Nghiên cứu tạo dòng biến dị IN VITRO ở cây lan Hài Hồng (PAPHIOPEDILUM CALLOSUM) bằng phương pháp chiếu xạ.

Là nhóm hoa kiểng được nhiều người yêu thích, các loài lan Hài được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu nhằm mục đích nhân giống vô tính như: Nuôi cấy chồi và chóp lá Allen

Lan Hài Vệ nữ (Paphiopedilum sp.) với hình dạng độc đáo như chiếc hài của

phụ nữ và vẻ đẹp quý phái được coi là nhóm đặc sắc nhất trong họ lan Đây là một trong những loài thực vật kiểng được ưu thích và có giá trị thương mại cao nhất trên thế giới Không chỉ quý vì vẻ đẹp, lan Hài còn là một trong những loài thực vật hiếm nhất trên thế giới hiện nay

Là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được các nhà khoa học xác định là một trong những cái nôi của loài lan Hài Vệ nữ với khoảng 20 loài, trong đó có nhiều loài có tính đặc hữu hẹp Tuy nhiên, do sự khai thác ồ ạt thiếu kiểm soát và nạn phá rừng tràn lan, các loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên Để bảo vệ nguồn gen quý này, Công ước quốc tế về buôn bán các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (CITES) đã cấm xuất khẩu các loài lan Hài của Việt Nam dưới mọi hình thức

Là loài lan Hài có tính đặc hữu rất hẹp, lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) là một trong các loài lan quý hiếm nhất của Việt Nam cũng như của thế

giới Được người Pháp phát hiện từ đầu thế kỷ 20, lan Hài Hồng đã nhanh chóng được ưa thích trên toàn thế giới bởi vẻ đẹp quý phái nhưng thanh nhã của nó Do có giá trị thương mại cao và tính đặc hữu rất hẹp, độ mẫn cảm với môi trường cao mà lan Hài Hồng ngoài tự nhiên đang trong tình trạng có nguy cơ tuyệt chủng trầm

trọng

Khác với lan Hài Hồng, Vân Hài (Paphiopedilum callosum) là một trong các

loài lan Hài có khu vực phân bố rộng Tuy vậy, do giá trị thương mại cao lại dễ khai thác do khu vực sống của loài lan này ở độ cao thấp, gần suối nên hiện nay Vân Hài ngoài tự nhiên cũng đang có nguy cơ tuyệt chủng

Với mong muốn góp phần bảo tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm

nguyên liệu cho công tác tạo giống hai loài lan Hài quý hiếm này, chúng tôi thực

hiện đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương

pháp chiếu xạ”

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương pháp chiếu xạ” là xác định quy trình nhân giống in vitro phục vụ bảo tồn và thương mại hai loài lan quý hiếm của Việt Nam và tạo ra các dòng biến dị in vitro bằng

bức xạ ion hóa

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN

Quy trình nhân giống in vitro lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) có ý nghĩa quan trọng đối với công tác bảo tồn

hai loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam bên cạnh ý nghĩa thương mại của nó

Nghiên cứu tác động của bức xạ ion hóa đối với các loài lan này là cơ sở cho các nghiên cứu về chọn tạo giống lan Hài, góp phần phát triển đa dạng các giống lan Hài đặc hữu quý hiếm của Việt Nam

TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

- Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống in vitro hai loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum)

- Khảo sát tác động của bức xạ ion hóa lên sự sinh trưởng và phát triển của

mẫu in vitro ở hai loài lan Hài nói trên

- Đã gây tạo và chọn lọc được các dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng

(12 dòng) và Vân Hài (12 dòng); trong đó đã tiến hành khảo sát sự biến đổi di truyền ở mức phân tử của 5 dòng Vân Hài và 2 dòng Hài Hồng

Mục lục

Danh mục từ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

Mở đầu……….… ……… 1

Mục tiêu của đề tài……… 3

Điểm mới của luận văn……… 3

Tóm tắt kết quả đạt được………3

Chương I: Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan về cây lan Hài……….4

1.1.1 Phân loại……… 4

1.1.2 Hình thái……… 5

1.1.3 Sinh thái……… 8

1.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam……….9

1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vân Hài……….12

1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)……… ……….12

1.1.5.2 Vân Hài (Paphiopedilum callosum)……… 13

1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật………15

1.2.1 Môi trường nuôi cấy mô thực vật……… 16

1.2.1.1 Các loại muối khoáng……… 16

1.2.1.4 Các chất bổ sung……… 18

1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất………….19

1.3 Tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chiếu xạ………20

1.3.1 Đột biến và phân loại đột biến……… 20

1.3.2 Các tác nhân gây đột biến……… 21

1.3.2.1 Tác nhân vật lý……… 22

1.3.2.2 Tác nhân hóa học……… 23

1.3.3 Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống………24

1.3.4 Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng trong tạo giống cây trồng……….……… 25

1.4 Chọn lọc dòng biến dị……….29

1.4.1 Chọn lọc dựa trên karyotype của thực vật……….30

1.4.2 Kỹ thuật PCR……….31

1.4.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR……… 31

1.4.2.2 Quy trình kỹ thuật PCR……….32

1.4.2.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR……….32

1.4.2.4 Các hạn chế của kỹ thuật PCR……… 34

1.4.2.5 Kỹ thuật phân tích tính đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD)……….……… 34

Chương II: Vật liệu và phương pháp 2.1 Vật liệu………37

2.2.2 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài……… 39

2.2.2.1 Khảo sát môi trường hình thành callus của lan Hài……… 39

2.2.2.2 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB……… 41

2.2.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi……… 43

2.2.2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro……….45

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên mẫu lan Hài in vitro………….46

2.2.3.1 Chiếu xạ mẫu………47

2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau chiếu xạ……… 47

2.2.3.3 Tạo và xác định các dòng biến dị.………48

2.2.4 Chọn lọc sau chiếu xạ……… 48

2.2.4.1 Chọn lọc cây có biểu hiện khác biệt về kiểu hình trong nuôi cấy in vitro……….……… 48

2.2.4.2 Kiểm tra sự biến đổi di truyền……… 49

2.2.5 Xử lý thống kê số liệu……… 51

Chương III: Kết quả và thảo luận 3.1 Khảo sát điều kiện khử trùng và nuôi cấy mô lan Hài………52

3.1.1 Điều kiện khử trùng mẫu……….52

3.1.2 Khảo sát môi trường tạo callus………53

3.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB……….56

3.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi……….58

3.1.5 Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh……… 60

lên mẫu lan Hài in vitro 61

3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ gamma đối với mẫu lan Hài 62

3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro 65

3.2.2 Tạo dòng biến dị… 66

3.3 Chọn lọc các dòng biến dị in vitro 69

3.3.1 Chọn lọc kiểu hình 69

3.3.2 Chọn lọc dựa trên chất liệu di truyền 72

3.3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 75

3.3.2.2 Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD 77

Chương IV: Kết luận và đề nghị 4.1 Kết luận… 83

4.2 Đề nghị 84

Tài liệu tham khảo 86 Phụ lục

Bảng 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức

Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)……… ……… 10 Bảng 2.1 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo callus 40 Bảng 2.2 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB……42 Bảng 2.3 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số

nhân chồi… ……… … 44

Bảng 2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro………… … 45

Bảng 2.5 Tên và trình tự các đoạn mồi……….………50 Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng 6 tuần……….52 Bảng 3.2 Tình trạng hạt lan Hài sau khử trùng và gieo hạt 10 tuần……….…….53 Bảng 3.3 Khả năng tạo callus từ PLB……… 55 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB……….…57 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi của lan Hài…… 58 Bảng 3.6 Khả năng tái sinh hoàn chỉnh của cây lan Hài……… 60 Bảng 3.7 Giá trị LD50 của các mẫu lan Hài Hồng và Vân Hài……… 65 Bảng 3.8 Khả năng biến dị của cây lan Hài sau khi chiếu xạ tia gamma.………67 Bảng 3.9 Các dạng biến dị in vitro của cây lan Hài sau khi chiếu xạ chùm ion 68 Bảng 3.10 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Hài Hồng chiếu xạ chùm ion

