1.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố
Nguồn gốc: Địa lan có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản và bán Đảo Đông Dương. Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông vào 551- 479 trước Công nguyên bởi Khổng Tử. Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến) là Cymbidium enrifolium.
Phân bố: Họ lan có khu vực phân bố vô cùng rộng lớn, từ xích đạo đến Bắc cực, từđồng bằng cho đến vùng băng tuyết, song nhiều hơn cả là vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới (Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh). Tuy nhiên, do đặc tính ưa khí hậu lạnh, các loài thuộc chi Địa lan phân bố chủ yếu ở Châu Á, từ dãy Hymalaya
đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), và các nước Đông Dương, Miến Điện, Thái Lan, v.v. và một vài loài phân bố ở các Châu lục khác. Phần lớn các loài trong chi này phân bốở vùng núi khá cao, khô và lạnh, một vài loài khác chịu được nhiệt độ nóng
20
1.2.2. Đặc điểm phân loại học.
Địa lan có khoảng từ 40 đến 60 loài hoang dã. Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới, cây lan Cymbidium là loài Địa lan thuộc:
− Giới: Plantea − Ngành: Magnoliophyta − Lớp: Liliopsida − Bộ: Orchidales − Họ: Orchidaceae − Chi: Cymbidium
Thế kỷ thứ nhất sau công nguyên, Dioscorides dùng Orchis để mô tả 2 loài
Địa lan trong quyển sách về dược liệu của ông và được Linnaeus ghi lại trong sách “Các Loài Cây Cỏ” (Species Plantarum) vào năm 1753 [40], rồi John Lindley sử
dụng đầu tiên để đặt tên cho họ lan là Orchidaceae từ năm 1836 và tồn tại cho đến nay.
Tại Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong sách “Phân Loại Học Thực Vật – Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì chi Cymbidium có khoảng 12 loài trong tổng số 463 loài lan [4]. Sau đó, vào năm 1988-1990, Trần Hợp đã thống kê Việt Nam có khoảng 10 loài Cymbidium trong tổng số 368 loài lan trong cuốn “Phong Lan Việt Nam” [6]. Gần đây nhất, trong bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” quyển III tập 2 (1993) của giáo sư Phạm Hoàng Hộđã tổng hợp lại và mô tả
15 loài Cymbidium tại Việt Nam [5].
1.2.3. Đặc điểm hình thái của Địa lan
Về hình thái bên ngoài, Địa lan là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. Cây cỡ trung bình và lớn, sống bám trên cây hay ở mặt đất với lá hẹp dài, phần gốc phình to thành giả hành. Phát hoa ở gần đáy
21
của các giả hành, đứng thẳng hay cong thòng, thường dài và mang nhiều hoa. Hoa to, 3 lá đài và 2 cánh hoa rời và giống nhau (xem Hình 1.9 và Hình 1.10).
Hình 1.9.Hình ảnh mô tả cây Địa lan
Hình 1.10. Một số giống Địa lan thương phẩm tại Việt Nam (nguồn: http://hoadialandalat.com)
Rễ: Có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh). Rễ mới thường chỉ
mọc ra từ cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ phân nhánh từ củ rễ.
Căn hành và giả hành: Thân ngầm của chúng (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan với nhau. Các củ lan thường là cành ngắn của căn hành. Củ già khi
22
mọc lên những cây con. Do đó người ta xếp Địa lan vào nhóm lan đa thân. Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1cm đến 15cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá.
Lá: Lá thực thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách. Khi phiến lá rụng, vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành. Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến.
Phát hoa và hoa: Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành trong các nách lá, tách các bẹ già và đâm ra bên ngoài. Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn, bắt đầu vươn ra khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới rồi bắt đầu nở.
Hoa Địa lan là hoa lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trục hợp nhụy hình bán trụ hơi cong về phía trước (xem Hình 1.10). Địa lan chỉ thụ
phấn được nhờ côn trùng. Sau khi thụ phấn bầu noãn phình lên tạo thành quả. Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa rất nhiều hạt. Khi chín, quả
mở theo 3 đường góc và tung vào không khí những hạt như bụi phấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới.
