2.2.1.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian khử trùng thích hợp
để khử trùng mẫu cấy.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu gồm các chồi đỉnh và cành phát hoa được tách từ cây mẹ trưởng thành.
Phương pháp thực hiện: Theo quy trình xử lý mẫu mô tả trên Hình 2.2 với nồng độ Ca(OCl)2 khảo sát là: 8, 10 và 12% phối hợp với thời gian khử trùng lần lượt 10, 15, 20 và 25 phút.
40
Chỉ tiêu theo dõi:
− Tỷ lệ mẫu đạt(%) = (Tổng số mẫu đạt/Tổng số mẫu thí nghiệm)×100
− Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu thí nghiệm)×100
− Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/Tổng số mẫu thí nghiệm)×100
Thời gian theo dõi: Từ 2-4 tuần
2.2.1.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ của chất ĐHST thực vật TDZ và 2,4D lên sự hình thành callus từ PLB cây Địa lan.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu cấy là các protocorm like body (PLB) của cây Địa lan.
Phương pháp thực hiện: PLB được tách thành từng đơn vị riêng lẻ hoặc cắt
đôi sau đó cấy mỗi chai 10 mẫu và mỗi nghiệm thức gồm 10 chai. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất ĐHST khác nhau.
Bảng 2.1. Các nghiệm thức khảo sát khả năng tạo callus Nghiệm thức Nồng độ 2,4D, mg/l Nồng độ TDZ, mg/l ĐC 0 0 1 0 0,1 2 0,5 3 1,0 4 1,0 0,1 5 0,5 6 1,0 7 5,0 0,1 8 0,5 9 1,0 10 10 0,1 11 0,5 12 1,0
41
Chỉ tiêu theo dõi:
− Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) = (Tổng số mẫu tạo callus/Tổng số PLB ban
đầu)×100
− Tỷ lệ mẫu tạo callus và PLB (%) = (Tổng số mẫu tạo callus và PLB/Tổng số
PLB ban đầu)×100
− Tỷ lệ mẫu tạo PLB (%) = (Tổng số mẫu tạo PLB/Tổng số PLB ban đầu)×100
Thời gian theo dõi: Từ 6-10 tuần
2.2.1.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, NAA, TDZ, Kinetin và sự phối hợp của BA, NAA và TDZ lên khả năng nhân nhanh PLB từ các PLB ban đầu của Địa lan từ 3 loại môi trường MS, VW và KC.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu cấy là các protocorm like body (PLB).
Phương pháp thực hiện: Các PLB được tách thành từng đơn vị riêng lẻ và
được cấy vào các bình tam giác chứa các loại môi trường cơ bản khác nhau (MS, VW và KC) và có bổ sung các chất ĐHST khác nhau với nồng độ khác nhau.
Bảng 2.2. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB với nồng độ
chất ĐHST khác nhau Nghiệm thức BA mg/l Nghiệm thức TDZ mg/l Nghiệm thức NAA mg/l Nghiệm thức Kinetin mg/l ĐC 0 ĐC 0 ĐC 0 ĐC 0 1 0,5 7 0,1 13 0,5 19 0,5 2 1,0 8 0,3 14 1,0 20 1,0 3 2,0 9 0,5 15 1,5 21 2,0 4 3,0 10 1,0 16 2,0 22 3,0 5 5,0 11 1,5 17 3,0 23 5,0 6 10 12 2,0 18 5,0 24 10
42
Bảng 2.3. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB dưới sự phối hợp của các chất ĐHST
Nghiệm thức BA, mg/l NAA, mg/l Nghiệm thức BA, mg/l TDZ, mg/l
ĐC 0 0 ĐC 0 0 1 2,0 0,1 7 2,0 0,1 2 0,2 8 0,2 3 0,2 9 0,2 4 0,3 10 0,3 5 0,5 11 0,5 6 1,0 12 1,0
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân PLB = Tổng số PLB phát sinh từ mẫu ban đầu
Thời gian theo dõi: Từ 6-10 tuần
2.2.1.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, NAA, TDZ lên khả năng nhân nhanh chồi của Địa lan trên 3 loại môi trường MS, VW và KC.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu cấy là các protocorm like body (PLB) của cây Địa lan.
Phương pháp thực hiện: Các PLB được tách thành từng đơn vị riêng lẻ và
được cấy vào các bình tam giác chứa các loại môi trường cơ bản khác nhau (MS, VW và KC) và có bổ sung các chất ĐHST khác nhau với nồng độ khác nhau.
Bảng 2.4. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân chồi
Nghiệm thức BA, mg/l Nghiệm thức TDZ, mg/l Nghiệm thức NAA, mg/l
ĐC 0 ĐC 0 ĐC 0
1 0,1 5 0,1 9 0,1 2 0,2 6 0,2 10 0,2 3 0,3 7 0,3 11 0,3 4 0,5 8 0,5 12 0,5
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi = Tổng số chồi có chiều cao >2cm phát sinh từ mẫu ban đầu.
43
Thời gian theo dõi: Từ 6-10 tuần
2.2.1.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro của cây Địa lan vitro của cây Địa lan
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ của NAA và nước dừa lên khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Địa lan trên 4 loại môi trường MS, LS, KC và VW.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu cấy là chồi được hình thành từ các cụm PLB sau 4 tuần, có chiều cao từ 4-5cm, có 2-3 lá.
Phương pháp thực hiện: Các chồi in vitro được tách thành từng đơn vị riêng lẻ và được cấy vào các bình tam giác chứa 4 loại môi trường cơ bản khác nhau và có bổ sung NAA với nồng độ 0,1mg/l phối hợp với nước dừa 0%, 10%. Nghiệm thức đối chứng là môi trường MS không bổ sung chất ĐHST.
Bảng 2.5. Các nghiệm thức khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh Nghiệm thức NAA, mg/l Nước dừa, %
ĐC 0 0
1 0,1 0 2 0,1 10
Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây và chiều dài rễ.
Thời gian theo dõi: Từ 6-12 tuần nuôi cấy
2.2.2. NỘI DUNG 2. Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan2.2.2.1. Thí nghiệm 1- Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh trưởng 2.2.2.1. Thí nghiệm 1- Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu Địa lan
Mục đích thí nghiệm: Xác định liều xạ mà tại đó số mẫu bị chết 50% trong tổng số mẫu chiếu xạ (LD50) nhằm xây dựng một bức tranh tổng thể phục vụ cho việc lựa chọn liều chiếu xạ gây đột biến thích hợp đối với cây Địa lan in vitroở các giai đoạn khác nhau.
44
Mẫu thí nghiệm: Các PLB được hình thành sau 4 tuần từ các PLB, Chồi in vitro và cây tái sinh hoàn chỉnh Địa lan Tím hột.
Phương pháp thực hiện: Theo sơđồ Hình 2.3
Hình 2.3. Sơđồ khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên Địa lan Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống của mẫu chiếu xạ
Tỷ lệ sống (%) = (số mẫu còn sống/ Tổng số mẫu bị chiếu xạ)×100
45
2.2.2.2. Thí nghiệm 2- Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị
Mục đích thí nghiệm: Tạo ra các dòng Địa lan biến dị bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro. Lựa chọn các dòng biến dị thu được để chọn giống mới.
Mẫu thí nghiệm: PLB được hình thành sau 4 tuần từ các cụm PLB
Phương pháp thực hiện: (Theo sơđồ Hình 2.4)
Hình 2.4. Sơđồ gây tạo biến dịin vitro cây Địa lan
Để tạo các dòng biến dị, các mẫu PLB được chiếu xạ với số lượng lớn tại các liều xạ khác nhau trong khoảng liều từ 10-50Gy (dao động xung quanh liều xạ
LD50). Mẫu chiếu xạ sau đó cấy chuyền liên tục trong môi trường nhân chồi trong nhiều tháng nhằm tạo ra chồi từ mẫu đã chiếu xạ và qua đó theo dõi nhằm phát hiện các chồi biến dị về hình thái.
Các chồi biến dị phát hiện được sẽ được tách riêng và tiếp tục nuôi cấy nhân chồi qua nhiều thế hệ vô tính nhằm theo dõi tính ổn định của các biến dị đồng thời
46
gia tăng số lượng chồi biến dị trong cùng một dòng. Các chồi chưa thể phát hiện biến dị trong điều kiện in vitro vẫn được tiếp tục lựa chọn các chồi khỏe mạnh để tái sinh thành cây hoàn chỉnh và sau đó chuyển ra trồng ngoài vườn ươm để tiếp tục theo dõi khả năng xuất hiện các biến dị về hình thái.
Đối với mẫu cây đã tái sinh hoàn chỉnh sau khi chiếu xạđược chuyển ra trồng trong nhà kính và tiến hành xác định số mẫu sống sau 4 tháng để xác định liều LD50
cũng như theo dõi sự xuất hiện các biến dị về hình thái.
