Để phát hiện đa hình, 20 primer được lựa chọn ngẫu nhiên của hãng Sigma là các OPA-01 đến OPA-10, OPD-01 đến OPD-10 để thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu Địa lan trong thí nghiệm này. Sản phẩm sau khi khuyếch đại được điện di trên gel agarose được nhuộm bởi ethium bromide, thời gian điện di 130 phút, điện trường 100 volt, 30mA. Kết quảđược di được xem đưới đèn UV.
Trong 20 primer được lựa chọn ngẫu nhiên, chỉ có 7 primer thể hiện tính đa hình cao nhất là các primer: OPA-01, OPA-10, OPD-02, OPD-05, OPD-06, OPD- 07, OPD-08. Các band được khuyếch đại từ các primer này tương đối sáng và có kích thước dao động từ 200 đến 2500bp. Một số primer còn lại cho kết quả âm tính hoặc cho các phân đoạn DNA được nhân bản giống nhau giữa các dòng biến dị và
đối chứng vì vậy không được dùng để phân tích đa hình các mẫu.
Bảng 3.12. Các đoạn mồi thể hiện tính đa hình phản ứng RAPD-PCR STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) 1 OPA-01 CAGGCCCTTC 2 OPA-10 GTGATCGCAG 3 OPD-02 GGACCCAACC 4 OPD-05 TGAGCGGACA 5 OPD-06 ACCTGAACGG 6 OPD-07 TTGGCACGGG 7 OPD-08 GTGTGCCCCA
74
Hình 3.22. Kết quả RAPD-PCR với primer OPD-07
Ký hiệu: 1. Mẫu Địa lan đối chứng;
2,3,4: Mẫu Địa lan biến dịTH, TBLD-2-18, TBLN-2-5, TBC-2-3
5: Đối chứng âm
Tính đa hình DNA được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi so sánh giữa các dòng đột biến với nhau. Với 7 mồi đa hình đã thu được 76 phân đoạn DNA được nhân bản của 4 mẫu Địa lan nghiên cứu. Số phân
đoạn DNA được tạo ra phụ thuộc vào từng đoạn mồi sử dụng và được biểu thị ở
Bảng 1.13.
Bảng 3.13. Tổng số phân đoạn DNA của phản ứng RAPD
Mồi
Dòng OPA-01 OPA-10 OPD-02 OPD-05 OPD-06 OPD-07 OPD-08 Tổng
TH 2 3 3 3 2 4 2 19
TBLD-2-18 1 4 3 3 2 4 3 20
TBLN-2-5 3 2 3 2 5 2 3 20
TBC-2-3 1 3 1 3 2 3 4 17
Tổng 7 12 10 11 11 13 12 76
Qua Bảng 3.13 có thể thấy rằng đoạn mồi OPD-07 tạo ra nhiều phân đoạn DNA nhất (13 phân đoạn) và đoạn mồi OPA-01 tạo ra số phân đoạn DNA ít nhất (7
75
phân đoạn). Trong số các mẫu nghiên cứu thì mẫu TBLD-2-18và TBLN-2-5 có số
phân đoạn với 7 mồi là nhiều nhất (20 phân đoạn) trong khi đó đối chứng TH có 19 phân đoạn, thấp nhất là TBC-2-3 17 phân đoạn.