NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ HÌNH THÁI TRÊN CÂY ĐỊA LAN TÍM HỘT (CYMBIDIUM LA BELL “ANNA BELLE”) IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA 60CO

1 MỞ ĐẦU Chọn giống thực vật bằng cách gây đột biến nhân tạo là một phương pháp đã được chứng minh là có hiệu quả cao, góp phần tạo nên những tính trạng quý của cây trồng.. Lịch sử chọn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN HUỲNH PHƯƠNG UYÊN

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ HÌNH THÁI TRÊN CÂY

ĐỊA LAN TÍM HỘT (CYMBIDIUM LA BELL “ANNA BELLE”)

IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA 60CO

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số chuyên ngành: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUANG LUÂN

Tp Hồ Chí Minh, Năm 2011

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng 

Hình 1.2 Sự phát triển của chọn giống đột biến qua các giai đoạn 

Hình 1.3 Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2011 

Hình 1.4 Tỷ lệ các loại cây đột biến trên thế giới vào năm 2009 

Hình 1.5 Một số loài hoa đột biến trên thế giới 

Hình 1.6 Mô hình gây tạo đột biến tại Malaysia và Nhật Bản 

Hình 1.7 Giống hoa cúc đột biến bằng công nghệ bức xạ tại Việt Nam 

Hình 1.8 Quy trình chọn giống Chimera bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi

cấy in vitro 

Hình 1.9 Hình ảnh mô tả cây Địa lan 

Hình 1.10 Một số giống Địa lan đang thương phẩm tại Việt Nam  

Hình 1.11 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật RAPD

Hình 2.1 Cây Địa lan Tím hột dùng trong nghiên cứu 

Hình 2.2 Sơ đồ xử lý mẫu Địa lan 

Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên Địa lan 

Hình 2.4 Sơ đồ gây tạo biến dị in vitro cây Địa lan

Hình 3.1 Mẫu Địa lan tái sinh từ chồi đỉnh và cành phát hoa 

Hình 3.2 Sự hình thành callus của Địa lan 

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST lên hệ số nhân PLB 

Hình 3.4 Sự hình thành protocorm cây Địa lan 

ix

Hình 3.5 Ảnh hưởng của chất sự phối hợp BA (2mg/l) với NAA và TDZ lên hệ số

nhân PLB trên môi trường MS 

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên sự nhân chồi của cây Địa lan 

Hình 3.7 Cụm chồi Địa lan được hình thành trên môi trường MS sau 4 tuần 

Hình 3.8 Khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Địa lan trên các môi trường 

Hình 3.9 Cây tái sinh Địa lan hoàn chỉnh 

Hình 3.10 Quy trình nhân nhanh in vitro cây Địa lan Tím hột 

Hình 3.11 Ảnh hưởng của bức xạ Gamma Co-60 lên các mẫu Địa lan in vitro 

Hình 3.12 Mẫu PLB bị chết sau khi chiếu xạ liều cao 

Hình 3.13 Các chồi đỉnh của PLB bị chết sau khi chiếu xạ liều thấp 

Hình 3.14 Sự hình thành phôi của từ mẫu PLB địa lan sau khi chiếu xạ 

Hình 3.15 Các dạng biến dị chlorophyll của cây Địa lan 

Hình 3.16 Các dạng biến dị lá dài của cây Địa lan 

Hình 3.17 Các dạng biến dị lá ngắn của cây Địa lan 

Hình 3.18 Các dạng biến dị nhiều lá của cây Địa lan 

Hình 3.19 Các dạng biến dị bẹ lá màu tím của cây Địa lan 

Hình 3.20 Cây con chiếu xạ đang theo dõi ở nhà lưới 

Hình 3.21 Hình ảnh DNA Địa lan trên gel 

Hình 3.22 Kết quả RAPD-PCR với primer OPD-07 

Hình 3.23 Mối quan hệ di truyền của các dòng nghiên cứu 

79

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

Công trình liên quan đến đề tài:

Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Thị Thu Hà, Lê Quang Luân (2011)

Nghiên cứu tạo dòng biến dị hình thái in vitro ở cây địa lan Tím hột (Cymbidium La Bell “Anna Belle”) bằng phương pháp chiếu xạ γ-co-60, Tuyển tập Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ IX

Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Thị Thu Hà, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn

Thị Thúy Loan, Lê Quang Luân (2009), Nghiên cứu hiệu ứng kích thích tăng

trưởng của β-oligochitosan chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ trên Địa lan (Cymbidium Labell “Anna Belle”) in vitro, Kỷ yếu Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ VIII,

Nha Trang

Lê Quang Luân, Võ Thị Thu Hà, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Duẩn,

Nguyễn Thị Thúy Loan (2009), Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan Hài đặc hữu Việt Nam (Paphiopedilum delenatii), Kỷ yếu Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ VIII, Nha Trang

Lê Quang Luân, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Thị Thu Hà, (2011)

Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro cây lan Hài (Phiopedilum) bằng bức xạ ion hóa, Tuyển tập Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ IX

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số giống đột biến của một số nước trên thế giới năm 2011 

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro Địa lan gần đây trên thế giới 

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa lan tại Việt Nam

Bảng 2.1 Các nghiệm thức khảo sát khả năng tạo callus 

Bảng 2.2 Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB với nồng độ chất

ĐHST khác nhau 

Bảng 2.3 Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB dưới sự phối hợp

của các chất ĐHST 

Bảng 2.4 Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân chồi 

Bảng 2.5 Các nghiệm thức khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh 

Bảng 2.6 Ký hiệu mẫu thực hiện phản ứng RAPD-PCR

Bảng 3.1 Tình trạng mẫu chồi đỉnh Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần 

Bảng 3.2 Tình trạng mẫu phát hoa cây Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần 

Bảng 3.3 Khả năng tạo callus từ PLB của cây Địa lan 

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB 

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất ĐHST đến hệ số nhân PLB 

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên sự nhân chồi 

Bảng 3.7 Khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Địa lan trên 4 loại môi trường 

