Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài. Trong
đó Cymbidiumđược mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những
đặc điểm nổi bật cả về giá trị thẩm mĩ lẫn giá trị khoa học. Vẻ tao nhã, hài hòa của chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa của con người Phương Đông. Đối với Địa lan, người chơi hoa không chỉ ưu chuộng cành hoa mà còn ưu thích chơi lá hoa, chậu hoa. Hình dáng, sắc thái của lá hoa Địa lan mang nhiều ý nghĩa khác nhau. Ngoài ra dạng lá có nếp nhăn hoặc có viền còn
được gọi là “kỳ lan dị thảo” cũng có giá trị thưởng thức cao.
Hiện nay, việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao. Theo tính toán, trong điều kiện nuôi trồng chưa phải là tối ưu, cứ 1m2 trồng Địa lan từ năm thứ 4 trở đi có thể dễ dàng thu hàng chục đô la mỗi năm.
Bên cạnh đó, điều kiện tự nhiên của Đà Lạt rất phù hợp với việc trồng nhiều loài hoa, đặc biệt là hoa lan. Hiện nay Đà Lạt có trên 400 cơ sở trồng Địa lan và cung cấp hằng năm cho thị trường là trên 200 ngàn cành hoa. Theo số liệu điều tra về tình hình sản xuất và cung ứng giống cây trồng tại Việt Nam của Hiệp hội thương mại giống cây trồng Việt Nam (http://www.vietnamseed.com.vn), năm 2007
26
tổng số cây giống hoa trong cả nước là 225.193.848 cây trong đó số lượng cây hoa cắt cành và Địa lan là 206.200.000 chiếm 91,6% tổng số lượng cây hoa trong cả
nước. Tuy nhiên, sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là Địa lan hiện vẫn chưa đủ
cung cấp cho nhu cầu rộng lớn của thị trường trong và ngoài nước.
Ngày nay trong tiến trình hội nhập của nước ta, việc xuất khẩu loại hoa này sẽ
gặp không ít trở ngại về vấn đề luật bản quyền bởi lẽ hầu hết các loại hoa Địa lan sản xuất và thương mại có hiệu quả cao mà người trồng hoa sử dụng hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập. Để giải quyết vấn đề này, người nông dân rất cần sự hỗ
trợ từ các nhà khoa học trong việc chọn tạo ra các giống hoa Địa lan có chất lượng tốt, có khả năng cạnh tranh cao và mang thương hiệu Việt Nam.
1.3. SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.3.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô thực vật là một thuật ngữđược dùng rộng rãi để mô tả việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp.
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleident và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành.
Năm 1902, Haberlandt đã thực hiện nuôi cấy các tế bào đã phân hóa của một số cây lá mầm nhưng bị thất bại.
Năm 1934 White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng.
Năm 1939, Gautheret và Nobercout đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch.
Năm 1941, Overbeek ở Mỹđã chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ Cà (Datura). Sau đó năm 1948, Steward đã
27
xác nhận tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt. Thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công bằng phương pháp hóa học.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển
được sự nhân chồi.
Năm 1960, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy chồi
đỉnh. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Từđó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng trong sản xuất và thương mại hóa.
1.3.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật. Mô thực vật nuôi cấy trong môi trường nhân tạo cũng cần được cung cấp các chất dinh dưỡng giống như cây được cung cấp từ đất. Tùy theo từng loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô mà thành phần môi trường có thể thay đổi để phù hợp. Ngoài ra thành phần môi trường còn phụ
thuộc vào mục đích nuôi cấy là nhân giống, lưu trữ giống hoặc theo mục tiêu nghiên cứu. Các chất cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm: muối khoáng, vitamine, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật và một số chất bổ sung khác.
Muối Khoáng: Bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng. Khoáng đa lượng (N, P, K, Ca, S, Mg, v.v.) là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật. Khoáng vi lượng (Mn, I, Cu, Zn, B, v.v.) là yếu tốđòi hỏi trong sự tăng trưởng và phát triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vitamin: Vitamin thường giữ vai trò co-enzyme trong các phản ứng sinh hóa. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: B1 (thiamin HCl), B3 (calcium panthotenate), B6 (pyridoxine HCl), PP (acid nicotinic), H (biotin), myo inositol, v.v.
28
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ
trong các cơ quan khác nhau của thực vật. Các chất ĐHST thực vật bao gồm: auxin, cytokinin, gibberelline, v.v.