(mẫu phân tích DNA)……… 73

Bảng 3.11 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Vân Hài chiếu xạ chùm ion (mẫu

phân tích DNA)……….……….74

Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD

lan Hài Hồng 78 Bảng 3.14 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Hài Hồng……… 78 Bảng 3.15 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD

lan Vân Hài ……… 80 Bảng 3.16 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Vân Hài ……….… 81 Bảng 3.17 Tỉ lệ sống của mẫu PLB và chồi lan Hài sau chiếu xạ

2 tháng và 4 tháng……… … phụ lục Bảng 3.18 Tỉ lệ sống của mẫu cây lan Hài sau chiếu xạ 4 tháng………… phụ lục

Hình 1.2 Lan Hài Hồng……….…12

Hình 1.3 Lan Vân Hài……… 14

Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật RAPD……….35

Hình 2 Quy trình thực hiện thí nghiệm………46

Hình 3.1 Mẫu lan Hài in vitro ở các giai đoạn khác nhau………59

Hình 3.2 Mẫu PLB và chồi lan Hài chết sau chiếu xạ……… 62

Hình 3.3 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu lan Hài Hồng in vitro… 63

Hình 3.4 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu lan Vân Hài in vitro… 64

Hình 3.5 Các dạng biến dị ở cây Hài Hồng bởi chùm ion……… 70

Hình 3.6 Các dạng biến dị ở cây Vân Hài bởi chùm ion……… …71

Hình 3.7 Các dòng biến dị lan Hài Hồng thế hệ M1V2 (mẫu phân tích DNA) 72

Hình 3.8 Các dòng biến dị lan Vân Hài thế hệ M1V2 (mẫu phân tích DNA) 72

Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu DNA lan Hài 75

Hình 3.10 So sánh ba dòng lan Hài Hồng ở mức độ phân tử 79

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD với các primer OPD5 và OPD6 của 6 dòng lan Vân Hài…… …… 79

Hình 3.12 So sánh năm dòng lan Vân Hài ở mức độ phân tử……… …81 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Hài Hồng……… phụ lục Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Vân Hài………phụ lục

BA Benzynladenine

CITES Convention in International Trade in Endagered Spicies of Wild

Fauna and Flora DES Diethylsulfate

DMS Dimethylsulfate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EL Ethylenime

EMS Ethylmetansulphonate

FAO Food Argiculture Organization

IAEA The International Union for Conservation of Nature

LD50 Lethal Dose 50%

NAA α-naphthaleneacetic acid

NMU Nitrozomethylurea

PLB Protocorm like body

RAPD Random Amplified Polymorphic DNAs

RFLP Retriction Fragment Length Polymorphisms

TDZ Thidiazuron

UV Ultraviolet

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN HÀI (Paphiopedilum)

1.1.1 Phân loại

Lan Hài (Paphiopedilum) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp Một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành Hạt kín (Angiospermatophyta) [14] Bộ Lan có liên hệ chặt chẽ với bộ Hành,

có một số ý kiến cho rằng có lẽ bộ Lan đã tiến hóa từ bộ Hành do hoa của bộ Hành

có khuynh hướng phát triển dẫn đến bộ Lan Bộ Lan chỉ gồm một họ duy nhất là họ Lan Họ Lan có cơ quan sinh dưỡng khá đa dạng, thường có rễ khí sinh khá phát triển Mạch phần lớn là kiểu nguyên thủy, không có ở rễ và thân Lá mọc cách, nguyên, phiến lá đôi khi rất dày Cuống lá hoặc gióng thân đôi khi phình lên gọi là hành giả Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên, thường tập hợp thành dạng cụm hoa chùm hay bông Bao hoa dạnh cánh, gồm 6 mảnh rời nhau, xếp trên hai vòng, mỗi vòng 3 mảnh Vòng trong có một cánh lớn, có màu sắc và hình dạng khác biệt gọi là cánh môi Cấu trúc hoa phức tạp, giao phấn bắt buộc, thích nghi cao với sự giao phấn nhờ sâu bọ Quả khô, hạt nhỏ, nhiều, nhẹ do thường không có nội nhũ, dễ dàng phát tán nhờ gió Hạt muốn nảy mầm cần có nấm cộng sinh để phôi phát triển được Lan sinh trưởng chậm, từ khi nảy mầm đến khi ra hoa có thể mất 10–15 năm [14]

Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ Lan Chúng dễ dàng được nhận

ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài, mà trong chuyên môn thường được gọi là môi hay cánh môi, nằm ở vị trí

thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc Và do vậy nó trở thành tên chung của nhóm này Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa làm cho lan Hài dễ dàng phân biệt với các loài lan khác [1]

Lan Hài có 5 chi gồm:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, chủ

yếu phân bố ở vùng núi và vùng ôn đới của bắc bán cầu

- Chi Mexipedium, Phragmipedium và Selenipedium có khoảng 25 loài phân

bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ

- Chi Paphiopedilum gồm khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á

từ nam Ấn Độ và đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon

Các loài lan Hài ở Việt Nam đều thuộc chi Paphiopedium Tuy lan Hài là

nhóm rất hiếm, tính đa dạng của lan Hài tại Việt Nam cao hơn bất cứ nơi nào trên thế giới Nhiều loài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là loài đặc hữu hẹp, có tầm quan trọng quốc tế [1]

ngắn

- Lá: thường có dạng lá dài, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới là bẹ lá hình chữ V xếp lớp xít lên nhau trên thân Độ dài của lá ở các loài có thể rất khác nhau, từ 3–50cm Mặt trên của lá có thể màu xanh

lá cây cùng màu, hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ Mặt dưới lá của một số loài có các đốm tím dày đặc, ở các loài khác chỉ thấy vết tím xỉn ở gần gốc lá Rất ít loài có mặt dưới thuần màu xanh lá Mật độ

và đặc điểm của vết khảm màu trên lá là một trong các đặc điểm phân loại ở các loài Lá ở một số loài có thể dày, mọng nước, cứng hoặc có lông

- Hoa: cụm hoa thường thẳng đứng hay cong Một số loài có cuống hoa nằm ngang hay chúc xuống, nhưng hầu hết có cuống hoa dựng đứng Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ nhưng một vài loài có hơn một thể có nhiều hoa trong một cụm hoa Hoa gồm lá đài lưng và lá đài hợp ở vòng ngoài và ba cánh hoa ở vòng trong Hoa có lông mềm dài ở gần mép gốc, có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp hoặc xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài Môi có ba thùy với thùy giữa lõm sâu và hai thùy bên vòng quanh Mép thùy giữa có thể cuộn vào trong hình thành ống ở gốc môi hay không cuộn Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhụy cái hợp thành cột nhị - nhụy Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhụy và hai bên cuốn cột Bầu dưới, một ô, đính noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn

- Quả: dạng quả nang, khô, dài, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt Quả chin trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng

Lan Hài Đài cuộn lan Hài Đốm lan Hài Hồng

(P appletonianum) (P concolor) (P delenatii)

Lan Hài Lông lan Hài Lục lan Hài Hằng

(P hirsutissimum) (P gratrixianum) (P hangianum)

Lan Hài Tía lan Hài Vàng lan Vân Hài

(P purpuratum) (P villosum) (P callosum)

