD0,05 13 14 15 16 1/2 khoáng MS 0,5 + vitamin MS 0,5 + 20% nước dừa 0,5 + 170 mg/l NaH2PO4 0,5 2,4 0,1 11,9 0,2 7,5 0,3 6,2 0,4 LSD0,05 31 Hình 4.3 Mẫu chồi lan Hài Hồng sau 12 tuần cấy mơi trường 1/2 khống MS, vitamin MS bổ sung 20% nước dừa, 170 mg/l NaH2PO4 4.1.5 Khảo sát khả tái sinh hoàn chỉnh Nhiều nghiên cứu nhân nhanh lan Hài phương pháp nuôi cấy mô trước cho thấy giai đoạn tái sinh hồn chỉnh thơng thường giai đoạn đơn giản quy trình, lan Hài giai đoạn khơng dễ dàng giống lan khác (Lin ctv, 2000, Kawase, 2006) Bảng 4.6 Khả tái sinh hoàn chỉnh lan Hài STT Mơi trường 1/2 khống MS +vitamin MS 1/2 khoáng MS + vitamin MS Chiều cao (cm) Chiều dài rễ (cm) + nước dừa 20% 1/2 khoáng MS + vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4 2,5+0,2 2,3+0,2 2,6+0,1 2,7+0,2 3,6+0,2 2,9+0,1 3,3+0,1 3,2+0,1 4,0+0,1 3,4+0,1 1/2 khoáng MS + vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4 +0,1 ng/l NAA 1/2 khoáng MS + vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4 +0,1 ng/l NAA + oligochitosan Thí nghiệm khảo sát hoàn chỉnh lan Hài Hồng nhằm tìm mơi trường thích hợp cho sụ tạo rễ in vitro, môi trường lụa chọn môi trường 32 1/2 khoáng MS, vitamin MS có bổ sung chất khác nước dừa, NaH2PO4, oligochitosan NAA Kết nghiên cứu trình bày bảng 4.6 Kết nhận bảng 4.6 cho thấy mơi trường có bổ sung thêm chất nước dừa, NaH2PO4, oligochitosan NAA kết thu tốt môi trường không bổ sung chất Môi trường phù hợp tái sinh hồn chỉnh lan Hài Hồng mơi trường có đầy đủ thành phần nêu gồm 1/2 khoáng MS, vitamin MS, nước dừa, NaH2PO4, oligochitosan NAA Hình 4.4 Cây lan Hài Hồng tái sinh in vitro sau cấy 12 tuần mơi trường1/2 khống MS, vitamin MS bổ sung nước dừa 20%, NaH2PO4 170 mg/l, 0,1 mg/l NAA + oligochitosan 50 mg/l 4.2 Chiếu xạ tạo dòng biến dị lan Hài Hồng điều kiện in vitro Các nghiên cứu gây tạo đột biến thực vật cho thấy độ mẫn cảm phóng xạ thực vật thay đổi tùy lồi, ngồi giai đoạn phát triển quan chịu tác động, liều chiếu yếu tố quan trọng Các quan sinh dưỡng thực vật mẫn cảm hạt khô hay hạt ngủ nghỉ (Lê Xuân Đắc, 2008, Trương Thị Bích Phượng, 2004) Tế bào thực vật có khả phân hóa thành thể nên đột biến gây tạo nuôi cấy in vitro nhân lên sinh sản sinh dưỡng 4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chiếu xạ tia gamma chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro Quan niệm trước cho liều lượng xạ cao (tỉ lệ sống sót khoảng 10%) việc thu nhận đột biến có hiệu Tuy nhiên, nghiên cứu sau cho thấy liều xạ cao thu nhiều đột biến tỉ lệ đột biến có lợi khơng 33 tăng, số cá thể chết nhiều (Trương Thị Bích Phượng, 2004) Do khuynh hướng người ta sử dụng liều phóng xạ thấp trung bình, phổ biến mức tỉ lệ sống sót từ 30% ─ 50% 4.2.1.1 Khảo sát tác động xạ gamma mẫu lan Hài Theo kết mà quan sát q trình ni cấy sau chiếu xạ mẫu chồi hồn chỉnh bị tổn thương đỉnh sinh trưởng tác động xạ làm cho mẫu chồi không phát triển Theo dõi mẫu sau chiếu xạ cho thấy mẫu chồi tỏ hiệu mẫu protocorm Các mẫu chồi sau chiếu xạ có biểu ngừng sinh trưởng chết dần theo thời gian, không tăng trưởng hồn tồn khơng có hình thành Hình 4.5 Ảnh hưởng xạ Gamma Co-60 lên sống sót in vitro (a) Mẫu PLB chồi sau tháng; (b) Mẫu PLB chồi sau tháng; (c) Mẫu sau tháng Kết từ hình 4.3 4.4 cho phép xác định giá trị LD50 mẫu lan Hài, gía trị cụ thể tóm tắt bảng 4.7 Bảng 4.7 Giá trị LD50 mẫu lan Hài Hồng STT Mẫu LD50 Sau tháng LD50 Sau tháng Protocorm 24,6 Gy 20,0 Gy Chồi 