Sự ra đời và phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại này là những công cụđắc lực, ngày càng được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng. Các kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, RFLP, SSR, ISSR, AFLP, SNP, v.v. tách dòng, xác định trình tự gen đã và đang được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong các nghiên cứu về sinh học phân tử thực vật [35]. Trong các kỹ thuật kể trên, kỹ thuật RAPD-PCR là phương pháp chọn lọc đột biến phân tửđược sử dụng khá phổ biến và đã áp dụng thành công trên nhiều đối tượng
đột biến như: Lúa [23], hoa Baby [25], hoa Hồng [29], Đay Nhật [33], Hồng môn [45], Khoai lang [48], hoa Cúc [52],v.v.
RAPD (Random amplified polymorphic DNA còn gọi là đa hình DNA khuyếch đại ngẫu nhiên) là kỹ thuật phát hiện tính đa hình của DNA được nhân bản
32
ngẫu nhiên, đây là một trong các kỹ thuật phân tích đánh giá bộ gene thực vật đơn giản, dựa trên các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật PCR.
RAPD ra đời vào năm 1990 bởi nghiên cứu của William và cộng sự. RAPD là marker di truyền trội, dựa trên kỹ thuật PCR nhưng không cần biết trước trình tự
của DNA bản mẫu do đó được xem là một marker di truyền đơn giản và kinh tế
trong việc lập bản đồ gen, hay trong các ứng dụng của ngành lai tạo giống, trong việc xác định dấu vân tay DNA và đặc biệt là rất hữu dụng trong ngành di truyền học quần thể.
Các bước cơ bản của kỹ thuật RAPD:
− Tách chiết và tinh sạch DNA,
− Tiến hành PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên,
− Điện di trên gel agarose, xác định mức độ đa hình giữa các mẫu,
− Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập dendrogram để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học các mẫu nghiên cứu.
Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là thực hiện nhanh, dễ thao tác, ít tốn kém, thường
được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác chọn giống hoặc phân loại do dó được sử dụng rất rộng rãi trong việc chọn giống đột biến. Chính vì vậy, trong chọn giống đột biến kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam.
Trên thế giới, một vài nghiên cứu gần đây đã sử dụng kỹ thuật này đểđánh giá sự di truyền của cây đột biến so với giống bố mẹ và đã minh chứng rằng kỹ thuật này hữu hiệu trong việc đánh giá sự khác biệt di truyền so với giống gốc. Trong công bố của Chakrabarty and Datta năm 2010 đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 primer để phân biệt giữa 6 giống hoa hồng gốc và 12 giống đột biến bằng tia gamma. Kết quả thu được cho thấy mức độ tương đồng di truyền của 18 giống dao
33
Hình 1.11. Sơđồ nguyên lý kỹ thuật RAPD
Trong nghiên cứu về chiếu xạ giống hoa Baby’s Breath kết hợp nuôi cấy mô tế bào thực vật [25]. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành chiếu xạ rễ và chồi bên của loại hoa này bằng bức xạ gamma 60Co sau đó tiến hành nuôi cấy in vitro, lựa chọn các cá thể có biến dị in vitro tiến hành phân tích RAPD. Kết quảđã chỉ ra rằng phương pháp sử dụng RAPD đã có hiệu quả trong việc phát hiện các dạng đột biến so với cây bố mẹ.
Ảnh hưởng của tia gamma trên cây Đay Nhật cũng được nhóm tác giả tại Ai Cập nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng bằng kỹ thuật RAPD đã chứng minh được có sự biến đổi trong DNA của các cây bị chiếu xạ và đối chứng [33].
Ở Việt Nam, theo nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chỉ ra rằng chỉ thị phân tử RAPD đã đánh giá được sự khác biệt về mặt di truyền ở mức độ
phân tử giữa các dòng cà chua đột biến và các giống gốc. Mức độ tương đồng di truyền giữa các dòng cà chua đột biến và giống gốc khi phân tích bằng 37 mồi RAPD dao động trong khoảng 0,57- 0,89 [20].
34
Theo công bố của Lê Xuân Đắc và cộng sự, nhằm đánh giá được tính đa dạng di truyền của 13 dòng lúa Tám đột biến và giống gốc sử dụng kỹ thuật RAPD đã chỉ
ra rằng hệ số tương đồng di truyền ở mức độ DNA của 13 dòng lúa Tám đột biến và giống gốc nằm trong khoảng từ 0,50 đến 0,90. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định các dòng lúa Tám đột biến tái sinh từ mô sẹo của giống Tám Xoan Hải Hậu được xử lý bằng tia gamma nguồn 60Co có sự khác nhau và khác so với giống gốc ở mức
độ DNA [20].
Như vậy, có thể kết luận rằng các phân tích RAPD hiện nay có thểđược sử
dụng không chỉ đối với phân tích đa dạng di truyền gây ra đột biến tia gamma mà còn để xác định chính xác của các giống đột biến mới nhằm bảo vệ quyền lợi hợp pháp của nhà tạo giống trong bản quyền đối với giống cây trồng.