Hình 1 1 Một số loài lan Hài của Việt Nam

1.1.3 Sinh thái

Chi Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á,

trong đó có Việt Nam Các loài nguyên thủy nhất của chi này được tìm thấy ở Đông Nam Á, chủ yếu ở nam Trung Quốc và bắc Việt Nam, mỗi loài đều có khu phân bố rất hạn chế [1] Sự di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly tỏa tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương thường có khu phân bố xa nhau đã mở rộng khu phân bố xuống phía nam và phía đông

Tính đặc hữu hẹp có lẽ là đặc điểm nổi bật của các loài thuộc chi này Có đến 72% số loài đã biết là loài đặc hữu rất hẹp, một số có khu phân bố ít hơn 100km2 Rất nhiều loài mới được phát hiện ở một hoặc một vài địa điểm Hầu hết các loài đều có đặc tính phân bố hẹp và rải rác, không tập trung vào một vùng riêng biệt Chỉ

có chưa đến 12% các loài của chi này là có khu phân bố tương đối rộng [1]

Các loài lan Hài là một cấu phần không thể thiếu của rừng nguyên sinh và chúng có thể bị tuyệt chủng một cách nhanh chóng và không thể phục hồi khi các quần xã tự nhiên bị con người phá hủy [1] Trong rừng núi của Việt Nam, nơi còn sót lại những mảnh rừng nguyên sinh đa dạng nhất, các loài lan Hài rất phong phú

Về mặt sinh thái, các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm Một nhóm sống ở vùng núi đá vôi phía bắc Việt Nam và nhóm còn lại sống ở khu vực có đá mẹ là silicat, đá phiến và cát kết Trong rừng, lan Hài có thể mọc trên đất,

đá và phụ sinh Mỗi loài thường có loại môi trường sống ưa thích mặc dù sự thay đổi cũng đã được ghi nhận nhưng rất ít Khoảng 22% là địa lan (mọc trên đất), 8% mọc trên đá, còn lại là phụ sinh [1]

Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, độ ẩm cao Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thường chúng phải trải qua một thời kỳ khô hạn và nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại Độ ẩm

xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của các quần thể lan Hài

Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía bắc, đông bắc và tây bắc của núi Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ Nhưng những đám lớn với hàng ngàn chồi hoa trước đây chắc chắn không phải là hiếm Các nơi sống tự nhiên bị phá hủy bởi con người, sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1]

1.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam

Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một

trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan Hài đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong

tự nhiên Được coi là một trong các thực vật chỉ thị tình trạng môi trường, lan Hài rất nhạy cảm với các thay đổi của môi trường sống Với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài đang biến mất nhanh chóng

Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây

ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay

Bảng 1: Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)

Đã bị tuyệt chủng P malipoense var hiepii

Đã tuyệt chủng ngoài thiên nhiên P vietnamense

Đang có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng P delenatii

Đang có nguy cơ tuyệt chủng P aspersum, P barbigerum var.Lokianum,

P callosum, P dianthum, P emersonii,

P gratrixianum, P hangiannum, P helenae,

P hanryanum, P herrmannii, P malipoense var.Jackii, P malipoense var.malipoense,

P micranthum, P purpuratum,

P tralienianum

Sắp tuyệt chủng P appletoniaum, P concolor,

P hirsutissimum var Chiwuawnum,

P hirsutissimum var Esquirolai, P villosun var Annamense

P villosum var boxalli

Nguyên nhân thứ hai dẫn đến sự biến mất của chủng lan quý này là việc thu hái trên quy mô lớn của người dân địa phương để xuất khẩu bất hợp pháp ra thị trường nước ngoài, chủ yếu là thị trường Hồng Kông, Đài Loan, Nhật Bản, Hoa Kỳ

và Châu Âu Một lượng lớn lan Hài Việt Nam, trong đó có nhiều loài đặc hữu đang

có nguy cơ tuyệt chủng đã được nhiều nước nhập khẩu Từ khoảng thập niên 1990 việc thu hái diễn ra ồ ạt đã làm trữ lượng lan Hài giảm sút một cách nhanh chóng dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài lan Hài vốn trước đây khá phổ biến [1]

Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên trong khi việc nhân giống

in vitro dòng lan này vẫn được cho là rất khó, nhiều chương trình quốc gia về bảo

tồn loài hoa quý này đã được triển khai, chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu

về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài của Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp (2004)

Cho đến nay, việc nhân giống loài lan quý này hầu như vẫn được tiến hành bằng cách gieo hạt hoặc tách các mầm cây từ cây mẹ Phương pháp này vừa không hiệu quả vừa cho hệ số nhân rất thấp, không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường Là nhóm hoa kiểng được nhiều người yêu thích, các loài lan Hài được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu nhằm mục đích nhân giống vô tính như: Nuôi cấy chồi và chóp lá (Allenberge, 1976); Kích thích tạo chồi bên và cây con (Nieman, 1980; Sampolinski, 1983; Stewart & Button, 1977); Phân lập tế bào trần của các loài lan Hài (Price & Earl, 1984); Nuôi cấy mô sẹo (Lin, 2000); Tạo dòng

lan Hài in vitro (Huang, 2001); Tái sinh cây lan Hài từ nuôi cấy lá (Cheng et al,

2004); Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật gây tạo vết thương, sử dụng phương pháp

nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân (Dương Tấn Nhựt, 2007); Nhân giống in vitro và tạo đột biến (Lê Quang Luân, 2007); Nhân giống lan Hài Hằng (Paphiopedilum hangianum) và Hài Tam Đảo (Paphiopedium gratrixianum) (Viện Ứng dụng Công

nghệ, 2009); Lai tạo giống lan Hài (Trần Phạm Anh Tuấn, 2009)

1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vân Hài

1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)

Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii Guillaum) là

một trong những loài đặc hữu hẹp nhất của Việt Nam [1]

Với vẻ đẹp đặc sắc của hoa và cả lá cây, lan Hài Hồng hiện

nay là một trong các loài hoa được ưa chuộng và có giá trị

kinh tế cao trên thị trường cây cảnh thế giới

Hình 1.2 Hài Hồng

Lan Hài Hồng được phát hiện lần đầu từ khoảng năm 1922 do một nhà điều tra người Pháp tên là Poilane ở gần thành phố Nha Trang [1] Những cây này sau đó được các nhà làm vườn Pháp trồng thành công ở Pháp Sau một thời gian lai giống, các thế hệ con cháu của chúng hiện nay đã thích nghi với điều kiện sinh trưởng ở

Pháp và trở nên dễ trồng

Hình thái học: Cây thân cỏ mọc trên đá hoặc đất với 5-7 lá mọc thành 2 hàng Lá

từ hình bầu dục tới bầu dục thuôn, tù và có 3 răng nhỏ ở chóp, dài tới 11cm, rộng 3,9cm, mép có lông rìa ở gần gốc, các đốm khảm xanh lá cây nhạt và thẫm ở mặt trên, chấm dày màu tía ở dưới Cụm hoa 1-2 hoa, rất hiếm khi 3; cuống hoa dài tới 22cm, xanh, đốm tía, phủ lông trắng cứng; lá hoa hình bầu dục tới hình trứng, dài 1,2-1,5cm, rộng 1cm, xanh đốm tía, có lông ngắn; cuống hoa và bầu dài tới 5,5cm, màu xanh, có đốm tía, phủ lông Hoa có đường kính 7,5-8cm, màu hồng nhạt với môi hồng hoặc hồng-tía, có đốm đỏ và vàng trên nhị lép, có lông ở cả mặt trong và ngoài Lá đài lưng hình trứng, chóp tù tới gần nhọn, dài 1,7-3,5cm, rộng 1,8-2,5cm

