Tách chiết DNA là bước khởi đầu rất quan trọng vì nó quyết định thành công cho phản ứng PCR sau này. Để thực hiện được các phản ứng PCR thì DNA phải sạch, không đứt gãy, đó là điều kiện đầu tiên cho thành công của quá trình nghiên
72
cứu. Để tách chiết DNA thực vật, mẫu lá là đối tượng được sử dụng phổ biến nhất bởi vì hàm lượng DNA cao, hàm lượng cellulose thấp so với các đối tượng khác. Kết quả tách chiết DNA của Địa lan được thể hiện ở Bảng 3.11và Hình 3.11.
Bảng 3.11. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA Địa lan Chỉ tiêu theo dõi Đối chứng
TH Biến dị TBLD-2-18 Biến dị TBLN-2-5 Biến dị TBC-2-3 Nồng độ (ng/ml) 42 64 34 27 OD 260/280 1,85 1,79 1,82 1,78 OD 260/230 2,02 2,11 2,12 2,07
Tỷ số giữa các giá trị OD 260nm và 280nm là tỷ số về độ tinh sạch protein, phenol và các hợp chất hữu cơ của mẫu DNA. Mẫu DNA được coi là sạch nếu tỷ số
OD 260/280 này nằm trong khoảng 1,8-2,0. Ngoài ra, sự có mặt của polysacharide sẽ gây ức chế phản ứng PCR và tạo ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu. DNA
được coi là sạch khi tỷ số OD 260/230 nằm trong khoảng 2,0-2,2. Khi điện di trên gel, DNA mang điện tích âm sẽ di chuyển về cực dương trong khi đó polysaccharide thì không di chuyển mà nằm lại trong giếng gel. Dựa vào các vệt sáng trên giếng gel để phán đoán DNA có bị nhiễm polysaccharide hay không.
Hình 3.21. Hình ảnh DNA Địa lan trên gel
73
Kết quả từ Bảng 3.11. cho thấy DNA được tách chiết từ mẫu lá in vitro của các cây Địa lan có nồng độ và chất lượng tương đối tốt. Mặc khác, kết quả kiểm tra
điện di trên gel agarose cũng cho thấy DNA của các mẫu tách chiết đều sạch. Trên gel điện di (xem Hình 3.21), các giếng không có vệt sáng chứng tỏ DNA không bị
nhiễm polysaccharide hoặc bị nhiễm rất ít. Mặc khác, band DNA của cả 4 mẫu Địa lan đều nằm ở vị trí cao hơn thang chuẩn, nghĩa là các DNA có trọng lượng phân tử
lớn và không bịđứt gãy cơ học trong quá trình tách chiết.