Bảng 3.8 Các dạng biến dị in vitro của cây Tím hột sau khi chiếu xạ gamma 

Bảng 3.9 Các dòng biến dị qua thời gian theo dõi và nhân dòng đến M1V2  

vii

Bảng 3.10 Khả năng biến dị in vitro của chồi cây lan sau khi chiếu xạ gamma 

Bảng 3.11 Nồng độ và độ tinh sạch của DNA Địa lan 

Bảng 3.12 Các đoạn mồi thể hiện tính đa hình phản ứng RAPD-PCR 

Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn DNA của phản ứng RAPD 

Bảng 3.14 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Địa lan biến dị 

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

IAEA International Atomic Engnergy Agency

LD50 Lethal Dose 50%

LS Linsmaier and Skoog

MS Murashige and Skoog

NAA α-naphthaleneacetic acid

OD Optical Density

PCR Polymerse Chain Reaction

PLB Protocorm like body

RAPD Random Amplified Polymorphic DNAs

RFLP Retriction Fragment Length Polymorphisms

TBE Tris-Boric acid-EDTA

TDZ Thidiazuron

UV Ultraviolet

VW Vacine and Went

i

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Mục lục i 

Danh mục các chữ viết tắt v 

Danh mục các bảng vi 

Danh mục các hình vẽ, đồ thị viii 

Mở đầu 1 

Chương 1 TỔNG QUAN 3 

1.1 Phương pháp tạo giống cây trồng mới bằng phóng xạ 3 

1.1.1 Các khái niệm chung 3 

1.2.2 Lịch sử chọn giống đột biến 4 

1.1.3 Đột biến và các tác nhân gây đột biến 5 

1.1.3.1 Vai trò của chọn giống bằng phương pháp vật lý 5 

1.1.3.2 Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến 6 

1.1.3.3 Cơ chế gây đột biến do phóng xạ 8 

1.1.3.4 Hiệu ứng sinh học của bức xạ lên cơ thể sống 9 

1.1.4 Thành tựu của công nghệ bức xạ trong việc chọn tạo giống mới 11 

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu đột biến trên thế giới 11 

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu đột biến tại Việt Nam 15 

1.1.5 Chọn giống bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro 17 

1.2 Tổng quan về cây địa lan (Cymbidium) 19 

1.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 19 

1.2.2 Đặc điểm phân loại học 20 

ii

1.2.3 Đặc điểm hình thái của Địa lan 20 

1.2.4 Tình hình nghiên cứu cây Địa lan 22 

1.2.5 Giá trị của Địa lan và tình hình sản xuất tại Việt Nam 25 

1.3 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 26  

1.3.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật 26 

1.3.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 27 

1.3.3 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 29 

1.3.3.1 Ý nghĩa sinh học cơ bản 29 

1.3.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 30 

1.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc dòng biến dị 30  

1.4.1 Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 30 

1.4.2 Ứng dụng chỉ thị RAPD trong chọn giống 31 

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35 

2.1 Vật liệu 35  

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 35 

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 35 

2.1.3 Hóa chất 37 

2.1.4 Các điều kiện thí nghiệm 37 

2.2 Phương pháp nghiên cứu 38  

2.2.1 Nội dung 1 Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan Tím hột 39 

2.2.1.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm 39 

iii

2.2.1.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB 40 

2.2.1.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB 41 

2.2.1.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan 42 

2.2.1.5 Thí nghiệm 5 Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro của cây Địa lan 43 

2.2.2 Nội dung 2 Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan 43 

2.2.2.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu Địa lan 43 

2.2.2.2 Thí nghiệm 2 Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị 45 

2.2.3 Nội dung 3 Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng kỹ thuật RAPD 46 

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 48 

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 

3.1 Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan 49 

3.1.1 Điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm 49 

3.1.2 Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB 51 

3.1.3 Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB 52 

3.1.4 Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan 56 

3.1.5 Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh 59 

3.2 Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan in vitro 62 

3.2.1 Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu Địa lan 62 

3.2.2 Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị 65 

iv

3.3 Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng

kỹ thuật RAPD 71 

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA 71 

3.3.2 Kết quả phân tích RAPD-PCR 73 

3.3.3 Tương quan di truyền của các mẫu Địa lan dựa trên phân tích RAPD 75 

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 

4.1 Kết luận 77  

4.2 Đề nghị 78  

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 79 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 

PHỤ LỤC

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Tiến sĩ Lê Quang Luân Thầy là người đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu, những bài học thật bổ ích trong học tập, công việc và nghiên cứu khoa học, là người đã định hướng, giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin cảm ơn quý Thầy, Cô đang công tác tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Thầy, Cô từ các Trường Đại học khác đã giảng dạy tại trường và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian qua

Xin cảm ơn các anh chị, các bạn đang công tác tại Phòng Sinh học Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn của mình

Cảm ơn các bạn lớp Di truyền k19, những người đã cùng học tập và sẵn sàng giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ và các em đã khuyến khích và hỗ trợ tôi có được ngày hôm nay

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011

Nguyễn Huỳnh Phương Uyên

1

MỞ ĐẦU

Chọn giống thực vật bằng cách gây đột biến nhân tạo là một phương pháp đã được chứng minh là có hiệu quả cao, góp phần tạo nên những tính trạng quý của cây trồng Kỹ thuật này hiện nay là một trong những phương pháp tạo và chọn giống có nhiều ưu điểm và đã được sử dụng rộng rãi trên khoảng 60 quốc gia từ khắp các Châu lục Theo nguồn dữ liệu thống kê các giống đột biến của IAEA (mutation variaties database) đến năm 2011 toàn thế giới đã tạo ra 3112 giống đột biến trên nhiều đối tượng cây trồng từ 170 loài thực vật mà chủ yếu là các loại Ngũ cốc [16], [23], [40], [42], Khoai [48], Mè [11], Cam [24] v.v trong đó các giống tạo

ra bởi phóng xạ gamma chiếm khoảng 60% [36], [53]

Bên cạnh đó, phương pháp tạo giống bằng tác nhân phóng xạ cũng đã tạo ra nhiều giống hoa đa dạng từ các giống mẹ ban đầu bao gồm: Cúc [39], [53], Cát tường [4], Anh thảo [50], Hồng môn [46], Phong lan [21], v.v với nhiều màu sắc đa dạng Riêng giống Địa lan hiện nay chỉ có 2 giống đột biến được công bố trong đó

có một giống do các nhà tạo giống Nhật Bản và Hàn Quốc tạo ra bằng phương pháp

chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro [53]

Mặc dù bắt đầu chậm hơn so với một số nước trên thế giới, tuy nhiên Việt Nam là nước đứng thứ 8 trên thế giới và thứ 3 trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương về số lượng giống đột biến năm 2011 với 55 giống được công bố chính thức

và được IAEA công nhận [53] Chính vì vậy, hiện nay hướng nghiên cứu này đang được Bộ Khoa học Công nghệ tăng cường đầu tư với quy mô lớn và hiện đại Nhằm mục tiêu tăng cường nghiên cứu giống đột biến nói riêng và ứng dụng Công nghệ

Bức xạ trong Nông nghiệp nói chung Thủ tướng Chính phủ đã ký quyết định “Quy hoạch chi tiết phát triển ứng dụng bức xạ trong nông nghiệp đến năm 2020” trong

đó có mục tiêu sẽ tạo ra và đưa vào sản xuất 3-4 giống đột biến cây trồng mới hàng năm

2

Mặc khác, Cymbidium đã từ lâu được tôn vinh là “Nữ hoàng của các loài hoa”

Đây không những là loài hoa đẹp mà còn có giá trị về khoa học và mỹ thuật Hiện nay, Địa lan đang rất được ưu chuộng trong nước cũng như trên Thế giới Ở nước

ta, loài cây này chủ yếu được trồng ở Đà Lạt và được xuất khẩu với số lượng lớn sang thị trường các nước khác như Mỹ, Nhật, Singapore, v.v và đã mang lại nguồn thu nhập tương đối lớn cho người trồng hoa

Mặc dù vậy, hiện nay tình hình xuất khẩu loại hoa này đang gặp khó khăn vì rào cản về bản quyền giống cây trồng mà nguyên nhân chính là hầu hết các giống Địa lan thương phẩm đang được trồng trong nước chủ yếu là các giống nhập nội Chính vì vậy, việc tạo ra các giống hoa Địa lan mang thương hiệu “Việt” là yêu cầu cấp bách đối với các nhà chọn giống trong giai đoạn hiện nay

Từ yêu cầu đặt ra là cần phải tạo ra những giống Địa Lan để cung cấp cho thị

trường trong nước cũng như đáp ứng mục tiêu xuất khẩu Đề tài “Nghiên cứu tạo

dòng biến dị hình thái trên cây địa lan Tím hột (Cymbidium La Bell “Anna

Belle”) in vitro bằng phương pháp chiếu xạ gamma 60 Co” được tiến hành Mục

đích của nghiên cứu này là là gây tạo và chọn lọc các dòng Địa Lan Tím hột biến dị

hình thái in vitro để làm nguyên liệu cho quá trình chọn tạo các giống Địa lan đột

biến mới có tính ưu việt mang thương hiệu “Việt” bằng phương pháp chiếu xạ gamma 60Co

3

Chương 1-TỔNG QUAN

1.1 PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG MỚI BẰNG PHÓNG XẠ 1.1.1 Các khái niệm chung

Phóng xạ: Phóng xạ là hiện tượng một hạt nhân tự động phóng ra những bức

xạ gọi là tia phóng xạ và biến thành hạt nhân khác Quá trình này phát ra năng lượng Hiện tượng phóng xạ do các nguyên nhân bên trong hạt nhân gây ra và hoàn toàn không phụ thuộc vào các tác động bên ngoài (áp suất, nhiệt độ, v.v.)

