kỹ thuật RAPD
Mục đích thí nghiệm: Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị so với giống gốc ban đầu, xây dựng hệ số tương đồng trình tự và sự đa hình của các mẫu thí nghiệm.
Mẫu thí nghiệm: Mẫu lá in vitro của cây Địa lan biến dị lá dài, lá ngắn và lá viền trắng và cây đối chứng không bị chiếu xạ.
Bảng 2.6. Ký hiệu mẫu thực hiện phản ứng RAPD-PCR Thứ tự Ký hiệu Liều chiếu Đặc điểm
1 TH 0 Đối chứng
2 TBLD-2-18 30Gy Lá dài, phiến lá to 3 TBLN-2-5 30Gy Lá ngắn, phiến lá to 4 TBC-2-3 30Gy Lá viền trắng, phiến lá hơi nhỏ
47
Tách chiết DNA từ mẫu lá: Thực hiện quy trình tách chiết DNA thực vật theo bộ kít “DNA easy plant mini kit” của Hãng QIAGEN nhưng thay đổi một số giá trị
về thời gian và tốc độ ly tâm để thu được DNA tổng số của Địa lan là cao nhất.
Định lượng DNA bằng quang phổ kế: DNA mẫu được đo hàm lượng trên máy quang phổ. Các thông số như: hàm lượng DNA (ng) có trong 1µl dung dịch, OD260/280 và OD260/230 được thể hiện trên máy đại diện cho độ tinh sạch DNA.
Đo chất lượng DNA bằng phương pháp điện di: DNA mẫu được chạy điện di cùng với thang chuẩn DNA ladder 1kb trên gel agarose 0,8% nhuộm 1,5% ethium bromide trên điện trường 100V, thời gian 75 phút. Đọc kết quả trên máy quang phổ cực tím có gắn camera và phần mềm đọc kết quảđiện di. So sánh band
điện di của DNA mẫu và thang chuẩn sẽ cho biết mẫu có tinh sạch hay không.
Chuẩn bị phản ứng PCR: Thực hiện bố trí mỗi phản ứng PCR với thể tích 25µl bao gồm: 2,5µl dung dịch đệm PCR (10X PCR buffer - Biolabs); 2,5mM MgCl2 (Biolabs), 200µM mix dNTPs (Biolabs); 1u Taq polymerase (Takara); 12nmol/ml RAPD primer (Sygma); 50ng DNA khuôn; nước cất vừa đủ 25µl; trộn
đều hỗn hợp (hóa chất được đặt trong môi trường đá để không bị mất hoạt tính). 20 RAPD primer được sử dụng trong thí nghiệm là: OPA-01, OPA-02, OPA-03, OPA- 04, OPA-05, OPA-06, OPA-07, OPA-08, OPA-09, OPA-10, OPD-01, OPD-02, OPD-03, OPD-04, OPD-05, OPD-06, OPD-07, OPD-08, OPD-09, OPD-10.
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Master Cycle Gradient có cài sẵn chương trình RAPD-PCR với 20 mồi RAPD primer như trên.
Phản ứng được thực hiện như sau
Bước 1: T= 94oC 3,0 phút Bước 2 (40 chu kỳ) : T=94oC 1,0 phút
T= 37oC 1,5 phút
48
Bước 3: T=72oC 5,0 phút
Mẫu sau khi PCR lưu giữở 4oC, nếu để lâu thì lưu ở -20oC
Điện di sản phẩm: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% (trong
đó 25% agarose tinh khiết và 75% agarose thường) nhuộm ethidium bromide 1,5%. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100Volt trong khoảng 75 phút
Đọc kết quả điện di: Gel sau khi chạy điện di được đọc trên hệ thống BioDoc It system có gắn camera và phần mềm Quatity- one để xử lý hình ảnh. Sự hiện diện hoặc không của band được ghi nhận qua hình ảnh thu nhận được.
Xử lý số liệu: Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả RAPD-PCR với nguyên tắc “1” nghĩa là có sự xuất hiện của vạch khuyếch đại và “0” là không có sự xuất hiện. Nhằm mục đích hiển thị mối quan hệ di truyền của các mẫu Địa lan được khảo sát, xây dựng sơ đồ hình cây dựa trên chỉ số đơn giản SM (Simple matching coefficient) và xếp nhóm các mẫu theo phương pháp UPMA (unweighted pair- group method with arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1.
Chỉ tiêu theo dõi: Sự xuất hiện các band đa hình