− Auxin: Các auxin gồm có auxin thiên nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4 D).Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, auxin chiếm vị trí rất quan trọng có tác dụng trong sự nhân lên của tế bào và hiệu quả ra rễ. Auxin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và huyền phù tế bào đồng thời điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinin.
− Cytokinin: Có hai loại cytokinin là cytokinin tự nhiên (zeatin và 2-iP) và cytokinin tổng hợp (kinetin, BAP và TDZ). Cytokinin có vai trò trong sự
tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự tạo thành các chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng của sự tái sinh rễ. Cytokinin còn định hướng tế bào trong sự phân hóa.
− Gibberelline: Gibberelline gồm 80 hợp chất khác nhau có vai trò quan trọng trong quá trình cây phát triển chiều cao ra hoa và kết trái. Chất gibberelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibberelline hay GA3.
− Một số chất điều hòa sinh trưởng khác: Jasmonic acid (JA), salicylic acid
(SA), các brassinosteroid, các polyamin, v.v.
− Các chất ức chế tăng trưởng: Bao gồm các chất có thành phần phelnol và abscissic acid.
Các chất bổ sung khác: Bao gồm carbon (đường), than hoạt tính, tác nhân hóa đông, và các chất hữu cơ khác.
29
− Carbon và nguồn năng lượng: Saccharose là nguồn quan trọng (5g/l – 50g/l), tuy nhiên có trường hợp dùng glucose hay fructose. Hiện nay thường dùng là saccharose 20g/l trong nhiều môi trường nuôi cấy.
− Than hoạt tính: Than hoạt tính thường được sử dụng trong nuôi cấy mô các loài lan. Than có vai trò khử độc, hút ẩm, hạn chế hiện tượng hóa nâu mẫu.
− Tác nhân hóa đông: Môi trường nuôi cấy in vitro có thểđược dùng trong dạng lỏng hay đặc, phụ thuộc vào từng loại môi trường nuôi cấy. Một số
loài thực vật đòi hỏi phát triển trên môi trường đông đặc lại. Chất đông đặc
được sử dụng thường xuyên là agar được sản xuất từ tảo đỏ gracillaria.
− Các chất hữu cơ khác: Nhằm cung cấp thêm một số chất cần thiết cho sự
phát triển của mô như: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, dịch chiết chuối, v.v. với thành phần không xác định và hàm lượng tùy thuộc vào loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô.
1.3.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.3.1. Ý nghĩa sinh học cơ bản 1.3.3.1. Ý nghĩa sinh học cơ bản
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Trong một cơ thể, từng giai đoạn của chu kỳ phát triển rất khó phân biệt một cách cụ thể và chính xác. Tuy nhiên chúng ta có thể khắc phục được những khó khăn đó và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái bằng phương pháp nuôi cấy mô. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với môi trường bên ngoài. Từ đó ta có thể tìm ra mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, những vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó người ta tìm ra cơ chế miễn dịch thực vật. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là
30
mô phân sinh rồi cho ra mô sẹo, từ đó kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Trong quá trình tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo, chúng ta có thể gây ra những thay đổi định hướng ở mức độ tế bào. Đây chính là ưu thế mà các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong nghiên cứu.
1.3.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Phương pháp nuôi cấy mô dùng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến. Người ta đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào trong công tác chọn giống cây trồng. Những lợi ích trong sản xuất nông nghiệp và công nghiệp có thể kể như sau:
− Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng,
− Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gene của giống trong khâu sản xuất,
− Kiểm soát được toàn bộ kế hoạch từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Tạo được sựđồng loạt về giống, từđó tạo ra sựđồng loạt về sản phẩm cuối. Nói chung, nuôi cấy mô và tế bào đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sựđã và đang là cuộc cách mạng xanh trong trồng trọt.
1.4. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC DÒNG BIẾN DỊ
1.4.1. Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng
Phương pháp chọn giống nhờ các chỉ thị phân tử là một phương pháp chọn giống mới đang áp dụng khá rộng rãi ở nhiều cây trồng. Phương pháp này cho phép xác định nhanh, chính xác sự có mặt của các gen mong muốn, do vậy có thể hỗ trợ
cho chọn giống. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử khắc phục được hạn chế của các phương pháp truyền thống. Phân tích và đánh giá bộ gene của thực vật nhằm xác
31
phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống; đánh giá một cách hữu hiệu tính đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài; tách dòng và chuyển các gen có giá trị kinh tế để nâng cao chất lượng và khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường.