29,7 Gy 23,7 Gy Cây tái sinh - 38,0 Gy Kết thực nghiệm cho thấy liều xạ thích hợp gây đột biến lan Hài in vitro từ 20 Gy đến 40 Gy tùy theo loại vật liệu sử dụng Kết cho thấy độ mẫn cảm phóng xạ lan Hài tương tự số loài lan khác nghiên cứu trước (FNCA, 2004, Đỗ Khắc Thịnh ctv, 2010) Từ kết khảo sát ảnh 34 hưởng xạ lên sống sót mẫu lan Hài nói sau chiếu xạ khả sinh trưởng phát triển mẫu sống sót sau chiếu xạ, mẫu protocorm chồi chuẩn bị lựa chọn để chiếu xạ với số lượng lớn qua tiến hành ni cấy để phân lập biến dị xuất điều kiện in vitro Hình 4.6 Mẫu PBL chồi lan Hài Hồng bị chết sau chiếu xạ 4.2.1.2 Tác động xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro Nhiều nghiên cứu tạo giống đột biến đối tượng Cẩm chướng, Cúc, hoa Hồng… nhà nghiên cứu Nhật Bản Malaysia cho thấy khả gây tạo biến dị tia ion C+, He+… hiệu chỗ liều chiếu thấp (thường thấp khoảng 10 lần so với liều chiếu gamma Co-60) khả tạo biến dị cao số lượng mẫu chết lại (Mandal ctv, 2000, Yusuki ctv, 2008, Sugiyama ctv, 2007) Điều phù hợp cho việc chiếu xạ mẫu đối tượng có tính mẫn cảm với xạ cao Do trình nghiên cứu, kết cho thấy lan Hài nhạy cảm với xạ, số lượng mẫu chiếu lớn tỷ lệ mẫu chết cao, nên tiến hành chiếu xạ mẫu lan Hài máy gia tốc ion (Synchrotron) sử dụng tia ion C6+ có mức lượng 320 MeV, LET = 86ke V/µm, khả xuyên sâu mẫu chiếu từ ~ 2,3 mm với liều xạ từ 2-4 Gy Sau xử lý xạ ion beam, mẫu PLB lan Hài có tượng sinh trưởng chậm lại, nhiên khơng có mẫu bị chết sau chiếu xạ tất nghiệm thức có tượng hình thành chồi mơi trường thích hợp Sau 12 tháng ni cấy theo dõi cho thấy tái sinh sau chiếu xạ phát triển tốt, nhiều cá thể có biểu biến dị phát 35 4.2.2 Gây tạo chọn lọc biến dị in vitro Với mục đích tạo đột biến, mẫu lan Hài chiếu xạ dạng PLB với liều xạ chồi liều xạ 10, 15, 20, 25 30 Gy Sau 12 tháng nuôi cấy, nghiệm thức chiếu xạ PLB tia gamma Co-60 liều xạ 10, 15 20 Gy số lượng chồi in vitro hình thành từ mẫu qua chiếu xạ tốt chưa phát dạng biến dị khác thường so với giống gốc ban đầu sau 12 tháng nuôi cấy (xem bảng 4.8) Bảng 4.8 Khả biến dị in vitro lan Hài sau chiếu xạ Gamma Tần xuất Liều xạ, Số chồi Thời gian ni Dạng Số (Gy) hình thành cấy (tháng) biến dị biến dị 10 5218 12 - 0 15 6123 12 - 0 20 5323 12 - 0 STT biến dị, (x10-3) Trong nghiệm thức chiếu xạ mẫu chồi có tượng chậm phát triển chết dần theo thời gian Chính trở ngại lớn lan Hài tiến hành tạo dòng biến dị phương pháp chiếu xạ tia gamma Mặc dầu vậy, điều cho thấy lan Hài Hồng chiếu xạ gamma dạng chồi non không hiệu so với chiếu xạ dạng protocorm Chúng nhận thấy lan Hài, PLB cho thấy dạng mẫu thích hợp cho mục đích gây tạo đột biến phương pháp chiếu xạ Ngồi chiếu xạ gamma, mẫu chiếu xạ chùm tia ion máy gia tốc ion Từ kết bảng 4.9 cho thấy chưa phát dạng biến dị nghiệm thức chiếu xạ liều Gy, nghiệm thức chiếu xạ liều Gy xuất biến dị cao (3,0 x 10-3) Kết phù hợp với nghiên cứu gây đột biến ion beam loài lan khác trước (Zaiton ctv, 2006) Điều cho thấy so với lồi lan khác lan Hài có độ mẫn cảm phóng xạ trung bình 36 Bảng 4.9 Các dạng biến dị in vitro lan Hài Hồng hệ M1V1 tia ion STT Liều Số chồi Thời gian xạ hình ni cấy (Gy) thành (tháng) 400 12 400 Dạng biến dị - 12 400 2,5 - Phiến to - Bẹ màu trắng 22,5 12 30,0 0 - (e) (i) (x10-3) - Chlorophyl (a) (d) biến dị 12 (b) biến dị Tần xuất Tổng cộng Số (c) (f) (k) (h) Hình 4.7 Các dạng biến dị Hài hồng tia ion hệ M1V1 (a) Đối chứng; (b–h) Dạng biến dị bẹ màu trắng 37 Các dạng biến dị nhận bao gồm dạng biến dị chlorophyll, phiến to so với giống gốc, loại biến dị làm thay đổi bẹ từ dạng điểm hồng (đối chứng) sang màu trắng hồn tồn, hay nói cách khác, dạng biến dị điểm hồng bẹ bị Dạng hình thái giống dạng biến dị tự nhiên có hoa màu trắng lan Hài Hồng mà Averyanov đề cặp đến (Averyanov ctv, 2004) Cũng từ kết nhận từ bảng 4.9 hình 4.7 cho thấy số dạng biến dị nhận dược nói trên, xác định số dạng biến dị bẹ màu trắng biến dị chlorophyll ổn định đến hệ M1V2 (xem hình 4.8) (b) (c) (a) (d) (e) Hình 4.8 Các dạng biến dị Hài hồng tia ion hệ M1V2 (a) Đối chứng; (b, c, d) Dạng biến dị bẹ màu trắng; (e) Dạng biến dị Chlorophyll 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã xây dựng hồn chỉnh quy trình nhân giống in vitro bao gồm giai đoạn khử trùng mẫu, nhân protocorm, nhân cụm chồi tái sinh hoàn chỉnh cho lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) + Ca(OCl)2 nồng độ 10% thích hợp cho mục đích khử trùng mẫu + Môi trường tạo callus từ PLB cần bổ sung 10 mg/l 2,4D 0,1 mg/l TDZ + Môi trường nhân nhanh PLB cần bổ sung 0,5 mg/l TDZ 0,1 mg/l NAA + Môi trường nhân chồi MS có bổ sung 0,5 mg/l TDZ 0,1 mg/l NAA + Môi trường tái sinh in vitro mơi trường có chứa 1/2 khống MS, vitamin MS, NAA 0,1 mg/l, nước dừa 20%, NaH2PO4 oligochitosan - Đã xác định giá trị LD50 mẫu lan Hài Hồng sau tháng in vitro LD50 PLB sau tháng 24,6 Gy, sau tháng 20 Gy; LD50 chồi sau tháng 29,7 Gy, sau tháng 23,7 Gy; LD50 in vitro sau tháng 38 Gy - Đã xác định mẫu PLB thích hợp cho xử lý chiếu xạ lan Hài Hồng, xử lý chùm ion hiệu xạ gamma cho mục đích tạo dòng biến dị liều chiếu xạ thích hợp sử dụng tia ion C6+ Gy - Đã phát 12 dòng biến dị lan Hài Hồng hệ M1V1 5.2 Đề nghị Về nội dung nhân giống in vitro: tiếp tục khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường, độ pH, ánh sáng, nhiệt độ… đến khả hình thành callus, PLB hệ số nhân chồi lan Hài Hồng Về nội dung chiếu xạ tạo dòng biến dị: - Cần tiếp tục khảo sát tác động xạ gamma Co-60 liều xạ thấp (dưới 10 Gy) - Cần thực thêm số kỹ thuật phân tích DNA để khẳng định rõ đột biến mức phân tử dòng lan Hài Hồng biến dị chọn lọc - Cần phải tiếp tục nghiên cứu khảo sát đặc điểm dòng biến dị điều kiện ex vitro 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc Nguyễn Tiến Hiệp 2004 Lan Hài Việt Nam - Với phần giới thiệu hệ thực vật Việt Nam NXB Giao Thông Vận Tải Bùi Bá Bổng 1995 Nhân giống nuôi cấy mô NXB An Giang Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2007 Chọn giống trồng – phương pháp truyền thống phân tử NXB Nông nghiệp Lê Xuân Đắc 2008 Nghiên cứu ứng dụng biện pháp công nghệ sinh học nhằm khắc phục nhược điểm sinh lý cao cảm quang giống lúa tám Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội Nguyễn Hữu Đống, Đào Thanh Bằng ctv 1997 Đột biến: sở lý luận ứng dụng NXB Nông Nghiệp Lê Quang Luân ctv 2007 Nghiên cứu nhân giống in vitro tạo nguồn nguyên liệu gây đột biến hoa lan quý Việt nam, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ Tp Hồ Chí Minh Lê Quang Luân ctv 2011 Nghiên cứu tạo dòng hoa Địa Lan (Cymbidium) lan Hài Vệ nữ (Paphiopedilum) phương pháp chiếu xạ kết hợp kỹ thuật nhân giống in vitro Báo cáo tổng kết đề tài cấp Tp Hồ Chí Minh Vũ Như Ngọc 2005 Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân sinh học nông nghiệp NXB Nơng nhiệp Trương Thị Bích Phượng 2004 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy in vitro chiếu xạ tia gamma đến biến đổi sinh lý, hóa sinh, tế bào hình thái lúa (Oryza sativa L.) Luận án tiến sĩ sinh lý thực vật, Đại học Huế 10 Trần Duy Quý 1997 Các phương pháp chọn tạo giống trồng NXB Nơng nghiệp 11 Hồng Thị Sản 2002 Phân loại học thực vật NXB Giáo dục 12 Nguyễn Đức Thành 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp 13 Nguyễn Quang Thạch 2009 Cơ sở công nghệ sinh học-T.3 NXB Giáoục Việt Nam 14 Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài Nguyễn Văn Tó 2006 Phương pháp chọn giống trồng NXB Lao Động 15 Từ Bích Thủy 1994 Chọn tạo giống đậu nành phương pháp xử lý phóng xạ, Luận án phó tiến sĩ khoa học nơng nghiệp Đại học Nơng lâm Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Minh 16 Bùi Trang Việt 2002 Sinh lý thực vật đại cương NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Tiếng Anh 17 Cheng T., Chen J., Chang W 2004 Plant regemeration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids Plant Cell, Tissue and Orgen Culture 76: 11-15 40 18 Forum for Nuclear Cooperation in Asia (FNCA) 2004 Mutarion breeding Manual -84 19 Kawase K 2006 Clonal propagation of Paphiopedilum by tissue culture in vitro culture of ovaries Flower Stalks and Undevelop Flower Buds 20 Lin Y.H., et al 2000, Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid Plant Cell Tiss Org Cult 60: 21-25 21 Mandal A.K.A., Chakrabarty D and Datta S.K 2000, Application of in vitro techniques in mutation breeding of Chrysanthemum Plant cell, Tissue and Organ Culture 60: 33-38 22 Duong Tan Nhut, et al 2005 A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenetii propagation Propagation pf Ornamental Plants 5: 158163 23 Sugiyama M., et al (2007), Induction of flower mutant by heavy-ion beam irradiation of Cyclamen, RIKEN Accel Prog Rep., 40, 261 24 Yusuki K et al (2008) , Effect of heavy ion beam irradiation of plant growth and mutation inducton in Nicotina tabacum, Plant Biotechnology, 25,105-111 25 Zaiton A et al (2006), Effects of ion beam irradiation on Oncidium danceanum orchids, Journal of Nuclear and related technologies, 3,1-8 26 http://WWW.VNOrchids.net/ 41 PHỤ LỤC Phụ lục Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Tình trạng Lồi Đã bị tuyệt chủng P malipoense var hiepii Đã tuyệt chủng thiên nhiên P vietnamense Đang có nguy tuyệt chủng trầm trọng P delenatii Đang có nguy tuyệt chủng P.aspersum, P.barbigerum var.Lokianum, P.callosum, P.dianthum, P.emersonii, P.gratrixianum, P.hangiannum, P.helenae, P.hanryanum, P.herrmannii, P.malipoense var.Jackii, P.malipoense var.malipoense, P.micranthum, P.purpuratum, P.tralienianum Sắp tuyệt chủng P appletoniaum, P.concolor, P.hirsutissimum var Chiwuawnum, P.hirsutissimum var Esquirolai, P villosun var Annamense Thiếu dẫn liệu P.affine, P.datalanse, P.villosum var boxalli 42 ... biến (Lê Quang Luân, 2007); Nhân giống lan Hài Hằng (Paphiopedilum hangianum) Hài Tam Đảo (Paphiopedium gratrixianum) (Viện Ứng dụng Công nghệ, 2009); Lai tạo giống lan Hài (Trần Phạm Anh Tuấn,... họ Lan Orchidaceae, Lan Orchidales, phân lớp Hành Liliidae, lớp mầm Monocotyledoneae, ngành hạt kín Angiospermatophyta (Hồng Thị Sản, 2002, Leonid Averyanov ctv, 2004) Lan Hài Hồng xếp nhóm lan... thời gian khác để khảo sát thời gian thích hợp cho mục đích khử trùng mẫu - Đối với đỉnh sinh trưởng, phát hoa lan Hài thời gian khử trùng thực thời gian 10, 15, 20 25 phút 18 - Đối với lan Hài,