3-Lá đài hợp tương tự, dài 1,9-3cm Môi hình bầu dục tới hình gần cầu, dài 3,8cm rộng 2,5-3cm, mép cuốn vào trong, có lông tơ nhỏ Nhị lép hơi lồi, hình

2,5-trứng, chóp tù, dài 14-17mm, rộng 13-16mm, có lông ria Bộ nhiễm sắc thể 2n=26 [1]

Đặc điểm sinh thái: Khu phân bố của lan Hài Hồng trong tự nhiên chắc chắn ít hơn

100km2, chủ yếu ở các tỉnh Đắc Lắc và Khánh Hòa thuộc khu vực Nam Trung Bộ [1] Không giống như các loài lan có quan hệ thân thuộc thường mọc trên núi đá vôi, lan Hài Hồng mọc trên đất có đá mẹ là đá granit và gơnai Chúng mọc phổ biến dưới bóng râm ở những khe hở có rêu trên những vách đá dốc hoặc trong lổ hổng, chỗ lõm của mặt thềm các vách đá granit trong rừng cây lá rộng thường xanh ở độ cao từ 750-1300m Thời gian ra hoa là khoảng tháng 12 đến sau Tết âm lịch

Phân loại: lan Hài Hồng có tên khoa học là Paphiophedilum delenatii Guillaum

hay Cypripedium delenatii Guillaumin hoặc Paphiopedilum delenatii f albinum Braem thuộc tổ Parvisepalum Aver &Cribb, dưới chi Parvisepalum Karas.& Saito, chi Paphiopedilum Pfitzer, họ Lan Orchidaceae, bộ Lan Orchidales, phân lớp Hành Liliidae, lớp Một lá mầm Monocotyledoneae, ngành Hạt kín Angiospermatophyta [1],[14] Lan Hài Hồng được xếp trong nhóm lan Hài nguyên

thủy, rất tách biệt và có các đặc điểm ít nhiều thể hiện sự trung gian giữa các chi [1]

Tình trạng hiện nay ngoài tự nhiên: đang có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng

1.1.5.2 Vân Hài (Paphiopedilum callosum)

Được mô tả từ cuối thế kỷ 19, Vân Hài hiện được trồng rất phổ biến trong khi ngoài thiên nhiên hầu như không còn tìm được do bị khai thác quá mức Bên cạnh vẻ đẹp quyến rũ của lá và hoa, dễ trồng và dễ khai thác cũng là một trong các nguyên nhân khiến loài hoa quyến rũ này nhanh chóng bị cạn kiệt ngoài tự nhiên

[1] Hầu hết các mô tả về Vân Hài là dựa trên các cây được trồng Theo các nghiên cứu của nhóm tác giả Leonid (2004) thì hiện nay ở Việt Nam khó có thể tìm thấy Vân Hài trong môi trường hoang dại, hầu hết Vân Hài được bày bán trên thị trường trong nước đều có nguồn gốc từ Lào và Camphuchia

Hình thái học: Cây thân cỏ mọc trên đất hoặc đôi khi trên đá với 3-5 lá Lá hình

bầu dục hẹp, bầu dục thuôn hoặc hình trứng ngược, thường có 3 răng ở đỉnh nhọn, dài 10-20cm, rộng 3,2-4,8cm, phủ lông rìa ở gốc, đốm khảm tối và sáng ở mặt trên, đôi khi đốm tía ở mặt dưới gần gốc Cụm 1 hoa, hiếm khi 2 hoa, cao 20-40cm; cuống hoa tía, phủ lông tía, dài 15-20cm, lá hoa hình trứng tới hình bầu dục, nhọn hoặc gần nhọn, dài 1,5-2,8cm, rộng 1,4-2cm, màu xanh, đôi khi có đốm tía, có lông rìa Hoa to, rộng 8-11cm, cánh hoa trắng, xanh hoặc vàng với một phần ba đỉnh màu tía, có đốm nâu thẫm ở mép trên và đôi khi ở nửa dưới, đôi khi cong lại, ít nhiều hình chữ S, dạng lưỡi, tù hoặc tròn ở đỉnh, có lông rìa nâu hạt dẻ; môi nâu tía nhạt, vàng tươi ở gốc, có các mụn lồi tía nâu ở các thùy bên

cong, thường có gân xanh ô liu Lá đài trắng có điểm vài đốm

tía ở nửa dưới, gân tía và xanh; lá đài lưng có các mụn lồi nhỏ

màu bạc ở gần gốc, hình trứng ngược tới gần tròn, chóp nhọn

đột ngột; lá đài hợp hình lòng chảo, bầu dục tới hình mũi giáo

rộng, nhọn Nhị lép hình bán nguyệt, màu trắng hoặc vàng

tươi với gân xanh thẫm, có các thùy bên cong hình lưỡi liềm

hẹp; cuống và bầu dài 3 – 6,5cm, màu xanh có đốm tía, phủ

lông tía Bộ nhiễm sắc thể 2n = 32 [1] Hình 1.3: Vân Hài Đặc điểm sinh thái: Vân Hài là một trong các loài lan Hài có khu phân bố rộng

nhất Vân Hài là loài tự nhiên, đặc hữu của vùng Đông Nam Á [1] Chúng được tìm thấy rải rác cách xa nhau ở Thái Lan, Camphuchia, Lào và Việt Nam (khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên) Vân Hài thường được tìm thấy trong tự nhiên mọc thành từng đám lớn ở khu vực rừng nguyên sinh rậm, cây lá rộng thường xanh, mưa theo mùa và không có thời kỳ thật sự lạnh Thường mọc ở độ cao từ 800-1100m vùng

núi đá granit hoặc đá silic dọc theo các sườn suối, trên mùn lá hoặc đá phủ rêu ở nơi

có ánh sáng khá nhiều và khí hậu tương đối khô Ra hoa vào khoảng từ tháng 4 đến tháng 6 hàng năm [1]

Phân loại: Vân Hài có tên khoa học là Paphiopedilum callosum thuộc tổ Barbata

(Kraenzl.), dưới chi Paphiopedilum, chi Paphiopedilum Pfitzer, họ Lan Orchidaceae, bộ Lan Orchidales, phân lớp Hành Liliidae, lớp Một lá mầm Monocotyledoneae, ngành Hạt kín Angiospermatophyta [1]

Tình trạng hiện nay ngoài tự nhiên: đang bị tuyệt chủng

1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đã đưa ra quan niệm mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [2] Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể tái biệt hóa và phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [18] Cho đến nay con người đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp [2] Tế bào nuôi cấy thường phải là các tế bào có nhân hoàn chỉnh mang toàn bộ thông tin di truyền của loài đó, trong điều kiện thích hợp có thể phân hóa và phát triển thành cây hoàn chỉnh Các hệ thống nuôi cấy mô

thực vật thường được dùng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa, di truyền học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật này hiện nay cũng được sử dụng nhiều trong nhân giống thực vật, sản xuất giống sạch bệnh…, nhất là đối với các loài thực vật quý, có giá trị cao [2],[16],[18]

1.2.1 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

Mô thực vật nuôi cấy trong môi trường nhân tạo cũng cần được cung cấp các chất dinh dưỡng giống như cây được cung cấp từ đất Các chất cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm: các chất vô cơ, nguồn cacbon và các chất hữu cơ và nước [2],[18]

Tùy theo từng loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô mà thành phần môi trường có thể thay đổi để phù hợp Ngoài ra thành phần môi trường còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy là nhân giống, lưu trữ giống hoặc theo mục tiêu nghiên cứu [6],[16]