1.2.4. Tình hình nghiên cứu cây Địa lan
Đã từ lâu, các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Mỹ, v.v. đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện nhân giống in vitro đối với cây Địa lan. Từ những năm 1960-1963, Morel đã thành công trong nghiên cứu nuôi cấy chồi đỉnh cây Địa lan. Tiếp sau đó, hàng loạt các nghiên cứu trên thế giới đã có những công bố về nuôi cấy mô cây Địa lan đã được công bố
trong đó một số thành tựu nghiên cứu nổi bật trong những năm gần đây đã được công bố của các tác giả như Chang và cộng sự [26], [27], [28], Chung và cộng sự
23
[31], Gu [32], Huan và cộng sự [37], Nayak và cộng sự [43], [39], [45], Yasugi và cộng sự [47] và Silva và cộng sự [50], v.v., Các nghiên cứu này đã thành công trong việc nghiên cứu tạo các mô sẹo, thể PLB và chồi cây Địa lan từ chồi đỉnh và chồi nách của cây Địa lan, nhân nhanh PLB và tái sinh cây hoàn chỉnh (xem Bảng 1.2)
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu nhân giống in vitroĐịa lan gần đây trên thế giới Nă
m
Nhóm
tác giả Tên công trình Nơi công bố
1989 Z. Gu và cộng sự
Study on shoot-tip culture and histologycal observation of Cymbidium grandiflorum
Acta Biologiae Experimentalis Sinica 1993 J. D. Chung và cộng sự
Factors influencing rhizome formation from shoot tip culture of temperate Cymbidium
species Korean Journal of Plant Tissue Culture 1994 S. Yasugi và cộng sự
Plantlet Regeneration in Root Segment Culture of Cymbidium Kenny'Wine Color'
Plant Tissue culture letters 1997 N. R. Nayak và cộng sự
Influence of some plant growth regulators on the growth and organogenesis of Cymbidium aloifolium (L.) Sw. seed-derived rhizomes in vitro In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant 1998 C. Chang và cộng sự
Plant regeneration from callus culture of
Cymbidium ensifolium var. misericors
Plant cell reports 2000 C. Chang và cộng sự
Micropropagation of Cymbidium ensifolium
var. Misericors through callus-derived rhizomes In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 2002 N. R. Nayak và cộng sự
Establishment of thin cross section (TCS) culture method for rapid micropropagation of
Cymbidium aloifolium (L.) Sw. and
Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae)
Scientia Horticulturae
24 2003
C. Chang và cộng sự
Cytokinins promotion of flowering in
Cymbidium ensifolium var. misericors in vitro Plant Growth Regulation 2004 L. V. T. Huan và cộng sự
Callus formation and plant regeneration from callus through somatic embryo structures in
Cymbidium orchid Plant Science 2006 J. A. T. da Silva và cộng sự
Multiple Regeneration Pathways via Thin Cell Layers in Hybrid Cymbidium
(Orchidaceae)
Plant Growth Regulation
2011 J. Tao và cộng sự
Effects of plant growth regulators on in vitro
propagation of Cymbidium
African Journal of
Biotechnology
Ở nước ta việc nhân giống Địa lan bằng phương pháp nuôi cấy in vitro đã
được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1980 tại Đà Lạt, sau đó cũng đã có các nghiên cứu phục tráng và nhân giống vô tính một số giống Địa lan. Gần đây hàng loạt các Viện, Trường, Công ty và các Cơ sở tư nhân đã tiến hành nhân giống in vitro cây Địa lan một cách mạnh mẽ hơn bao giờ hết và đã cung cấp thị trường trong nước và xuất khẩu hàng triệu cây giống mỗi năm [7], [10], [13], [14], [19].
Bảng 1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa lan tại Việt Nam Năm Nhóm tác giả Tên công trình Nơi công bố
2004 Nguyễn Quang Thạch và cộng sự
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống Địa lan thương mại Miss Kim
Tạp chí nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 2004 Phan Xuân Huyên
và cộng sự
Phục tráng và nhân nhanh các giống Địa lan Cymbidium CV. Bằng nuôi cấy chồi
đỉnh Tạp chí Sinh học 2004 Nguyễn Quang Thạch và cộng sự Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro một số
giống Địa lan có giá trị
Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp
25 2006 Dương Tấn Nhựt
và cộng sự
Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự
hình thành thể tròn tương tự như chồi non (protocorm-like body) và nghiên cứu rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây hoa
Địa lan (Cymbidium sp.) nuôi cấy in vitro
Tạp chí Công nghệ sinh học
2008 Hoàng Thị Nga và cộng sự
Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Địa lan Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
Tạp chí Khoa học và Phát triển
2008 Nguyễn Quang Thạch và cộng sự
Xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng cây Địa lan (Cymbidium spp.) cấy mô
Tạp chí
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
1.2.5. Giá trị của Địa lan và tình hình sản xuất tại Việt Nam
Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài. Trong
đó Cymbidiumđược mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những
đặc điểm nổi bật cả về giá trị thẩm mĩ lẫn giá trị khoa học. Vẻ tao nhã, hài hòa của chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa của con người Phương Đông. Đối với Địa lan, người chơi hoa không chỉ ưu chuộng cành hoa mà còn ưu thích chơi lá hoa, chậu hoa. Hình dáng, sắc thái của lá hoa Địa lan mang nhiều ý nghĩa khác nhau. Ngoài ra dạng lá có nếp nhăn hoặc có viền còn
được gọi là “kỳ lan dị thảo” cũng có giá trị thưởng thức cao.