Bên cạnh đó, chỉ thị phân tử giúp cho việc tư liệu hoá nguồn gốc giống cây trồng trở nên dễ dàng và chính xác, giúp cho việc bảo hộ các nhà chọn giống cây trồng. Kết hợp giữa chọn giống đột biến và chọn giống bằng chỉ thị phân tử có thể
rút ngắn quá trình chọn giống.
Mục đích sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống đột biến:
− Phân tích đa dạng di truyền ở mức độ phân tử,
− Tư liệu hoá nguồn gốc giống cây trồng trở nên dễ dàng và chính xác, giúp cho việc bảo hộ các nhà chọn giống cây trồng,
− Kết hợp giữa chọn giống đột biến và chọn giống bằng chỉ thị phân tử có thể
rút ngắn quá trình chọn giống.
1.4.2. Ứng dụng chỉ thị RAPD trong chọn giống
Sự ra đời và phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại này là những công cụđắc lực, ngày càng được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng. Các kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, RFLP, SSR, ISSR, AFLP, SNP, v.v. tách dòng, xác định trình tự gen đã và đang được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong các nghiên cứu về sinh học phân tử thực vật [35]. Trong các kỹ thuật kể trên, kỹ thuật RAPD-PCR là phương pháp chọn lọc đột biến phân tửđược sử dụng khá phổ biến và đã áp dụng thành công trên nhiều đối tượng
đột biến như: Lúa [23], hoa Baby [25], hoa Hồng [29], Đay Nhật [33], Hồng môn [45], Khoai lang [48], hoa Cúc [52],v.v.
RAPD (Random amplified polymorphic DNA còn gọi là đa hình DNA khuyếch đại ngẫu nhiên) là kỹ thuật phát hiện tính đa hình của DNA được nhân bản
32
ngẫu nhiên, đây là một trong các kỹ thuật phân tích đánh giá bộ gene thực vật đơn giản, dựa trên các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật PCR.
RAPD ra đời vào năm 1990 bởi nghiên cứu của William và cộng sự. RAPD là marker di truyền trội, dựa trên kỹ thuật PCR nhưng không cần biết trước trình tự
của DNA bản mẫu do đó được xem là một marker di truyền đơn giản và kinh tế
trong việc lập bản đồ gen, hay trong các ứng dụng của ngành lai tạo giống, trong việc xác định dấu vân tay DNA và đặc biệt là rất hữu dụng trong ngành di truyền học quần thể.
Các bước cơ bản của kỹ thuật RAPD:
− Tách chiết và tinh sạch DNA,
− Tiến hành PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên,
− Điện di trên gel agarose, xác định mức độ đa hình giữa các mẫu,
− Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập dendrogram để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học các mẫu nghiên cứu.
Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là thực hiện nhanh, dễ thao tác, ít tốn kém, thường
được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác chọn giống hoặc phân loại do dó được sử dụng rất rộng rãi trong việc chọn giống đột biến. Chính vì vậy, trong chọn giống đột biến kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên thế giới, một vài nghiên cứu gần đây đã sử dụng kỹ thuật này đểđánh giá sự di truyền của cây đột biến so với giống bố mẹ và đã minh chứng rằng kỹ thuật này hữu hiệu trong việc đánh giá sự khác biệt di truyền so với giống gốc. Trong công bố của Chakrabarty and Datta năm 2010 đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 primer để phân biệt giữa 6 giống hoa hồng gốc và 12 giống đột biến bằng tia gamma. Kết quả thu được cho thấy mức độ tương đồng di truyền của 18 giống dao
33
Hình 1.11. Sơđồ nguyên lý kỹ thuật RAPD
Trong nghiên cứu về chiếu xạ giống hoa Baby’s Breath kết hợp nuôi cấy mô tế bào thực vật [25]. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành chiếu xạ rễ và chồi bên của loại hoa này bằng bức xạ gamma 60Co sau đó tiến hành nuôi cấy in vitro, lựa chọn các cá thể có biến dị in vitro tiến hành phân tích RAPD. Kết quảđã chỉ ra rằng phương pháp sử dụng RAPD đã có hiệu quả trong việc phát hiện các dạng đột biến so với