Công nghệ bức xạ: Công nghệ bức xạ là công nghệ sử dụng bức xạ làm

nguồn năng lượng Công nghệ bức xạ hiện tại chủ yếu là sử dụng nguồn bức xạ là

60Co, dòng điện tử gia tốc (electron beam- EB) và ion beam

Liều hấp thụ: Nếu cùng một liều chiếu của cùng một bức xạ ion hóa thì các

môi trường khác nhau hấp thụ những lượng năng lượng khác nhau Liều hấp thụ nhằm mục đích nói lên năng lượng hấp thụ bởi môi trường vật chất bị chiếu bức xạ ion hóa

Đơn vị của liều hấp thụ là rad (radiation absorption dose) là liều bức xạ của bất kỳ loại bức xạ nào tạo ra trong môi trường vật chất mà nó truyền qua với mức hấp thụ năng lượng 100erg/g

Đơn vị SI của liều hấp thụ là Gy (Gray) là liều bức xạ của bất kỳ loại bức xạ nào tạo ra trong môi trường vật chất mà nó truyền qua với mức hấp thụ năng lượng

là 1J/kg

Có thể quy đổi như sau: 1rad = 10-2 J/kg = 10-2 Gy, 1Gy = 100rad

Từ liều hấp thụ người ta đưa ra khái niệm suất liều hấp thụ hay còn gọi là suất liều Suất liều là liều hấp thụ trên một đơn vị thời gian, ký hiệu là r/s hoặc Gy/s

4

1.2.2 Lịch sử chọn giống đột biến

Chọn giống cây trồng hay thực vật nói chung (plant breeding) là một lĩnh vực quan trọng của sản xuất nông nghiệp; mục đích của nó là tạo ra ngày càng nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu được các điều kiện bất thuận (như sâu bệnh, hạn, úng, nóng, rét, v.v) Về thực chất, đó là sự tiến hoá của thực vật do con người điều khiển, được hình thành từ trong thực tiễn trồng trọt qua hàng ngàn năm kể từ khi con người bắt đầu mò mẫm "thuần hoá" cây trồng dựa theo kinh nghiệm

Cùng với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, đặc biệt là sự phát triển của

di truyền học trong suốt một thế kỷ qua, công tác chọn tạo giống cây trồng đã xây dựng được một nền tảng khoa học vững chắc và không ngừng được hoàn thiện Nhờ

đó đã tạo ra hàng loạt các giống cây trồng mới, nhất là các giống ngũ cốc, góp phần xoá đói giảm nghèo mang lại cuộc sống ấm no và cải thiện sức khoẻ cho con người Vào năm 1895-1896, Becquerel đã phát hiện ra hiện tượng phóng xạ làm cơ sở cho các nghiên cứu nhằm ứng dụng phóng xạ trong lĩnh vực sinh học và nông nghiệp Cùng năm đó, Hugo De Vries đã đề xuất việc sử dụng phóng xạ nhằm mục đích gây đột biến

Năm 1901, Hugo De Vries công bố công trình nghiên cứu đột biến trên cây Oenothera lamarckiana và đưa ra "thuyết đột biến" Đến năm 1904, cũng chính tác giả này lại đề nghị sử dụng tia X để tạo ra các đột biến

Năm 1927, Herman Muller đưa ra được bằng chứng xác thực đầu tiên về chiếu

xạ ion hoá gây ra các đột biến ở ruồi giấm Drosophila Cũng trong thời gian đó

Natxon và Philipop phát hiện ra tia X có khả năng gây ra biến dị di truyền ở vi nấm Năm 1928, Lewis Stadler tiến hành gây đột biến ở lúa đại mạch và ngô bằng tia X và tia gamma đồng thời đã chỉ rõ tần số đột biến cảm ứng phụ thuộc vào liều

xạ tổng số của tác nhân gây đột biến

Từ năm 1938-1948, hàng loạt các công trình phát hiện ra các chất đột biến

5

của Sakharov (1938-1939), Rapoport (1940-1948), Gustafson (1940-1948), v.v được công bố Đó là những chất hóa học như Ethylenimine (EI), Diethylsulfate (DES), dimethylsulfate (DMS), Nitrosomethylurea (NMU), Nitrosoethylurea (NEU), v.v trên các động vật, vi sinh vật và thực vật

Từ năm 1953-1965: Kể từ khi James Watson và Francis Crick khám phá ra

mô hình cấu trúc phân tử DNA, các nhà di truyền học và hoá sinh tập trung chủ yếu vào nghiên cứu thành phần, cấu trúc hoá học của nucleic acid, cơ chế phân tử của quá trình phát sinh đột biến Các tác giả đều đi đến kết luận rằng các quá trình biến đổi trên phân tử DNA đều liên quan đến quá trình sao chép, tự phục hồi và xuất hiện các đột biến

Từ năm 1965 đến nay: Hàng loạt công trình nghiên cứu về đột biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật với các tác nhân vật lý và hoá học khác nhau như tia X, tia gamma, chùm neutron, tia laser, v.v cùng các hợp chất alkyl hoá, các hợp chất nitroso, v.v đã được công bố

1.1.3 Đột biến và các tác nhân gây đột biến

1.1.3.1 Vai trò của chọn giống bằng phương pháp vật lý

Hiện nay, nguồn gene của các giống cây trồng trong nông nghiệp đang nghèo nàn, không đáp ứng đủ nhu cầu và đang bị thái hóa dần Nguồn gene này không thể thỏa mãn một cách đầy đủ trước nền nông nghiệp hiện tại và tương lai, trước nguy

cơ biến đổi khí hậu, nền kinh tế, xã hội và nhu cầu công nghiệp Yêu cầu của các nước đang phát triển về nguồn giống cây mới và năng suất cao đang trở nên cấp bách

Trước yêu cầu trên, giống cây trồng cần phải thay đổi một hoặc một vài đặc điểm của nguồn gene bằng phương pháp gây tạo đột biến nhằm mục đích cải tiến, tạo ra nguồn gene mới phù hợp với các vấn đề của xã hội hiện đại Thực ra, 30 năm sau khi Gregor Mendel chứng minh rằng các nhân tố có tính di truyền được gọi là gene đã truyền lại một cách nguyên vẹn từ thế hệ này sang thế hệ khác thì phóng xạ

6

ion hóa đã được khám phá 30 năm sau đó, phóng xạ ion hóa được minh chứng rằng

có thể gây ra đột biến, thay đổi các gene mà trước đó được tin rằng ổn định, không

bị biến đổi Từ đó, công nghệ tạo giống đột biến phát triển mạnh mẽ và mở ra những lĩnh vực mới trong nghiên cứu di truyền dựa trên nền tảng của di truyền phân

tử hiện đại Các tia X, tia gamma, chùm neutron và các phóng xạ ion hóa khác đã được sử dụng như là một tác nhân vật lý bổ sung thêm vào công nghệ tạo giống đột biến mà trước đó thường sử dụng tác nhân hóa học

Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến tự sinh từ 1×10-8 đến 1×10-5 trong khi đó, phóng

xạ có thể làm thay đổi tính di truyền của sinh vật và gia tăng tần số đột biến lên từ 1×10-5 đến 1×10-2 Mặt khác, các biến dị thu được không phải là GMO (sinh vật chuyển gen) bởi vì phương pháp này không đưa yếu tố lạ vào bộ gene của sinh vật chủ mà chỉ làm biến đổi những đặc tính sẵn có trong gene

Ưu điểm chính của phương pháp này là các kiểu di truyền cơ bản của giống được giữ lại trong khi những đặc tính cải tiến được thêm Giống cải tiến được tạo ra trong một thời gian ngắn nếu so với phương pháp chọn giống truyền thống nhưng lại cho kết quả tương đương Với phương pháp chọn giống bằng phóng xạ, những chủng loại cây từ nguồn nguyên liệu ban đầu được tạo ra vô cùng phong phú với các đặc tính như: Năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh,

có khả năng đề kháng với những yếu tố bất lợi của môi trường Đặc biệt trong tình hình biến đổi khí hậu như hiện nay, yêu cầu tạo ra các giống cây chịu phèn, chịu mặn và chịu hạn đang cấp thiết

1.1.3.2 Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến

Tác nhân đột biến là nguồn gốc căn bản cho tất cả các biến đổi trong cơ thể sinh vật Các biến đổi này chính là nguyên nhân gây ra hiện tượng đột biến không chỉ cần thiết trong quá trình tiến hóa mà còn là phương pháp được sử dụng nhằm mục tiêu gây tạo đột biến trong chọn giống thực vật tạo ra các dạng biến dị mới bổ sung thêm vào nguồn giống cây trồng

7

Các tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố sinh học, hoá học và vật lý Các nhân tố này có thể làm gia tăng tần số đột biến lên 10 đến 100 nghìn lần

Các loại tác nhân thường dùng bao gồm:

− Tác nhân hóa học là các hóa chất: DES, EMS, iPMS, EI, NEU, MNU, NaM3, 1,4-Biadiazo-acetyl Butane, v.v

− Tác nhân vật lý bao gồm: Tia X (từ đèn UV), phóng xạ điện từ (tia X từ máy X-quang, tia gamma từ nguồn 60Co và 137Cs, phóng xạ hạt (chùm neutron nóng hoặc chậm từ lò phản ứng, chùm neutron nhanh từ lò phản ứng, các hạt beta phóng ra từ 32P và 35S), ion beam và electron beam [tr 5, 29] Các tác nhân vật lý tạo ra số lượng giống đột biến khoảng 87% trong tổng số giống đột biến

Hình 1.1 Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng

Theo thống kê của IAEA (International Atomic Energy Agency) năm 2005, nếu chỉ tính riêng trong lĩnh vực tạo giống mới bằng các tác nhân đột biến khác nhau thì đóng góp của các tác nhân bức xạ chiếm đến 77,7% (xem Hình 1.1) Trong

đó, tia gamma là tác nhân có đóng góp lớn nhất trong phương pháp tạo giống đột

8

biến, chiếm 60,3%, tiếp theo phương pháp gây tạo đột biến bằng nuôi cấy in vitro

đóng góp 15,7 %, sau đó là tia X chiếm 9,5% Tác nhân hóa học mặc dù được sử dụng từ rất lâu nhưng tỷ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6% trong khi đó tia ion mới được

sử dụng gần đây nhưng đã đóng góp tỷ lệ 5,8%

1.1.3.3 Cơ chế gây đột biến do phóng xạ

Các phóng xạ gây ra quá trình ion hóa tạo ra những biến đổi về mặt hóa học, phá hủy cấu trúc nguyên vẹn của nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, tạo ra các biến đổi về mặt di truyền, là nguyên nhân gây đột biến

Sự tương tác của các tia phóng xạ lên hệ thống gây nên sự biến đổi cấu trúc DNA làm cơ thể bị đột biến Có hai giả thuyết chính để giải thích hiện tượng này là thuyết Bia và thuyết gốc tự do

Thuyết Bia: Sự xuất hiện các sai lệnh ở DNA xảy ra một các tức thời với xác

xuất phụ thuộc vào cơ hội bắn trúng “bia” của tia phóng xạ Dựa vào thuyết này, người ta giải thích được mối liên quan giữa liều chiếu xạ và tần số xuất hiện đột biến Thuyết này cũng là nền tảng xây dựng các nguyên tắc của di truyền phóng xạ Tuy nhiên, các nghiên cứu sau này đã chứng minh thuyết “bia” chưa đầy đủ do nó chưa giải thích được các yếu tố của điều kiện môi trường và điều kiện sinh lý của cơ thể có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả của quá trình xử lý phóng xạ

Thuyết gốc tự do: Thuyết này cho rằng tác động gây đột biến trên tế bào sống

của tia phóng xạ là tác động gián tiếp Thoạt đầu, tia phóng xạ ion hóa nước, vốn là thành phần vật chất chủ yếu trong mọi tế bào sống Nước bị ion hóa tạo thành các gốc tự do, các gốc tự do có thể tương tác với nhau tạo thành chất chất oxy hóa mạnh đồng thời tương tác với các phân tử sinh học trong tế bào Các tương tác này nếu đủ mạnh và số lượng đủ nhiều thì sẽ gây ra các biến đổi trong thành phần và số lượng của các nucleotide của phân tử DNA Tùy theo nguồn năng lượng dự trữ của gốc tự

do mà có thể gây ra các biến đổi lớn trong cấu trúc của phân tử DNA hoặc các đột biến nhỏ trong thành phần nucleotide của gene (còn gọi là đột biến điểm) Như vậy,

9

tuy chưa đầy đủ nhưng nếu giải thích cơ chế gây đột biến theo thuyết này có thể giải thích được sự phụ thuộc của tần số đột biến vào liều chiếu xạ, điều kiện môi trường, điều kiện sinh lý của cơ thể, v.v

Để tạo ra các giống cây đột biến bằng công nghệ này, tùy theo từng đối tượng cây trồng người ta có thể chiếu xạ trực tiếp các bộ phận của cây như mầm, chồi, hạt phấn, nhụy, hạt giống hay toàn bộ cây ở những giai đoạn khác nhau Bên cạnh đó có thể kết hợp chiếu xạ với phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để tạo callus, PLB, v.v sau đó chiếu tia xạ [tr.5, 29] Tùy vào liều lượng và thời gian xử lý chiếu

xạ sẽ tạo ra những đứt gãy nhiễm thể hoặc những thay đổi về cấu trúc gene Những mẫu sau khi chiếu xạ có thể được gieo trồng trực tiếp hoặc được nhân lên và tái sinh

cây in vitro Qua đánh giá, lai tạo, chọn lọc nhiều thế hệ ngoài đồng ruộng những

dòng, giống ưu việt sẽ được nhân lên để sản xuất đại trà

Các tác nhân phóng xạ có thể gây ra các dạng đột biến sau: Đứt đơn chuỗi DNA, đứt kép chuỗi DNA, đứt liên kết giữa các base N bắt cặp, thay đổi các base Cytosine bằng Uracyl, tạo liên kết mới giữa các base N không bắt cặp, v.v Tuy nhiên, hậu quả của đột biến phụ thuộc vào vị trí của nó trong gene Do đó, không phải tất cả các đột biến đều dẫn đến những thay đổi về kiểu hình