Chỉ tiêu theo dõi: Các biến dị hình thái về chiều cao cây, màu sắc lá và bẹ lá,
độ rộng của lá, v.v.
Công thức tính tần suất biến dị:
Tần suất biến dị = Số cá thể biến dị/Tổng số cá thể chiếu xạ
Thời gian theo dõi: Từ sau 1 tháng sau khi chiếu xạ
2.2.3. NỘI DUNG 3- Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng kỹ thuật RAPD kỹ thuật RAPD
Mục đích thí nghiệm: Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị so với giống gốc ban đầu, xây dựng hệ số tương đồng trình tự và sự đa hình của các mẫu thí nghiệm.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu lá in vitro của cây Địa lan biến dị lá dài, lá ngắn và lá viền trắng và cây đối chứng không bị chiếu xạ.
Bảng 2.6. Ký hiệu mẫu thực hiện phản ứng RAPD-PCR Thứ tự Ký hiệu Liều chiếu Đặc điểm
1 TH 0 Đối chứng
2 TBLD-2-18 30Gy Lá dài, phiến lá to 3 TBLN-2-5 30Gy Lá ngắn, phiến lá to 4 TBC-2-3 30Gy Lá viền trắng, phiến lá hơi nhỏ
47
Tách chiết DNA từ mẫu lá: Thực hiện quy trình tách chiết DNA thực vật theo bộ kít “DNA easy plant mini kit” của Hãng QIAGEN nhưng thay đổi một số giá trị
về thời gian và tốc độ ly tâm để thu được DNA tổng số của Địa lan là cao nhất.
Định lượng DNA bằng quang phổ kế: DNA mẫu được đo hàm lượng trên máy quang phổ. Các thông số như: hàm lượng DNA (ng) có trong 1µl dung dịch, OD260/280 và OD260/230 được thể hiện trên máy đại diện cho độ tinh sạch DNA.
Đo chất lượng DNA bằng phương pháp điện di: DNA mẫu được chạy điện di cùng với thang chuẩn DNA ladder 1kb trên gel agarose 0,8% nhuộm 1,5% ethium bromide trên điện trường 100V, thời gian 75 phút. Đọc kết quả trên máy quang phổ cực tím có gắn camera và phần mềm đọc kết quảđiện di. So sánh band
điện di của DNA mẫu và thang chuẩn sẽ cho biết mẫu có tinh sạch hay không.
Chuẩn bị phản ứng PCR: Thực hiện bố trí mỗi phản ứng PCR với thể tích 25µl bao gồm: 2,5µl dung dịch đệm PCR (10X PCR buffer - Biolabs); 2,5mM MgCl2 (Biolabs), 200µM mix dNTPs (Biolabs); 1u Taq polymerase (Takara); 12nmol/ml RAPD primer (Sygma); 50ng DNA khuôn; nước cất vừa đủ 25µl; trộn
đều hỗn hợp (hóa chất được đặt trong môi trường đá để không bị mất hoạt tính). 20 RAPD primer được sử dụng trong thí nghiệm là: OPA-01, OPA-02, OPA-03, OPA- 04, OPA-05, OPA-06, OPA-07, OPA-08, OPA-09, OPA-10, OPD-01, OPD-02, OPD-03, OPD-04, OPD-05, OPD-06, OPD-07, OPD-08, OPD-09, OPD-10.
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Master Cycle Gradient có cài sẵn chương trình RAPD-PCR với 20 mồi RAPD primer như trên.
Phản ứng được thực hiện như sau
Bước 1: T= 94oC 3,0 phút Bước 2 (40 chu kỳ) : T=94oC 1,0 phút
T= 37oC 1,5 phút
48
Bước 3: T=72oC 5,0 phút
Mẫu sau khi PCR lưu giữở 4oC, nếu để lâu thì lưu ở -20oC
Điện di sản phẩm: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% (trong
đó 25% agarose tinh khiết và 75% agarose thường) nhuộm ethidium bromide 1,5%. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100Volt trong khoảng 75 phút
Đọc kết quả điện di: Gel sau khi chạy điện di được đọc trên hệ thống BioDoc It system có gắn camera và phần mềm Quatity- one để xử lý hình ảnh. Sự hiện diện hoặc không của band được ghi nhận qua hình ảnh thu nhận được.
Xử lý số liệu: Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả RAPD-PCR với nguyên tắc “1” nghĩa là có sự xuất hiện của vạch khuyếch đại và “0” là không có sự xuất hiện. Nhằm mục đích hiển thị mối quan hệ di truyền của các mẫu Địa lan được khảo sát, xây dựng sơ đồ hình cây dựa trên chỉ số đơn giản SM (Simple matching coefficient) và xếp nhóm các mẫu theo phương pháp UPMA (unweighted pair- group method with arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1.