1.2.1.1 Các loại muối khoáng

Các chất vô cơ bao gồm các thành phần đa lượng (hàm lượng trên 0,5mM)

và vi lượng (hàm lượng dưới 0,05mM) trong môi trường nuôi cấy được thực vật sử dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ [2],[18] Các dạng ion của muối đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hòa áp suất thẩm thấu và điện thế màng [23]

Các loại muối khoáng được bổ sung vào môi trường với nồng độ trên 0,5mM được xếp vào nhóm đa lượng Các muối khoáng được xếp vào nhóm đa

lượng chứa các nguyên tố như: Nitrogen (N), Phosphorus (P), Sulfur (S), Potassium (K), Calcium (Ca) và Magnesium (Mg) thường được bổ sung vào môi trường ở dạng muối mà thực vật dễ hấp thu

Các loại muối khoáng vi lượng vẫn thường được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy để bảo đảm cho sự phát triển của mô như: Boron (B), Chlorine (Cl), Copper (Cu), Manganese (Mn)… với nồng độ dưới 0,05mM

1.2.1.2 Vitamin

Vitamin thường giữ vai trò co-enzyme trong các phản ứng sinh hóa Vitamin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới nhiều dạng và nhiều nồng độ khác nhau, nhưng tất cả các môi trường đều có Thiamin (Vitamin B1) Các Vitamin thường dùng là: Myo-inositol, nicotinic acid (Vitamin PP), Pyridoxine HCl (Vitamin B6)…

1.2.1.3 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan khác nhau của thực vật [23] Chất điều hòa sinh trưởng có vai trò trong quá trình phân chia tế bào, phân hóa mô, phát sinh phôi, ảnh hưởng đến những hoạt động sống chủ yếu của thực vật như quang hợp, hô hấp…[18] Chính vì vậy, chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng và phát

triển ở thực vật

Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường gặp trong nuôi cấy mô là: Auxins, Cytokinins, Gibberellins

1.2.1.4 Các chất bổ sung

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không có khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ vì điều kiện trao đổi khí trong bình nuôi cấy mô

và bên ngoài không thuận lợi Vì vậy cần phải cung cấp thêm cacbon cho mô từ môi trường nuôi cấy Nguồn cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là sucrose với hàm lượng từ 20 – 30g/l

Agar là hợp chất hữu cơ có thành phần không xác định thường được sử dụng để làm đặc môi trường nuôi cấy Độ cứng của môi trường thay đổi tùy theo mỗi loại mô thực vật khác nhau, lượng agar dùng thường trong khoảng từ 8-15g/l môi trường

Than hoạt tính thường được sử dụng với lượng 1g/1lít môi trường trong nuôi cấy mô các loài lan, có vai trò khử độc, hút ẩm, hạn chế hiện tượng hóa nâu mẫu

Ngoài ra, người ta cũng thường bổ sung một số chất hữu cơ nhằm cung cấp thêm một số chất cần thiết cho sự phát triển của mô như: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây… với thành phần không xác định và hàm lượng tùy thuộc vào loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô

1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất

Dưới các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào thực vật có thể nhân lên, hình thành cơ quan và thậm chí có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh Sự tái sinh cây nguyên vẹn từ một nhóm tế bào cây bằng phương pháp nuôi cấy mô thể hiện một bước quan trọng trong nông nghiệp hiện đại

Một số ứng dụng quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô trong nghiên cứu

và sản xuất:

- Tế bào thực vật có thể được dùng như các nhà máy sinh học Việc nuôi cấy huyền dịch trên quy mô lớn có thể dùng để sản xuất các chất kháng khuẩn, ancaloide kháng khối u, các loại vitamine, thuốc diệt côn trùng và các đồ gia vị dùng trong thực phẩm… với số lượng lớn và giá thành rẻ

- Bằng phương pháp này người ta có thể tạo ra nguồn cung cấp một lượng lớn giống cây thương phẩm trong thời gian ngắn và có các đặc tính giống hệt cây

mẹ Đồng thời có thể nhân giống nhanh chóng với số lượng lớn các dòng thực vật

vô tính có các đặc tính di truyền có giá trị

- Rút ngắn thời gian sinh trưởng ở một số cây có thời gian sinh trưởng dài, khó nhân giống có giá trị cao hoặc đang có nguy cơ tuyệt chủng… Tế bào sử dụng trong nuôi cấy thường được lấy từ cây trưởng thành, nên tuy cây tái sinh còn nhỏ nhưng tuổi tế bào của chúng đã trưởng thành, do đó khi đưa vào môi trường nuôi cấy thì thời gian trưởng thành, ra hoa của chúng được rút ngắn Ví dụ: hoa lan có vòng đời từ khi nảy mầm đến khi ra hoa khoảng 7 năm, hoa lan nuôi cấy mô có thời gian từ khi ra vườn ươm đến khi ra hoa khoảng 3 năm [16]

- Thuận tiện cho các nghiên cứu tạo giống cây trồng bằng các phương pháp sinh học hiện đại như: xử lý bằng phóng xạ, hóa chất để gây đột biến, chuyển gen…

Bằng cách sử dụng phương pháp nuôi cấy mô, các yếu tố ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốt hơn trong môi trường chọn lọc Việc gây biến đổi di truyền và chọn lọc có thể tiến hành ở mức tế bào Cây tái sinh mang tính trạng di truyền mới, ít xuất hiện thể khảm Điều này đã rút ngắn đáng kể thời gian chọn lọc và hạn chế các biến dị soma trên thực vật khi tiến hành tạo giống [3] Đồng thời, các nghiên cứu cũng cho thấy xử lý đột biến các mô nuôi cấy cho tần suất biến dị cao hơn, vì tế bào được tiếp xúc trực tiếp với các tác nhân gây đột biến

1.3 TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG MỚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ

Từ xa xưa, lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng mới luôn chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp Từ những thành tựu trong lĩnh vực này mà nền nông nghiệp ngày càng phát triển, cung cấp lương thực, thực phẩm và thỏa mãn các nhu cầu khác của con người Trong thời đại khoa học kỹ thuật phát triển mạnh mẽ như hiện nay, với sự trợ giúp của các ngành khoa học khác, lĩnh vực chọn và tạo giống cây trồng đã phát triển thành một ngành khoa học và ngày càng thu được nhiều thành tựu Một trong các thành tựu nổi bật trong lĩnh vực này là tạo các giống cây trồng đột biến mang các tính trạng chưa hề có trước đây Một trong những công nghệ đóng góp hữu hiệu nhất trong lĩnh vực tạo đột biến trên cây trồng là công nghệ bức xạ Các tia bức xạ như tia UV, tia gamma, tia X và gần đây là tia ion thường được sử dụng nhiều trong thực nghiệm, đặc biệt là trong lĩnh vực nông nghiệp

1.3.1 Đột biến và phân loại đột biến

Đột biến là những biến đổi bất thường, đột ngột, riêng biệt trong vật liệu di

truyền mà kết quả là làm biến đổi vĩnh viễn cấu trúc di truyền do đó làm biến đổi sự biểu hiện tính trạng ở sinh vật Đột biến thường được phân chia dựa trên nguyên nhân gây đột biến, loại tế bào bị đột biến, kiểu thay đổi trong phân tử DNA, đột biến tự nhiên hay nhân tạo [6],[7],[12]

Đột biến làm tăng cường các biến dị, do cấu trúc gen bị biến đổi, có thể tạo

ra các tổ hợp gen mới, từ đó tạo nguồn nguyên liệu cho chọn lọc giống cây trồng Bằng cách tạo đột biến một cách chủ động, người ta có thể làm tăng tốc độ chọn lọc, tạo ra nhiều giống mới trong khoảng thời gian ngắn, phạm vi thực nghiệm hẹp [6],[12]

Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể là biến dị từ những điều kiện bình thường làm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể hoặc cấu trúc của nhiễm sắc thể, những thay đổi như vậy gây ảnh hưởng đến nhiều tính trạng khác nhau trong cơ thể [2]

Đột biến ở mức độ phân tử là đột biến trong chuỗi trình tự của gen ở mức độ từng cặp base Do đó, nó còn được gọi là đột biến gen hoặc đột biến điểm [2],[6]

Nó chỉ ảnh hưởng đến một hoặc một vài tính trạng mà không làm gây ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình của cơ thể Đột biến điểm làm đổi chức năng gen nên đã thu hút được sự quan tâm của các nhà chọn giống thực vật muốn biến đổi một hoặc một vài đặc điểm của giống gốc

1.3.2 Các tác nhân gây đột biến

Các tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố vật lý, hóa học hay sinh học Các nhân tố này có thể làm gia tăng tần số đột biến lên 10 đến 100 nghìn lần Các nhân tố được nghiên cứu kỹ là các tia bức xạ như tia UV, tia gamma, tia X, và các chất hóa học như các chất đồng đẳng của nitơ, các tác nhân alkyl hóa…

1.3.2.1 Tác nhân vật lý

Tác nhân phóng xạ: Các tia bức xạ có tác dụng gây ra sự ion hóa ở các phân tử,

nguyên tử khi xuyên qua tế bào như tia X, gamma, apha và beta, proton, neutron Chính quá trình ion hóa này tạo ra những biến đổi về mặt hóa học, phá hủy cấu trúc nguyên vẹn của nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, tạo ra các biến đổi về mặt di truyền, là nguyên nhân gây đột biến Trong tạo giống đột biến ở thực vật, người ta thường sử dụng tia X quang và tia gamma [6],[30]

Tia X quang là tia điện tử có bước sóng ngắn được tạo ra từ máy chiếu X quang Tia X quang dùng để tạo đột biến thường có độ dài bước sóng ngắn hơn khi dùng trong chẩn đoán y khoa Bước sóng của tia X quang quan hệ tuyến tính với hiệu điện thế của máy phát Khi sử dụng tia X, người ta thường quan tâm đến các chỉ số hiệu điện thế, cường độ dòng điện, thời gian, khoảng cách từ ống nhắm đến mẫu và đặc biệt là độ dày mẫu hấp thu làm giảm ½ năng lượng của tia [30]

Tia gamma là một loại tia phóng xạ thu được khi các đồng vị phóng xạ phân

rã Tia gamma có bước sóng ngắn hơn và do đó nó có năng lượng cao hơn tia X quang Tia gamma được sử dụng tương tự tia X quang trong tạo đột biến ở thực vật

Ưu điểm của tia gamma là nó có thể được sử dụng trong nhà kính hoặc ở cánh đồng

để thực vật tiếp xúc trong thời gian dài Các đồng vị thường dùng để tạo tia gamma trong tạo giống đột biến ở thực vật là Cobalt – 60 và Cessium -137 [30]

Tia UV là loại tia bức xạ không gây ion hóa nhưng có khả năng gây ra đột biến với tần số khá cao do có bước sóng trùng với bước sóng hấp phụ của DNA Khi các nguyên tử của phân tử DNA hấp thu năng lượng của tia bức xạ UV thì các điện tử vòng ngoài bị kích thích sẽ làm các liên kết yếu trong phân tử bị phá vỡ và trật tự liên kết trong phân tử DNA có thể bị thay đổi dẫn tạo ra đột biến điểm hay đột biến cấu trúc [30]

Sốc nhiệt:Sự thay đổi nhiệt độ là một trong các tác nhân vật lý gây đột biến đối với

cơ thể sinh vật Các nghiên cứu đã cho thấy sự tăng giảm nhiệt độ trong môi trường thường ít có tác động đến các biến đổi trong vật chất di truyền Tuy nhiên, nếu gây sốc nhiệt bằng cách tăng hay giảm nhiệt độ cơ thể hơn mức trung bình trong một khoảng thời gian rất ngắn thì tần số đột biến của cơ thể có sự thay đổi rõ rệt Cơ chế gây đột biến được giải thích do cơ chế nội cân bằng của cơ thể không phản ứng kịp với sự thay đổi quá lớn và đột ngột của nhiệt độ gây ra các chấn thương trong bộ máy tế bào, dẫn đến sự sai hỏng trong vật liệu di truyền [6],[30]

1.3.2.2 Tác nhân hóa học

Được sử dụng từ những năm 1930 bởi các nhà khoa học Nga, các chất hóa học gây đột biến và sau đó là các chất gây siêu đột biến hiện được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng Các chất gây đột biến thường dùng là: EL, DMS, DES, NEU, NMU, EMS… Loại chất gây đột biến, nồng độ, thời gian xử lý mẫu tùy thuộc vào từng loại thực vật và giai đoạn phát triển của mẫu Mẫu sử dụng có thể là hạt khô, hạt nẩy mầm, chồi, củ hoặc tiêm trực tiếp vào cơ quan sinh sản, hợp tử…[6]

Trong một số trường hợp, các chất hóa học gây đột biến cho hiệu quả cao hơn là các tia bức xạ, tỉ lệ sống ở mẫu cũng cao hơn Tuy nhiên người ta có khuynh hướng sử dụng các loại tia phóng xạ trong chọn tạo giống cây trồng vì mục tiêu chọn giống Nhiều nghiên cứu cho thấy nếu mục tiêu chọn lọc là chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, điều kiện môi trường, phá vỡ phản ứng quang chu kỳ, kháng sâu bệnh, thay đổi màu sắc, hình dạng của hoa thì xử lý bức xạ sẽ cho hiệu quả cao hơn [6]

1.3.3 Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống

Tương tác của bức xạ ion hóa với cơ thể sống là kích thích và ion hóa các phân tử và nguyên tử Các tổ chức tế bào của cơ thể sau khi bị kích thích bởi năng lượng bức xạ sẽ biến đổi qua hai giai đoạn:

Giai đoạn hóa lý: giai đoạn này rất ngắn (10-13 – 10-16giây), trong giai đoạn này, các phân tử sinh học chịu tác động trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa Các tổn thương này gọi là tổn thương hóa sinh [6],[12]

- Tác dụng trực tiếp bức xạ trực tiếp ion hóa và kích thích các phân tử sinh học, gây biến đổi cấu trúc và làm tổn thương các phân tử đó

- Tác dụng gián tiếp (theo thuyết gốc tự do): bức xạ ion hóa tác dụng lên các phân tử nước trong tế bào gây ra quá trình xạ phân (radiolyse) tạo ra các ion H+,

OH-, các gốc tự do OH0, H0 và các sản phẩm oxy hóa mạnh như H2O2 và HO2 Các sản phẩm của quá trình này rất hoạt động về mặt hóa học, tác động và làm tổn thương lên các phân tử sinh học

Giai đoạn sinh học: nếu các tổn thương hóa sinh xảy ra trong giai đoạn hóa lý

không hồi phục được sẽ gây ra những thay đổi trong chuyển hóa dẫn đến những thay đổi về hình thái và chức năng Giai đoạn này có thể kéo dài hay ngắn tùy thuộc vào mức độ tế bào hay tổ chức bị tổn thương

Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái cũng như thay đổi chức năng trong tế bào và mô Nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước cho rằng bức xạ không tạo ra chức năng mới trong tế bào và mô mà bức xạ làm thay đổi các chức năng sẵn có hay làm xuất hiện các chức năng trước đó tiềm tàng