Hiện nay, việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao. Theo tính toán, trong điều kiện nuôi trồng chưa phải là tối ưu, cứ 1m2 trồng Địa lan từ năm thứ 4 trở đi có thể dễ dàng thu hàng chục đô la mỗi năm.
Bên cạnh đó, điều kiện tự nhiên của Đà Lạt rất phù hợp với việc trồng nhiều loài hoa, đặc biệt là hoa lan. Hiện nay Đà Lạt có trên 400 cơ sở trồng Địa lan và cung cấp hằng năm cho thị trường là trên 200 ngàn cành hoa. Theo số liệu điều tra về tình hình sản xuất và cung ứng giống cây trồng tại Việt Nam của Hiệp hội thương mại giống cây trồng Việt Nam (http://www.vietnamseed.com.vn), năm 2007
26
tổng số cây giống hoa trong cả nước là 225.193.848 cây trong đó số lượng cây hoa cắt cành và Địa lan là 206.200.000 chiếm 91,6% tổng số lượng cây hoa trong cả
nước. Tuy nhiên, sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là Địa lan hiện vẫn chưa đủ
cung cấp cho nhu cầu rộng lớn của thị trường trong và ngoài nước.
Ngày nay trong tiến trình hội nhập của nước ta, việc xuất khẩu loại hoa này sẽ
gặp không ít trở ngại về vấn đề luật bản quyền bởi lẽ hầu hết các loại hoa Địa lan sản xuất và thương mại có hiệu quả cao mà người trồng hoa sử dụng hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập. Để giải quyết vấn đề này, người nông dân rất cần sự hỗ
trợ từ các nhà khoa học trong việc chọn tạo ra các giống hoa Địa lan có chất lượng tốt, có khả năng cạnh tranh cao và mang thương hiệu Việt Nam.
1.3. SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.3.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô thực vật là một thuật ngữđược dùng rộng rãi để mô tả việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp.
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleident và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành.
Năm 1902, Haberlandt đã thực hiện nuôi cấy các tế bào đã phân hóa của một số cây lá mầm nhưng bị thất bại.
Năm 1934 White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng.
Năm 1939, Gautheret và Nobercout đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch.
Năm 1941, Overbeek ở Mỹđã chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ Cà (Datura). Sau đó năm 1948, Steward đã
27
xác nhận tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt. Thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công bằng phương pháp hóa học.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển
được sự nhân chồi.
Năm 1960, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy chồi
đỉnh. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Từđó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng trong sản xuất và thương mại hóa.
1.3.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật. Mô thực vật nuôi cấy trong môi trường nhân tạo cũng cần được cung cấp các chất dinh dưỡng giống như cây được cung cấp từ đất. Tùy theo từng loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô mà thành phần môi trường có thể thay đổi để phù hợp. Ngoài ra thành phần môi trường còn phụ
thuộc vào mục đích nuôi cấy là nhân giống, lưu trữ giống hoặc theo mục tiêu nghiên cứu. Các chất cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm: muối khoáng, vitamine, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật và một số chất bổ sung khác.
Muối Khoáng: Bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng. Khoáng đa lượng (N, P, K, Ca, S, Mg, v.v.) là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật. Khoáng vi lượng (Mn, I, Cu, Zn, B, v.v.) là yếu tốđòi hỏi trong sự tăng trưởng và phát triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau.
Vitamin: Vitamin thường giữ vai trò co-enzyme trong các phản ứng sinh hóa. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: B1 (thiamin HCl), B3 (calcium panthotenate), B6 (pyridoxine HCl), PP (acid nicotinic), H (biotin), myo inositol, v.v.
28
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ
trong các cơ quan khác nhau của thực vật. Các chất ĐHST thực vật bao gồm: auxin, cytokinin, gibberelline, v.v.
− Auxin: Các auxin gồm có auxin thiên nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4 D).Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, auxin chiếm vị trí rất quan trọng có tác dụng trong sự nhân lên của tế bào và hiệu quả ra rễ. Auxin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và huyền phù tế bào đồng thời điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinin.
− Cytokinin: Có hai loại cytokinin là cytokinin tự nhiên (zeatin và 2-iP) và cytokinin tổng hợp (kinetin, BAP và TDZ). Cytokinin có vai trò trong sự
tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự tạo thành các chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng của sự tái sinh rễ. Cytokinin còn định hướng tế bào trong sự phân hóa.
− Gibberelline: Gibberelline gồm 80 hợp chất khác nhau có vai trò quan trọng trong quá trình cây phát triển chiều cao ra hoa và kết trái. Chất