Chỉ tiêu theo dõi: Sự xuất hiện các band đa hình
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí theo mô hình khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Các số
liệu sau khi thu thập được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA sử dụng các hàm tính toán trong Microsoft Excel.
Kết quảđiện di sản phẩm RAPD được tính toán và phân tích bằng phần mềm NTSYS-pc version 2.1.
49
CHƯƠNG 3 –KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CÂY ĐỊA LAN 3.1.1. Điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm 3.1.1. Điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm
Tái sinh mẫu là bước đầu tiên và là bước rất quan trọng trong quy trình nhân nhanh thực vật bằng nuôi cấy in vitro. Nếu bước tái sinh mẫu không thành công thì các bước tiếp theo không thể tiến hành và do đó toàn bộ quy trình nhân nhanh sẽ
không thể thực hiện được.
Nhiều nghiên cứu trước đây đã tái sinh thành công một số loại hoa Địa lan trong ống nghiệm từ các mẫu ban đầu là phát hoa, đầu rễ hay chồi đỉnh của các tác giả Hoàng Thị Nga và cộng sự [10], Dương Tấn Nhựt và cộng sự [14], Nguyễn Quang Thạch và cộng sự [18], [19], Chung và cộng sự [31]. Để tái sinh mẫu thì bước đầu tiên là phải tiến hành khử trùng mẫu cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau sao cho tỷ lệ chết và và tỷ lệ nhiễm của mẫu là thấp nhất. Trong thí nghiệm hoạt chất Ca(OCl)2 được sử dụng cho mục đích khử
trùng mẫu chồi và cành phát hoa của cây Địa lan. Mẫu sau khi xử lý khử trùng được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nuôi cấy, theo dõi. Tình trạng mẫu sau 30 ngày nuôi cấy được ghi nhận trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tình trạng mẫu chồi đỉnh Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần Nghiệm thức Nồng độ Ca(OCl)2, % Thời gian khử trùng, phút Tình trạng mẫu % đạt % nhiễm % chết 1 8 20 45,0 45,0 10,0 2 25 52,5 32,5 15,0 3 10 20 55,0 30,0 15,0 4 25 82,5 10,0 7,5 5 12 10 72,5 17,5 10,0 6 15 57,5 27,5 15,0
50
Từ kết quả nhận được ở Bảng 3.1 cho thấy rằng khi gia tăng nồng độ Ca(OCl)2
từ 8-12% thì nếu nồng độ càng cao, thời gian càng dài, hiệu quả khử trùng càng tốt. Nồng độ Ca(OCl)2 8% độ nhiễm còn khá cao trong khi nồng độ Ca(OCl)2 12% thì tỷ lệ mẫu chết là khá cao. Trong khi đó nồng độ 10% có tỷ lệ mẫu nhiễm và chết là ít và tỷ lệ mẫu đạt là khá cao. Có thể dể dàng nhận thấy rằng với nồng độ xử lý của Ca(OCl)2 là 10% và thời gian xử lý là 25 phút đã thể hiện hiệu quả cao nhất cho mục đích vào mẫu chồi đỉnh Địa lan.
Bên cạnh chồi đỉnh, phát hoa cũng thường được sử dụng để vào mẫu Địa lan. Trong thí nghiệm này chúng tôi cũng sử dụng loại mẫu này để tái sinh mẫu cùng với chồi đỉnh nhằm mục đích đa dạng hóa các loại mẫu ban đầu khi nghiên cứu tái sinh cây Địa lan.
Hình 3.1. Mẫu Địa lan tái sinh từ chồi đỉnh (a) và cành phát hoa (b) Bảng 3.2. Tình trạng mẫu phát hoa cây Địa lan sau 4 tuần khử trùng bằng
Ca(OCl)2theo thời gian Nghiệm thức Thời gian khử trùng, phút Tình trạng mẫu % đạt % nhiễm % chết 1 10 22 78 0 2 15 28 72 0 3 20 72 0 28 4 25 60 0 40
51
Kết quả Bảng 3.2 cho thấy kết quả xử lý khử trùng cành phát hoa cây Địa lan bằng Ca(OCl)2 với nồng độ 10% với thời gian xử lý từ 20 phút trở lên cũng cho hiệu quả khá cao và không có mẫu nhiễm. Với thời gian xử lý 20 phút thì tỷ lệ mẫu