Cơ chế gây đột biến do phóng xạ: sự tương tác của các tia phóng xạ lên hệ thống

gây nên sự biến đổi cấu trúc DNA làm cơ thể bị đột biến [6],[11],[12] Có hai giả

thuyết chính để giải thích hiện tượng này:

- Thuyết “bia”: sự xuất hiện các sai lệnh ở DNA xảy ra một các tức thời với xác xuất phụ thuộc vào cơ hội bắn trúng “bia” của tia phóng xạ Dựa vào thuyết này, người ta giải thích được mối liên quan giữa liều chiếu xạ và tần số xuất hiện đột biến Thuyết này cũng là nền tảng xây dựng các nguyên tắc của di truyền phóng

xạ Tuy nhiên, các nghiên cứu sau này đã chứng minh thuyết “bia” chưa đầy đủ do

nó chưa giải thích được các yếu tố của điều kiện môi trường và điều kiện sinh lý của cơ thể có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả của quá trình xử lý phóng xạ

- Thuyết “gốc tự do”: thuyết này cho rằng tác động gây đột biến trên tế bào sống của tia phóng xạ là tác động gián tiếp Thoạt đầu, tia phóng xạ ion hóa nước, vốn là thành phần vật chất chủ yếu trong mọi tế bào sống Nước bị ion hóa tạo thành các gốc tự do, các gốc tự do có thể tương tác với nhau tạo thành chất chất oxy hóa mạnh đồng thời tương tác với các phân tử sinh học trong tế bào Các tương tác này nếu đủ mạnh và số lượng đủ nhiều thì sẽ gây ra các biến đổi trong thành phần

và số lượng của các nucleotit của phân tử DNA Tùy theo nguồn năng lượng dự trữ của gốc tự do mà có thể gây ra các biến đổi lớn trong cấu trúc của phân tử DNA hoặc các đột biến nhỏ trong thành phần nucleotit của gen (còn gọi là đột biến điểm) Như vậy, tuy chưa đầy đủ nhưng nếu giải thích cơ chế gây đột biến theo thuyết này

có thể giải thích được sự phụ thuộc của tần số đột biến vào liều chiếu xạ, điều kiện môi trường, điều kiện sinh lý của cơ thể…

1.3.4 Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng trong tạo giống cây trồng

Nguyên tắc cơ bản để gây tạo đột biến thành công là dựa vào đặc điểm sinh trưởng, phát triển, kiểu gen của từng đối tượng để chọn phương pháp và tác nhân gây đột biến thích hợp [6],[7],12] Trong chọn tạo giống cây trồng bằng cách gây

đột biến, người ta thường sử dụng bức xạ ion hóa (rơnghen, nơtron, gamma và mới đây là ion beam) Nhờ quá trình ion hóa vật liệu trong tế bào gây ra sự biến đổi tạm thời hay vĩnh viễn trong tế bào khi tế bào tiếp xúc với tia bức xạ

Trong quá trình chọn lọc sau khi đột biến có thể một số đột biến không thể hiện ở thế hệ M1 mà chỉ thể hiện sau đó vài thế hệ nên cần quan sát tỉ mỉ và theo dõi

có phương pháp qua hai đến bốn thế hệ trước khi đưa vào ứng dụng ở quy mô nhỏ Sau đó, quy mô có thể được mở rộng dần ở các thế hệ tiếp theo khi giống mới đã có tính ổn định về mặt di truyền, trước khi tiến hành khảo nghiệm giống để đưa ra sản xuất đại trà [6],[20],[21]

Các nghiên cứu về đột biến do phóng xạ đã chỉ ra: trong một giới hạn liều lượng, tần số các đột biến phụ thuộc tuyến tính vào liều lượng chiếu xạ [11],[21] Mặt khác, đối với các loài thực vật khác nhau, độ tuổi, bộ phận khác nhau có độ mẫn cảm khác nhau đối với bức xạ Do đó, để thu được đột biến mong muốn, người

ta cần chiếu xạ ở liều lượng thích hợp để tạo ra nhiều đột biến cho chọn lọc mà không làm chết nhiều cây cũng như làm tăng độ bất thụ của chúng [6],[21] Đó là liều lượng tới hạn mà ở mức liều này, số lượng đột biến thu được nhiều nhất, thường được xác định trong khoảng gần liều LD50 Liều LD50 là liều mà khi hấp thụ, 50% số cá thể được sử lý bức xạ bị chết (hoặc hạt giống không nảy mầm)

Nhiều nghiên cứu về đột biến cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về bản chất giữa các đột biến nhân tạo và đột biến tự nhiên Các dạng đột biến trong tự nhiên đều thấy xuất hiện trong các phổ đột biến nhân tạo Điều khác biệt cơ bản giữa hai dạng đột biến này là tần số đột biến Các nghiên cứu cũng cho thấy tần số đột biến do xử lý bằng bức xạ cao hơn tần số đột biến tự nhiên khoảng 1000 lần hoặc hơn nữa tùy theo liều lượng, loại tia bức xạ và kiểu gen của thực vật Do đó, ở thế hệ M2 có thể phát hiện 0,2-7,0% cá thể đột biến hoặc hơn nữa, trong đó có nhiều

cá thể mang nhiều đột biến [6]

Một số hạn chế của phương pháp chọn tạo giống bằng bức xạ ion hóa:

- Cho đến nay, quá trình phát sinh đột biến chưa được định hướng, đặc biệt đối với các đột biến mong muốn Do đó gặp nhiều khó khăn trong quá trình chọn lọc

- Rất nhiều biến đổi của DNA và nhiễm sắc thể có thể được phục hồi, chỉ một số ít thực sự trở thành đột biến và thể hiện ở kiểu hình

- Khi có sự biến đổi trong genome sẽ gây mất cân bằng và rối loạn trong hoạt động sống của cơ thể thực vật, hơn nữa hầu hết các đột biến là bất lợi cho cơ thể nên công tác chọn lọc và tạo dòng sau khi xử lý gây đột biến rất khó khăn và phức tạp [6]

Phương pháp tạo giống bằng thực nghiệm được coi là một trong các thành tựu to lớn của thế kỷ 20, có vai trò quyết định đối với cuộc Cách mạng xanh vào thập niên 1960 Đến đầu thập niên 1990 đã có 1364 giống đột biến được tạo ra trên thế giới, trong đó khoảng 90% là do xử lý bức xạ [6] Hầu hết các giống cây trồng phổ biến hiện nay như: ngũ cốc (lúa, lúa mì, lúa mạch, ngô…), chuối, đậu (đặc biệt

là đậu tương), bông, lê, nho, cam, quýt…, các giống hoa như: cẩm chướng, cúc, hồng, lan…đều có các dòng đột biến; một số trường hợp dòng đột biến được ưa thích hơn trong trồng trọt như lúa, ngô, đậu tương, hầu hết các giống hoa vì các ưu điểm nổi bật của chúng Theo thống kê của Cơ quan Năng lượng Nguyên tử quốc tế (IAEA) đến nay đã có hơn 3100 giống mới của 170 loài được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến được công bố bởi hơn 60 quốc gia khác nhau [52], trong đó Việt Nam đóng góp hơn 50 giống chủ yếu là lúa gạo và đậu tương Là một quốc gia nông nghiệp, Việt Nam rất chú trọng công tác nghiên cứu, cải tạo và chọn lọc giống cây trồng Hiện nay, Việt Nam là một trong 10 quốc gia tạo ra nhiều giống thực vật đột biến nhất