35
CHƯƠNG 2 -VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống cây: Thí nghiệm được tiến hành trên giống Địa lan Tím hột có tên khoa học là CymbidiumLa bell “Anna Belle”).
Mẫu thí nghiệm: Các mẫu thí nghiệm của cây Địa lan bao gồm:
− Mẫu nuôi cấy in vitro: chồi đỉnh và phát hoa,
− Mẫu chiếu xạ: Protocorm (PLB), chồi in vitro và cây con đã tái sinh hoàn chỉnh có từ 2-4 lá,
− Mẫu kiểm tra đa dạng di truyền: Lá cây in vitro Địa lan biến dị và đối chứng.
Hình 2.1. Cây Địa lan Tím hột dùng trong nghiên cứu 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ và thiết bị pha môi trường:
− Nồi hấp autoclave
36
− Cân kỹ thuật và cân phân tích
− Micro Wave
− Dụng cụ thủy tinh bao gồm: ống đong, becher, erlen, v.v.
− Pipet các loại 25µl, 50µl, 100µl, 200µl, 1000µl và đầu típ các loại
− Đũa khuấy thủy tinh
− v.v.
Dụng cụ và thiết bị cấy mẫu:
− Tủ cấy vô trùng
− Dao cấy, lưỡi dao, kẹp
− Đĩa cấy − Khăn vô trùng − Đèn cồn − v.v. Dụng cụ và thiết bị nuôi mẫu: − Chai thủy tinh có thể tích 500ml
− Hệ thống giàn sáng nuôi cây
Thiết bị chiếu xạ: Nguồn gamma 60Co tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà lạt, suất liều 0,20 Gy/s.
Dụng cụ và thiết bị phân tích đa dạng di truyền:
− Máy ly tâm
− Máy vortex
− Máy luân nhiệt
− Bộ nguồn và khay điện di
− Máy chụp hình gel
− Tủ lạnh -20oC
37
2.1.3. Hóa chất
Hóa chất dùng trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật:
− Các hóa chất và môi trường dùng trong thí nghiệm là của các Hãng Wako (Nhật) và Sigma (Mỹ).
− Môi trường sử dụng trong thí nghiệm bao gồm các môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962), LS (Linsmaier & Skoog, 1964), KC (Knudson C, 1946) và VW (Vacin & Went, 1949) có bổ sung thêm
đường sucrose, agar, than hoạt tính và 10% nước dừa. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung ở các nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm.
Hóa chất dùng trong phân tích đa dạng di truyền:
− Hóa chất tách chiết DNA theo bộ kit Dneasy Plant Mini Kit của Hãng QIAGEN.
− Các hóa chất dùng trong phản ứng RAPD được cung cấp bởi Hãng Takara (Nhật), Biolabs (New England), các primer do Hãng Sigma (Mỹ) cung cấp. Ladder của hãng Invitrogen (Mỹ).
2.1.4. Các điều kiện thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật sau khi chuẩn bị được khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 121oC trong 15 phút, sau đó được lưu giữ ở điều kiện 25oC trong thời gian 10 ngày để kiểm tra và loại bỏ những bình bị nhiễm nếu có trước khi tiến hành cấy mẫu thí nghiệm.
Tất cả các thao tác trên mẫu cấy in vitro được thực hiện trong tủ cấy vô trùng
đặt tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh Học Thực vật, phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Tp. Hồ Chí Minh. Điều kiện phòng sáng: nhiệt độ: 25 ± 2oC, ẩm độ: 65- 70%, cường độ chiếu sáng: 2500 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
38
Các thử nghiệm phân tích đa dạng di truyền được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Phòng Sinh học, Trung tâm hạt Nhân Tp. Hồ Chí Minh.
Đối với cây trồng trong điều kiện vườn ươm được bố trí trong nhà kính có che 1 lớp lưới đen (loại dùng cho lan và có khả năng làm giảm 70% ánh sáng tự nhiên) tại Tp. Đà Lạt và Tp. Nha Trang.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 nội dung chính:
Nội dung 1: Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan Tím hột
Mục đích của giai đoạn này là hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan Tím hột (Cymbidium La bell “Anna Belle) nhằm tạo nguồn ra nguyên liệu in vitro phục vụ cho công tác gây tạo các biến dị bằng kỹ thuật chiếu xạ gamma 60Co.
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan in vitro
Mục đích của giai đoạn này là tạo nguồn biến dị in vitro cây Địa lan Tím hột bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Lựa chọn các cá thể mang biến dị, theo dõi nhân dòng tạo các thế hệ cây con và xác định tính ổn
định của các tính trạng đã thu được.
Nội dung 3: Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng kỹ
thuật RAPD
Mục đích của giai đoạn này là đánh giá mức độ di truyền của các dòng biến dị
so với giống đối chứng không bị chiếu xạ. Xây dựng hệ số tương quan di truyền và cây đa hình của giống gốc và các dòng biến dị hình thái in vitro cây Địa lan.
39