1.1.3.4 Hiệu ứng sinh học của bức xạ lên cơ thể sống

Bức xạ ion hóa là một trong những tác nhân làm tăng tần số đột biến Khi bị chiếu xạ, các thành phần của tế bào dễ bị ảnh hưởng bao gồm: màng, nhân, ty thể và lưới nội chất Sau khi chiếu xạ, tế bào có thể lâm vào một trong các tình trạng sau: xuất hiện các tế bào bất thường, ngừng phân chia (do tổn thương trong bộ máy di truyền) hoặc chết Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái cũng như thay đổi chức năng trong tế bào và mô Nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước cho rằng bức xạ không tạo ra chức năng mới trong tế bào và mô mà bức xạ làm thay đổi các chức năng sẵn có hay làm xuất hiện các chức năng trước đó tiềm tàng

10

Những đặc điểm chung của các hiệu ứng sinh học dưới tác dụng của bức xạ ion hóa có thể liệt kê như sau:

− Cách tác dụng của bức xạ: Bức xạ có thể gây ra hiệu ứng tại chỗ hay trực

tiếp, toàn thân hay gián tiếp

− Thời gian xuất hiện của hiệu ứng: Bao gồm hiệu ứng tức thời (biểu hiện

ngay sau khi chiếu xạ) và hiệu ứng chậm (các hiệu ứng xuất hiện sau một thời gian tiềm ẩn)

− Tính chất của hiệu ứng: Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái

cũng như thay đổi chức năng Tuy nhiên, bức xạ không tạo ra các chức năng mới trong tế bào và tổ chức mà nó có tác dụng thay đổi chức năng sẵn

có trong tế bào

− Khả năng hồi phục bức xạ ion hóa: Gây ra các hiệu ứng thuận nghịch và

không thuận nghịch Các hiệu ứng không thuận nghịch gọi là tổn thương phóng xạ

Tương tác của bức xạ ion hóa với cơ thể sống là kích thích và ion hóa các phân tử và nguyên tử Các tổ chức tế bào của cơ thể sau khi bị kích thích bởi năng lượng bức xạ sẽ biến đổi qua hai giai đoạn bao gồm giai đoạn hóa lý và giai đoạn sinh học:

− Giai đoạn hóa lý: Giai đoạn này rất ngắn (từ 10-13 đến 10-16giây), trong giai đoạn này, các phân tử sinh học chịu tác động trực tiếp và gián tiếp của bức

xạ ion hóa Các tổn thương này gọi là tổn thường hóa sinh

+ Tác dụng trực tiếp bức xạ trực tiếp ion hóa và kích thích các phân tử sinh học, gây biến đổi cấu trúc và làm tổn thương các phân tử đó

+ Tác dụng gián tiếp (theo thuyết gốc tự do): bức xạ ion hóa tác dụng lên các phân tử nước trong tế bào tạo ra các ion H+, OH-, các gốc tự do

OH•, H• và các sản phẩm oxy hóa mạnh như H2O2 và HO2 Các sản phẩm của quá trình này rất hoạt động về mặt hóa học, tác động và làm

11

tổn thương lên các phân tử sinh học Trong giai đoạn này một số phân

tử quan trọng như enzyme, nucleoprotein sẽ bị tổn thương

− Giai đoạn sinh học: nếu các tổn thương hóa sinh xảy ra trong giai đoạn hóa

lý không hồi phục được sẽ gây ra những thay đổi trong chuyển hóa dẫn đến những thay đổi về hình thái và chức năng Giai đoạn này có thể kéo dài hay ngắn tùy thuộc vào mức độ tế bào hay tổ chức bị tổn thương (từ vài giây đến hàng chục năm)

Trong cùng một cơ thể không phải tất cả các tế bào đều nhạy cảm như nhau với bức xạ ion hóa Năm 1906, Bergonia và Tribondeau đã đưa ra một định luật:

“Độ nhạy của tế bào trước bức xạ tỷ lệ thuận với khả năng sinh sản và tỉ lệ nghịch với mức độ biệt hóa của chúng”

1.1.4 Thành tựu của công nghệ bức xạ trong việc chọn tạo giống mới

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu đột biến trên thế giới

Phương pháp tạo giống bằng thực nghiệm được coi là một trong các thành tựu

to lớn của thế kỷ 20 Từ năm 1950 đến nay, số lượng các giống đột biến không ngừng gia tăng trong đó giai đoạn tăng nhanh nhất là từ năm 1981-1990 (xem Hình 1.2) Đến đầu thập niên 1990 đã có 1364 giống đột biến được tạo ra trên thế giới, trong đó khoảng 90% là do xử lý bức xạ [53] Đến năm 2009 đã có hơn 3100 giống mới của 170 loài được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến được công bố bởi hơn

60 quốc gia khác nhau và trên các vùng Châu lục khác nhau [36] Trong năm 2010

bổ sung thêm 12 giống đột biến và năm 2011 bổ sung thêm 4 giống (trong đó Việt Nam bổ sung thêm 3 giống hoa cúc) nâng tổng số giống lên đến 3212 giống đột biến trên toàn thế giới

Tỷ lệ các giống đột biến được tạo ra ở các Châu lục cũng khác nhau trong đó nhiều nhất là Châu Á (chiếm 60,31%) và thấp nhất là Châu Úc (0,31%) (xem Hình 1.3) Bên cạnh đó, các giống đột biến phần lớn tập trung ở các giống cây ngũ cốc

12

(chiếm 70%), sau đó là các cây họ đậu (18%), cây có dầu (4%) và những loại khác (xem Hình 1.4)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Hình 1.2 Sự phát triển của chọn giống đột biến qua các giai đoạn

Hình 1.3 Tỷ lệ các giống đột biến trên các Châu lục vào năm 2011

Hình 1.4 Tỷ lệ các loại cây đột biến trên thế giới vào năm 2009

13

Theo cơ sở dữ liệu thống kê các giống đột biến của IAEA [53] hiện nay, Trung

Quốc đang là nước có số lượng giống đột biến cao nhất thế giới với 808 giống được

tạo ra, tiếp theo là Nhật Bản (thứ 2) và Ấn Độ (thứ 3) (xem Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số giống đột biến của một số nước trên thế giới năm 2011

Cây khác

Tia gamma

Số lượng

Tỷ lệ đóng góp, %

Hầu hết các giống cây trồng phổ biến hiện nay đều có các dòng đột biến Một

số trường hợp dòng đột biến như Lúa, Ngô, Đậu tương đã được đưa vào trồng trọt

và thể hiện hiệu quả kinh tế cáo Bên cạnh đó, đột biến các giống hoa cũng đang

được nghiên cứu tại một số nước và đã tạo ra một số lượng lớn các giống đột biến

từ giống mẹ ban đầu bao gồm: Cúc [39], Cát tường [4], Anh thảo [51], Hồng môn

[46], Phong lan [21], v.v với nhiều màu sắc đa dạng (xem Hình 1.5)

Riêng đối với giống Địa lan, hiện nay chỉ có 2 giống được công bố trong đó 1

giống tạo ra tại Nhật bản năm 1997 bằng phương pháp đột biến soma thông qua

nuôi cấy mô tế bào thực vật và đã tạo ra giống đột biến có cánh hoa có màu sắc và

hình dạng thay đổi so với giống mẹ Bên cạnh đó, các nhà khoa học tại Hàn Quốc

cũng đã tạo ra 1 giống có tên gọi là Dong-i ( 2005) thông qua đột biến bởi phương

14

pháp chiếu xạ với liều chiếu 30Gy kết hợp với nuôi cấy mô in vitro với đặc tính của

giống mới là lá ngắn và có viền ở mép lá [47]

Hình 1.5 Một số loài hoa đột biến trên thế giới

Hiện nay, tại một số quốc gia ở khu vực Châu Á bao gồm: Nhật Bản, Malaysia, Thái Lan và Hàn Quốc đã xây dựng những thiết bị nhằm mục đích chiếu

xạ thường xuyên ví dụ như: gamma field (Nhật Bản), gamma greenhouse (Malaysia

và Nhật Bản), gamma room (Nhật Bản), gamma phytotron (Thái Lan và Hàn quốc)

và gamma chamber (Malaysia, Việt Nam), v.v Các mô hình này đang ngày càng góp phần gia tăng số lượng và chủng loại các giống đột biến có chất lượng cao (xem Hình 1.6)

Hình 1.6 Mô hình gây tạo đột biến tại Malaysia và Nhật Bản

15

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu đột biến tại Việt Nam

Là một quốc gia nông nghiệp, Việt Nam rất chú trọng công tác nghiên cứu, cải tạo và chọn lọc giống cây trồng Mặc dù nước ta bắt đầu chậm hơn so với nhiều nước khác nhưng số lượng giống mới tạo ra đứng thứ 8 trên thế giới (xem Bảng 1.1) Việt Nam đã được IAEA/FAO xếp vào một trong bảy quốc gia đứng đầu thế giới về số lượng giống lúa đột biến và đứng thứ tư trong khu vực Châu Á - Thái Bình Dương (sau Trung Quốc, Nhật Bản và ấn Độ) về tổng số giống đột biến đã tạo

ra trong đó tia gamma đóng góp 65,45%

Ở nước ta, những nỗ lực nghiên cứu theo hướng này đầu từ 1966 ở Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội và sau đó mở rộng sang các đơn vị khác như: Trung tâm Di truyền Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội I, Viện Cây Lương thực và Thực phẩm, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa học - Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam, v.v Kết quả là đến năm 2011 đã tạo ra 55 giống [52] trong đó có 35 giống Lúa, 11 giống Đậu tương, 2 giống Ngô, 1 giống Đậu phụng, 2 giống Táo, 1 giống Bạc hà và 3 giống hoa Cúc (xem Hình 1.7)

Những năm gần đây, nhờ sự hỗ trợ tích cực của chương trình chọn giống đột biến từ IAEA, sự nghiên cứu cải tiến giống lúa ở nhiều quốc gia Châu Á và Mỹ La Tinh đã đạt được những tiến bộ đáng kể

Đối với cây lúa, bằng phương pháp gây đột biến đã tạo ra nhiều giống có năng suất cao, chống đổ tốt, chịu rét, thấp cây, kháng rầy, thời gian sinh trưởng ngắn, chịu khô hạn và đất phèn Từ năm 2008, các giống lúa đột biến được trồng và phát triển hơn 2,54 triệu ha ở khu vực Miền Nam Giống lúa VND95-20 đột biến là 1 trong 5 giống xuất khẩu chủ lực của nước ta và đạt sản lượng 300 ngàn ha một năm tại Miền Nam và có những đặc điểm nông học tốt như năng suất cao, chất lượng tốt

và kháng rầy nâu Có thể thấy rằng, tình hình nghiên cứu và chọn giống đột biến lúa

ở nước ta trong những năm qua đã đạt được những thành tựu to lớn

16

Hình 1.7 Giống hoa cúc đột biến bằng công nghệ bức xạ tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam đã thành công trong việc tạo ra nhiều giống đột biến có những tính trạng mong muốn Tại Hội Nghị Khoa học Và Công nghệ Hạt nhân Toàn Quốc lần thứ VIII (2009) và lần IX (2011)

đã giới thiệu nhiều công trình nghiên cứu tạo giống cây trồng bằng phương pháp chiếu xạ với tác nhân đột biến chủ yếu là tia gamma và ion beam của các nhà khoa học trong nước đó bao gồm: Lúa của tác giả Nguyễn Đức Thành và cộng sự [20] và Đào Thị Thanh Bằng và cộng sự [2], Phong lan Hồ Điệp của Đỗ Khắc Thịnh và cộng sự [21], lan Hài bao gồm Vân Hài và Hài Hồng của Lê Quang Luân và cộng

sự [8], Cẩm chướng của Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự [1], Cúc của Đào Thị Thanh Bằng và cộng sự [3], v.v

Hiện nay hướng nghiên cứu này đang được Bộ Khoa học Công nghệ tăng cường đầu tư với quy mô lớn và hiện đại Gần đây nhất, ngày 02/06/2010 Thủ

Tướng Chính Phủ ban hành Quyết định số 775/QĐ-TTg về “Quy hoạch chi tiết phát triển, ứng dụng bức xạ trong nông nghiệp đến năm 2020” nhằm mục tiêu: Tạo ra và

đưa vào sản xuất 3-4 giống đột biến cho mỗi loại cây trồng nông nghiệp hàng năm; 1-2 giống đột biến đối với cây ăn quả, cây công nghiệp lâu năm và cây lâm nghiệp, 3-4 chủng vi sinh vật mới cho mỗi loại, đưa tỷ lệ các giống đột biến chiếm ít nhất

17

40% tổng số giống cây trồng và vi sinh vật mới Trong đó có nội dung ứng dụng phương pháp đột biến phóng xạ kết hợp với các phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học để chọn tạo ra các giống cây trồng mới (cây Lúa, Ngô, Đậu, cây có

củ, cây rau, cây hoa, cây ăn quả, cây công nghiệp và cây lâm nghiệp) có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh hại chính và các điều kiện khó khăn, thích hợp với các vùng sinh thái

1.1.5 Chọn giống bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, phương pháp chiếu xạ kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật trở nên rất phổ biến trong các nghiên cứu sinh học và chọn giống thực vật Ưu điểm của phương pháp này là có thể chiếu xạ một số lượng lớn các tế bào dạng soma trong một diện tích nhỏ Nhiều yếu tố ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốt hơn; sử dụng tế bào trần, tế bào riêng lẻ để gây tạo đột biến làm cho việc chọn lọc và tạo dòng thuần được dễ dàng và nhanh chóng; khả năng thu được biến dị dạng thể khảm rất thấp nên thuận tiện cho công tác chọn lọc và tạo dòng; tần suất đột biến thường khá cao bởi vì mỗi tế bào đều có cơ hội tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây đột biến; hàng chục dòng biến dị tiềm năng có thể được chọn lọc nhanh chóng chỉ sau một vài thế hệ, ít tốn kém, tốc độ tạo dòng thuần nhanh [31]

Chiếu xạ kết hợp với nuôi cấy in vitro đã được chứng minh bằng thực nghiệm

là phương pháp có giá trị để tạo ra các đột biến mong muốn và nhân giống nhanh, đặc biệt là ở thực vật [31] Đầu những năm 1990, những nghiên cứu về đột biến gây

tạo bằng chiếu xạ trên mẫu in vitro được tiến hành trên chuối và khoai tây Hiện

nay, kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi trên những cây trồng nhân giống vô tính

khác như Chimera [31] (xem Hình 1.8), Phong lan [9], hoa Baby [25], Hồng môn

[46],v.v

18

Hình 1.8 Quy trình chọn giống Chimera bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp

nuôi cấy in vitro (nguồn: FNCA)

Năm 2005, Puchoa tiến hành nghiên cứu chiếu xạ in vitro cây hồng môn [45]

Trong công trình này, tác giả đã thành công trong việc tạo callus từ lá non trên môi trường Nitsch (1960) bổ sung 0,1mg/l BA và 0,1mg/l 2,4D; tạo chồi khi bổ sung 0,05mg/l BA và tái sinh rễ khi môi trường bổ sung 1,0mg/l IBA Sau đó, tiến hành

chiếu xạ cây in vitro Kết quả thu được chỉ ra rằng tại liều xạ 5Gy đã có hiệu ứng

lên sự hình thành và nhân lên của callus trong khi đó liều xạ 15Gy có hiệu ứng gây chết trên loại mô này Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế vì đã chưa chứng minh được sự khác biệt giữa các cá thể biến dị và cây mẹ

Đến năm 2011, Barakat và cộng sự [25] đã thành công trong nghiên cứu tạo

chọn cây hoa Baby bằng phương pháp chiếu xạ in vitro Kết quả đã tạo ra được các

19

dòng hoa Baby biến dị có những kiểu hình khác biệt so với giống mẹ như: cứng cây, thấp cây, cao cây, bề rộng của lá hẹp

Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có một vài hạn chế: Môi trường nuôi cấy in vitro

có thể làm xuất hiện một vài biến dị dạng thường biến xuất hiện do lỗi khi dịch mã DNA làm ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc và tạo dòng đột biến Thời gian thế hệ

trong nuôi cấy in vitro khác với in vivo, một số giai đoạn sống của thực vật không diễn ra trong điều kiện in vitro do đó không chọn lọc được các biến đổi chỉ biểu

hiện trong giai đoạn này ví dụ như màu sắc, hình dạng hoa và cánh hoa, quả, v.v Đòi hỏi trang bị phòng cấy mô, nuôi mô, hóa chất, kỹ thuật công nghệ nuôi cấy mô, v.v Để nâng cao hiệu quả chọn lọc dòng đột biến tiềm năng, người ta thường sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra các biến đổi DNA Do đó nhà tạo giống cần phải có kiến thức về di truyền phân tử [31]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐỊA LAN (CYMBIDIUM)

1.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Nguồn gốc: Địa lan có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật

Bản và bán Đảo Đông Dương Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông vào

551-479 trước Công nguyên bởi Khổng Tử Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung

Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến) là Cymbidium enrifolium

Phân bố: Họ lan có khu vực phân bố vô cùng rộng lớn, từ xích đạo đến Bắc

cực, từ đồng bằng cho đến vùng băng tuyết, song nhiều hơn cả là vùng nhiệt đới và

Á nhiệt đới (Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh) Tuy nhiên, do đặc tính ưa khí hậu lạnh, các loài thuộc chi Địa lan phân bố chủ yếu ở Châu Á, từ dãy Hymalaya đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), và các nước Đông Dương, Miến Điện, Thái Lan, v.v và một vài loài phân bố ở các Châu lục khác Phần lớn các loài trong chi này phân bố ở vùng núi khá cao, khô và lạnh, một vài loài khác chịu được nhiệt độ nóng

ẩm của rừng nhiệt đới [5], [6]

20

1.2.2 Đặc điểm phân loại học

Địa lan có khoảng từ 40 đến 60 loài hoang dã Trong hệ thống phân loại thực

vật của thế giới, cây lan Cymbidium là loài Địa lan thuộc:

Tại Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong sách “Phân Loại

Học Thực Vật – Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì chi Cymbidium có khoảng 12

loài trong tổng số 463 loài lan [4] Sau đó, vào năm 1988-1990, Trần Hợp đã thống

kê Việt Nam có khoảng 10 loài Cymbidium trong tổng số 368 loài lan trong cuốn

“Phong Lan Việt Nam” [6] Gần đây nhất, trong bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” quyển III tập 2 (1993) của giáo sư Phạm Hoàng Hộ đã tổng hợp lại và mô tả

15 loài Cymbidium tại Việt Nam [5]

1.2.3 Đặc điểm hình thái của Địa lan

Về hình thái bên ngoài, Địa lan là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ Cây cỡ trung bình và lớn, sống bám trên cây hay ở mặt đất với lá hẹp dài, phần gốc phình to thành giả hành Phát hoa ở gần đáy

21

của các giả hành, đứng thẳng hay cong thòng, thường dài và mang nhiều hoa Hoa

to, 3 lá đài và 2 cánh hoa rời và giống nhau (xem Hình 1.9 và Hình 1.10)

Hình 1.9.Hình ảnh mô tả cây Địa lan

Hình 1.10 Một số giống Địa lan thương phẩm tại Việt Nam

Rễ: Có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ

ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh) Rễ mới thường chỉ mọc ra từ cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ phân nhánh từ củ rễ

Căn hành và giả hành: Thân ngầm của chúng (căn hành) thường ngắn, nối

những củ lan với nhau Các củ lan thường là cành ngắn của căn hành Củ già khi được tách khỏi đoạn căn hành củ có thể mọc ra những đoạn căn hành mới, từ đó

22

mọc lên những cây con Do đó người ta xếp Địa lan vào nhóm lan đa thân Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1cm đến 15cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá

Lá: Lá thực thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách

Khi phiến lá rụng, vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến

Phát hoa và hoa: Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành trong các

nách lá, tách các bẹ già và đâm ra bên ngoài Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc Búp hoa khi đã đủ lớn, bắt đầu vươn ra khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới rồi bắt đầu nở

Hoa Địa lan là hoa lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trục hợp nhụy hình bán trụ hơi cong về phía trước (xem Hình 1.10) Địa lan chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng Sau khi thụ phấn bầu noãn phình lên tạo thành quả

Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa rất nhiều hạt Khi chín, quả

mở theo 3 đường góc và tung vào không khí những hạt như bụi phấn màu vàng lụa Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới

1.2.4 Tình hình nghiên cứu cây Địa lan

Đã từ lâu, các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc,

Nhật Bản, Ấn Độ, Mỹ, v.v đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện nhân giống in vitro đối với cây Địa lan Từ những năm 1960-1963, Morel đã thành công trong

nghiên cứu nuôi cấy chồi đỉnh cây Địa lan Tiếp sau đó, hàng loạt các nghiên cứu trên thế giới đã có những công bố về nuôi cấy mô cây Địa lan đã được công bố trong đó một số thành tựu nghiên cứu nổi bật trong những năm gần đây đã được công bố của các tác giả như Chang và cộng sự [26], [27], [28], Chung và cộng sự

23

[31], Gu [32], Huan và cộng sự [37], Nayak và cộng sự [43], [39], [45], Yasugi và cộng sự [47] và Silva và cộng sự [50], v.v., Các nghiên cứu này đã thành công trong việc nghiên cứu tạo các mô sẹo, thể PLB và chồi cây Địa lan từ chồi đỉnh và chồi nách của cây Địa lan, nhân nhanh PLB và tái sinh cây hoàn chỉnh (xem Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro Địa lan gần đây trên thế giới

Study on shoot-tip culture and histologycal

observation of Cymbidium grandiflorum

Acta Biologiae Experimentalis Sinica

Factors influencing rhizome formation from

shoot tip culture of temperate Cymbidium species

Korean Journal

of Plant Tissue Culture

Plantlet Regeneration in Root Segment

Culture of Cymbidium Kenny'Wine Color'

Plant Tissue culture letters

1997

N R

Nayak và

cộng sự

Influence of some plant growth regulators on

the growth and organogenesis of Cymbidium aloifolium (L.) Sw seed-derived rhizomes in vitro

Plant regeneration from callus culture of

Cymbidium ensifolium var misericors

Plant cell reports

Establishment of thin cross section (TCS)

culture method for rapid micropropagation of

Cymbidium aloifolium (L.) Sw and Dendrobium nobile Lindl (Orchidaceae)

Scientia Horticulturae

Cytokinins promotion of flowering in

Cymbidium ensifolium var misericors in vitro

Plant Growth Regulation

Multiple Regeneration Pathways via Thin

Cell Layers in Hybrid Cymbidium

(Orchidaceae)

Plant Growth Regulation

Ở nước ta việc nhân giống Địa lan bằng phương pháp nuôi cấy in vitro đã

được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1980 tại Đà Lạt, sau đó cũng đã có các nghiên cứu phục tráng và nhân giống vô tính một số giống Địa lan Gần đây hàng

loạt các Viện, Trường, Công ty và các Cơ sở tư nhân đã tiến hành nhân giống in vitro cây Địa lan một cách mạnh mẽ hơn bao giờ hết và đã cung cấp thị trường trong

nước và xuất khẩu hàng triệu cây giống mỗi năm [7], [10], [13], [14], [19]

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa lan tại Việt Nam

2004 Nguyễn Quang

Thạch và cộng sự

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống Địa

lan thương mại Miss Kim

Tạp chí nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

2004 Phan Xuân Huyên

và cộng sự

Phục tráng và nhân nhanh các giống Địa

lan Cymbidium CV Bằng nuôi cấy chồi

đỉnh

Tạp chí Sinh học

2004 Nguyễn Quang

Thạch và cộng sự

Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng

tế bào trong nhân nhanh in vitro một số giống Địa lan có giá trị

Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp

Địa lan (Cymbidium sp.) nuôi cấy in vitro

Tạp chí Công nghệ sinh học

2008 Hoàng Thị Nga và

cộng sự

Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Địa

lan Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides)

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Tạp chí Khoa học và Phát triển

2008 Nguyễn Quang

Thạch và cộng sự

Xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng

cây Địa lan (Cymbidium spp.) cấy mô

Tạp chí Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn

1.2.5 Giá trị của Địa lan và tình hình sản xuất tại Việt Nam

Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài Trong

đó Cymbidium được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những

đặc điểm nổi bật cả về giá trị thẩm mĩ lẫn giá trị khoa học Vẻ tao nhã, hài hòa của

chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa

của con người Phương Đông Đối với Địa lan, người chơi hoa không chỉ ưu chuộng

cành hoa mà còn ưu thích chơi lá hoa, chậu hoa Hình dáng, sắc thái của lá hoa Địa

lan mang nhiều ý nghĩa khác nhau Ngoài ra dạng lá có nếp nhăn hoặc có viền còn

được gọi là “kỳ lan dị thảo” cũng có giá trị thưởng thức cao

Hiện nay, việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu

nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao

Theo tính toán, trong điều kiện nuôi trồng chưa phải là tối ưu, cứ 1m2 trồng Địa lan

từ năm thứ 4 trở đi có thể dễ dàng thu hàng chục đô la mỗi năm

Bên cạnh đó, điều kiện tự nhiên của Đà Lạt rất phù hợp với việc trồng nhiều

loài hoa, đặc biệt là hoa lan Hiện nay Đà Lạt có trên 400 cơ sở trồng Địa lan và

cung cấp hằng năm cho thị trường là trên 200 ngàn cành hoa Theo số liệu điều tra

về tình hình sản xuất và cung ứng giống cây trồng tại Việt Nam của Hiệp hội

thương mại giống cây trồng Việt Nam (http://www.vietnamseed.com.vn), năm 2007

26

tổng số cây giống hoa trong cả nước là 225.193.848 cây trong đó số lượng cây hoa cắt cành và Địa lan là 206.200.000 chiếm 91,6% tổng số lượng cây hoa trong cả nước Tuy nhiên, sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là Địa lan hiện vẫn chưa đủ cung cấp cho nhu cầu rộng lớn của thị trường trong và ngoài nước

Ngày nay trong tiến trình hội nhập của nước ta, việc xuất khẩu loại hoa này sẽ gặp không ít trở ngại về vấn đề luật bản quyền bởi lẽ hầu hết các loại hoa Địa lan sản xuất và thương mại có hiệu quả cao mà người trồng hoa sử dụng hiện nay đều

có nguồn gốc ngoại nhập Để giải quyết vấn đề này, người nông dân rất cần sự hỗ trợ từ các nhà khoa học trong việc chọn tạo ra các giống hoa Địa lan có chất lượng tốt, có khả năng cạnh tranh cao và mang thương hiệu Việt Nam

1.3 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.3.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleident và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành

Năm 1902, Haberlandt đã thực hiện nuôi cấy các tế bào đã phân hóa của một

số cây lá mầm nhưng bị thất bại

Năm 1934 White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng

Năm 1939, Gautheret và Nobercout đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch

Năm 1941, Overbeek ở Mỹ đã chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của

nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ Cà (Datura) Sau đó năm 1948, Steward đã

27

xác nhận tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công bằng phương pháp hóa học

Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển được sự nhân chồi

Năm 1960, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy chồi đỉnh Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng trong sản xuất và thương mại hóa

1.3.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật Mô thực vật nuôi cấy trong môi trường nhân tạo cũng cần được cung cấp các chất dinh dưỡng giống như cây được cung cấp

từ đất Tùy theo từng loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô mà thành phần môi trường có thể thay đổi để phù hợp Ngoài ra thành phần môi trường còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy là nhân giống, lưu trữ giống hoặc theo mục tiêu nghiên cứu Các chất cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm: muối khoáng, vitamine, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật và một số chất bổ sung khác

Muối Khoáng: Bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng Khoáng đa lượng (N,

P, K, Ca, S, Mg, v.v.) là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật Khoáng vi lượng (Mn, I, Cu, Zn, B, v.v.) là yếu tố đòi hỏi trong sự tăng trưởng

và phát triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau

Vitamin: Vitamin thường giữ vai trò co-enzyme trong các phản ứng sinh hóa

Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: B1 (thiamin HCl), B3 (calcium panthotenate), B6 (pyridoxine HCl), PP (acid nicotinic), H (biotin), myo inositol, v.v

28

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST)

thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan khác nhau của thực vật Các chất ĐHST thực vật bao gồm: auxin, cytokinin, gibberelline, v.v

− Auxin: Các auxin gồm có auxin thiên nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (IBA,

NAA, 2,4 D).Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, auxin chiếm vị trí rất quan

trọng có tác dụng trong sự nhân lên của tế bào và hiệu quả ra rễ Auxin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và huyền phù tế bào đồng thời điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinin

− Cytokinin: Có hai loại cytokinin là cytokinin tự nhiên (zeatin và 2-iP) và

cytokinin tổng hợp (kinetin, BAP và TDZ) Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự tạo thành các chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng của sự tái sinh rễ Cytokinin còn định hướng

tế bào trong sự phân hóa

− Gibberelline: Gibberelline gồm 80 hợp chất khác nhau có vai trò quan

trọng trong quá trình cây phát triển chiều cao ra hoa và kết trái Chất gibberelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibberelline hay GA3

− Một số chất điều hòa sinh trưởng khác: Jasmonic acid (JA), salicylic acid

(SA), các brassinosteroid, các polyamin, v.v

− Các chất ức chế tăng trưởng: Bao gồm các chất có thành phần phelnol và

abscissic acid

Các chất bổ sung khác: Bao gồm carbon (đường), than hoạt tính, tác nhân

hóa đông, và các chất hữu cơ khác