Chiếu xạ kết hợp với nuôi cấy in vitro đã được chứng minh bằng thực

nghiệm là phương pháp có giá trị để tạo ra các đột biến mong muốn và nhân giống nhanh, đặc biệt là ở thực vật [6],[12],[21] Các nghiên cứu về gây tạo đột biến trên thực vật cho thấy các cơ quan sinh dưỡng mẫn cảm hơn hạt khô hay hạt đang ngủ nghỉ Tế bào thực vật có khả năng phân hóa thành cơ thể mới nên những đột biến

gây tạo trong nuôi cấy in vitro có thể được nhân lên bằng sinh sản sinh dưỡng [12]

Đầu những năm 1990, những nghiên cứu về đột biến gây tạo bằng chiếu xạ trên

mẫu in vitro được tiến hành trên chuối và khoai tây Hiện nay, kỹ thuật này đã được

sử dụng rộng rãi trên những cây trồng nhân giống vô tính khác như lúa, cúc, đậu, lê, cẩm chướng [6],[12]

Các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng phóng xạ cho thấy, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu tạo giống cây trồng bằng phương pháp bức xạ có một số ưu điểm:

- Nhiều yếu tố ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốt hơn

- Sử dụng tế bào trần, tế bào riêng lẻ để gây tạo đột biến làm cho việc chọn lọc và tạo dòng thuần được dễ dàng và nhanh chóng

- Khả năng thu được biến dị dạng thể khảm rất thấp nên thuận tiện cho công tác chọn lọc và tạo dòng

- Tần suất đột biến thường khá cao bởi vì mỗi tế bào đều có cơ hội tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây đột biến

- Hàng chục dòng biến dị tiềm năng có thể được chọn lọc nhanh chóng chỉ sau một vài thế hệ, ít tốn kém, tốc độ tạo dòng thuần nhanh [6],[12]

Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có một vài hạn chế:

- Môi trường nuôi cấy in vitro có thể làm xuất hiện một vài biến dị dạng

thường biến xuất hiện do lỗi khi dịch mã DNA làm ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc và tạo dòng đột biến

- Thời gian thế hệ trong nuôi cấy in vitro khác với in vivo, một số giai đoạn sống của thực vật không diễn ra trong điều kiện in vitro do đó không chọn lọc được

các biến đổi chỉ biểu hiện trong giai đoạn này ví dụ như màu sắc, hình dạng hoa và cánh hoa, quả…

- Đòi hỏi trang bị phòng cấy mô, nuôi mô, hóa chất, kỹ thuật công nghệ nuôi cấy mô…

- Để nâng cao hiệu quả chọn lọc dòng đột biến tiềm năng, người ta thường sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra các biến đổi DNA Do đó nhà tạo giống cần phải có kiến thức về di truyền phân tử [6],[12]

1.4 CHỌN LỌC DÒNG BIẾN DỊ

Chọn lọc là một quá trình quan trọng trong chọn tạo giống để hoàn thiện một hay nhiều đặc trưng của cây trồng Đây là quá trình giữ lại các kiểu gen mong muốn và loại bỏ các kiểu gen không phù hợp Trong một quần thể, qua việc chọn lọc các tính trạng kiểu hình có thể nhận biết được thì tần số kiểu gen bị biến đổi Các biến đổi này tiếp tục được nhân lên nhờ quá trình sinh sản hữu tính hình thành quần thể mới [6],[21]

Chọn giống cây trồng là một hoạt động thường xuyên từ xa xưa của các nước nông nghiệp Từ các quần thể cây hoang dại, qua quá trình thuần hóa, chọn lọc các tính trạng phù hợp với nhu cầu của mình, con người đã tạo ra quần thể các loài cây trồng có đặc tính khác biệt so với quần thể gốc, thậm chí đến mức hình thành một loài mới Ngày nay, nhờ các tiến bộ trong sinh học phân tử, người ta có thể rút ngắn thời gian chọn lọc bằng cách sử dụng kỹ thuật di truyền trong chọn lọc giống cây trồng bên cạnh phương pháp chọn lọc trên kiểu hình trước đây [2],[13]

Tổ chức bộ gen của thực vật có thể phức tạp hơn những bộ gen đã được nghiên cứu của phần lớn các cơ thể nhân thực khác Độ phức tạp này không chỉ thể hiện ở mức độ trình tự và số lượng nucleotit mà còn ở mức độ nhiễm sắc thể Ở thực vật, sự nhân đôi toàn bộ bộ nhiễm sắc thể có thể dẫn đến sự biến đổi chỉ số mức bội thể (variable ploidy number) thậm chí bên trong một giống nào đó [13] Khi cây thích nghi với môi trường không đồng nhất, lượng biến dị di truyền có thể đóng góp đáng kể cho sự sống còn và cho khả năng nhân lên của chúng Nhìn chung, cỡ hệ gen thực vật (cả số nhiễm sắc thể và số lượng, thành phần nucleotide) thể hiện sự biến dị lớn nhất so với mọi giới trong thế giới sinh vật [13]

1.4.1 Chọn lọc dựa trên karyotype của thực vật

Tất cả các tế bào của một loài có số lượng nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài đó Mỗi nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trưng, rõ nhất ở kỳ giữa của nguyên phân Một nhiễm sắc thể gồm có 1 tâm động là điểm thắt eo chia nhiễm sắc thể thành hai vai với chiều dài khác nhau gọi là p (vai ngắn) và q (vai dài) [13] Dựa vào vị trí tâm động có thể phân biệt hình thái nhiễm sắc thể: tâm giữa khi hai vai bằng nhau, tâm đầu khi hai vai không bằng nhau và tâm mút khi tâm động nằm gần đầu mút của một vai

Do sự ổn định về hình thái của mỗi nhiễm sắc thể và sự cố định về số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào dinh dưỡng của loài nên sự mô tả hình thái, số lượng nhiễm sắc thể được gọi là kiểu nhân (karyotype) đặc trưng cho mỗi loài Kiểu nhân có thể được biểu hiện ở dạng nhiễm sắc đồ khi nhiễm sắc thể được xếp theo thứ tự bắt đầu từ dài nhất đến ngắn nhất

Việc mô tả và thể hiện nhiễm sắc đồ là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến và có độ tin cậy khá cao trong nghiên cứu phân loại thực vật

bậc cao, đặc biệt là đối với các loài họ hàng có hình thái và đặc tính tương đối giống nhau, khó phân biệt bằng các chỉ tiêu hình thái [13]

1.4.2 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 đã góp phần tạo ra cuộc cách mạng trong sinh học phân tử [5],[6] Sử dụng kỹ thuật PCR

có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của đoạn DNA mục tiêu một cách nhanh

chóng mà không cần tách dòng, nhân dòng hay sử dụng các tế bào sinh vật sống

1.4.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR

Về cơ bản, PCR là một phương pháp tạo dòng in vitro cho phép nhân bản

nhanh một đoạn DNA dựa trên cơ sở đặc tính hoạt động của các DNA polymerase

mà không cần sự hiện diện của tế bào DNA polymerase có tự nhiên trong cơ thể sống, thực hiện chức năng sao chép DNA trước khi tế bào phân chia

Trong phản ứng PCR, DNA polymerase khi tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch khuôn cần sự hiện diện của các mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp với mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối nucleotide vào mồi để hình thành mạch DNA mới [5],[6]

1.4.2.2 Quy trình của kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau Mỗi chu

kỳ gồm 3 bước [5]:

- Bước 1: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 940C- 950C trong vòng 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn biến tính (denaturation)

- Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C-700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn lai (hybridization)

- Bước 3: nhiệt độ được tăng lến đến 720C, giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation)

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi số lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán thì sau 30 chu kỳ, sự khuyếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu [5]

1.4.2.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Từ khi ra đời đến nay, kỹ thuật PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu