Để nghiên cứu tác động của tia bức xạ lên mẫu lan Hài in vitro, chúng tôi tiến hành chiếu xạđối với mẫu PLB, chồi và cây in vitro lan Hài Hồng và Vân Hài như sau:
+ Chiếu xạ trên nguồn Gamma 60Co: Các mẫu PLB được chiếu xạ trong đĩa pettri, các mẫu chồi và cây tái sinh được chiếu xạ trong hộp nhựa với các liều chiếu 10-100Gy (đối với mẫu PLB) và 10-150Gy (đối với mẫu chồi và cây).
+ Chiếu xạ trên máy gia tốc ion: Chỉ tiến hành đối với mẫu PLB có đường kính ≤ 1,0mm và cấy một lớp trên bề mặt môi trường trong đĩa pettri nhựa có đường kính 6cm, bên trên phủ bằng lớp giấy bóng kính mỏng chuyên dụng đã được khử trùng để đảm bảo độ vô trùng nhưng không ngăn cản tia bức xạ ion hóa đi qua khi chiếu xạ mẫu. Liều chiếu được lựa chọn từ 2-4Gy.
2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau khi chiếu xạ
Các mẫu PLB, chồi và cây đã tái sinh hoàn chỉnh được chiếu xạở các liều xạ từ 10-150Gy. Các mẫu sau khi chiếu xạđược nuôi cấy trong môi trường phù hợp và xác định số lượng mẫu sống sau thời gian 2 tháng và 4 tháng nuôi cấy để xác định liều xạ mà tại đó số mẫu bị chết 50% trong tổng số mẫu chiếu xạ (LD50).
2.2.3.3 Tạo và xác định các dòng biến dị
Để tạo các dòng biến dị, các PLB, mẫu chồi và cây đã tái sinh được chiếu xạ với các liều xạ khác nhau trong khoảng liều gần với giá trị LD50 đã được xác định. Mẫu sau khi chiếu xạđược nhân nuôi để xác định các cá thể biến dị.
2.2.4 Chọn lọc sau chiếu xạ
2.2.4.1 Chọn lọc cây có biểu hiện khác biệt về kiểu hình trong nuôi cấy
in vitro
Sau khi chiếu xạ, tiếp tục tiến hành nuôi cấy và quan sát để chọn lọc các cây có biểu hiện biến dị trên kiểu hình dựa trên các chỉ tiêu về hình thái như hình dạng màu sắc của lá và thân và chiều rộng, chiều dài lá, độ dày của phiến lá...
Các mẫu có biểu hiện biến dị về kiểu hình được nuôi cấy riêng và tiếp tục quan sát các thế hệ tiếp theo (2 – 3 thế hệ) để đánh giá tính ổn định của các đặc tính biến dị mới hình thành.
2.2.4.2 Kiểm tra sự biến đổi di truyền
Các cây có biểu biện đặc tính biến dị sau khi đã được chọn lọc ổn định qua 2 thế hệ trong nuôi cấy in vitro được sử dụng để tiến hành kiểm tra vật liệu di truyền.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành kiểm tra DNA mẫu cây có biến dị và mẫu đối chứng bằng phương pháp Random Amplified Polymorphic DNA Analysis (RAPD). Mẫu sử dụng để kiểm tra là mẫu lá của cây có đặc điểm biến dị được chọn lọc ở phần trước và cây đối chứng.
Quy trình thao tác:
Tách chiết DNA từ mẫu lá:
- Thu 0,1g mẫu lá của cây tái sinh hoàn chỉnh in vitro, cắt nhỏ, nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Chuyển nhanh vào ống eppendorf. Mỗi mẫu thực hiện 2 ống eppendorf.
- Thực hiện quy trình tách chiết DNA thực vật của hãng QIAGEN với một số thay đổi về thời gian ủ mẫu trong nước nóng và đá lạnh.
Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA:
- Đo OD bằng máy quang phổ hấp thụ Biophotometer của hãng Eppendorf (Đức).
Vùng đo ở bước sóng 260nm – 280nm, sử dụng dụng dịch đệm AE của bộ kit để làm chuẩn.
Đo mẫu gồm 90ml dung dịch đệm và 10ml DNA mẫu (hệ số pha loãng 10 lần). - Tính toán hàm lượng và độ tinh sạch của DNA:
Hàm lượng DNA (ng/µl): OD260x hệ số pha loãng.
Độ sạch DNA: OD260/OD280.
- Điện di để kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8% trong điện trường có cường độ 0,3mA, hiệu điện thế 80V.
Tiến hành phân tích theo phương pháp RAPD với 20 mồi:
- Mỗi eppendorf gồm: 2,5µl dung dịch đệm PCR; 2,5 µl dNTPs; 0,25 µl Taq polymerase (0,2 µl/u); 0,6 µl primer; 50ng DNA khuôn; nước cất vừa đủ 25µl; trộn đều hỗn hợp (hóa chất được đặt trong môi trường đá để không bị mất hoạt tính).
- Tiến hành phản ứng PCR gồm 3 bước: Bước 1: T= 940C, 3 phút.
Bước 2 gồm 40 chu kỳ: T=940C, 1 phút; T= 370C, 1,5 phút; T=720C, 2,5 phút.
Bước 3: T=720C, 5 phút; sau đó lưu giữở 40C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tên và trình tự các đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng để phân tích được liệt kê trong bảng 2.5.
Bảng 2.5 Tên và trình tự các đoạn mồi
STT Tên mồi Trình tự STT Tên mồi Trình tự
1 OPD1 3’ACCGCGAAGG5’ 11 OPD11 3’AGCGCCATTG5’
2 OPD2 3’GGACCCAACC5’ 12 OPD12 3’CACCGTATCC5’
3 OPD3 3’GTCGCCGTCA5’ 13 OPD13 3’GGGGTGACGA5’
4 OPD4 3’TCTGGTGAGG5’ 14 OPD14 3’CTTCCCCAAG5’
5 OPD5 3’TGAGCGGACA5’ 15 OPD15 3’CATCCGTGCT5’
6 OPD6 3’ACCTGAACGG5’ 16 OPD16 3’AGGGCGTAAG5’
7 OPD7 3’TTGGCACGGG5’ 17 OPD17 3’TTTCCCACGG5’
8 OPD8 3’GTGTGCCCCA5’ 18 OPD18 3’GAGAGCCAAC5’
9 OPD9 3’CTCTGGAGAC5’ 19 OPD19 3’CTGGGGACTT5’
Điện di sản phẩm RAPD:
- Gel agarose 1,5% (25% agarose tinh, 75% agarose thường), dung môi là TBE 0,5X.
- Nhuộm gel bằng Ethidiumbromide 0,5 µg/ml (4,5µl trong 200µl TBE 0,5X).
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.
- Sản phẩm từ quy trình RAPD được phân tích thông qua kết quảđiện di. Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các band có độ dài ước tính tương ứng trên kết quảđiện di giữa các mẫu khác nhau của cùng một mồi ngẫu nhiên để xác định có hay không có sự sai khác giữa genome của các dòng biến dị so với mẫu đối chứng.
2.2.5 Xử lý thống kê số liệu
Các thí nghiệm được bố trí theo mô hình khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Các số liệu sau khi thu thập được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA sử dụng các hàm tính toán trong Microsoft Excel.
Kết quảđiện di sản phẩm RAPD được tính toán và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG VÀ NUÔI CẤY MÔ LAN HÀI
3.1.1 Điều kiện khử trùng mẫu
Tái sinh mẫu là bước đầu tiên và do đó nó là bước rất quan trọng trong quy trình nhân nhanh thực vật bằng nuôi cấy in vitro. Nếu bước tái sinh mẫu không thành công thì các bước tiếp theo không thể tiến hành và do đó toàn bộ quy trình nhân nhanh sẽ không thể thực hiện được.
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng hoạt chất Ca(OCl)2 10% để khử trùng đỉnh sinh trưởng, phát hoa và trái lan Hài. Kết quả nhận được ở bảng 3.1 và 3.2 cho thấy với nồng độ Ca(OCl)2 10% và thời gian xử lý là 25 phút cho kết quả tối ưu. Thực nghiệm cho thấy nếu trái lan Hài đã bị nứt nẻ hoặc nhiễm bệnh thì đa số là bị nhiễm.
Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng 6 tuần
Tình trạng mẫu đạt (%) nhiễm (%) chết (%) TT Thời gian khử trùng, phút HH VH HH VH HH VH 1 10 0 0 88 92 12 8 2 15 0 0 70 81 30 19 3 20 2 8 50 48 48 44 4 25 50 70 0 0 50 30
Bảng 3.2 Tình trạng mẫu hạt lan Hài sau khử trùng và gieo hạt 10 tuần Tình trạng mẫu đạt (%) nhiễm (%) TT Thời gian khử trùng, phút HH HH 1 15 67 33 2 20 83 17 3 25 100 0
Để tái sinh mẫu thành công, mẫu phát triển mạnh, không bị nhiễm nấm, nhiễm khuẩn thì bước khử trùng mẫu là rất cần thiết. Tùy theo từng loại đối tượng, từng loại mẫu mà loại chất khử trùng cũng như thời gian khử trùng được thay đổi cho phù hợp. Cũng từ thực nghiệm cho thấy, nếu thời gian khử trùng quá ngắn hay quá dài đều không thu được hiệu quả tốt khi tiến hành tái sinh mẫu.
3.1.2 Khảo sát môi trường tạo callus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Callus chỉ có thểđược hình thành trên môi trường có bổ sung auxin với nồng độ cao, trong đó 2,4D là chất thường được sử dụng trong môi trường tạo callus đối với đa số các mẫu thực vật [2],[16],[18]. Nhiều nghiên cứu cho thấy hợp chất này cũng có tác dụng tạo callus trên mẫu cấy là lan Hài, nhưng hiệu quả sẽ cao hơn nếu được sử dụng phối hợp với NAA hoặc TDZ, phối hợp với TDZ sẽ cho hiệu quả cao hơn phối hợp với NAA [27],[31]. Trong phần này, chúng tôi sử dụng phối hợp 2,4D và TDZ với các nồng độ khác nhau để khảo sát nồng độ phối hợp thích hợp nhất cho mục đích tạo callus ở lan Hài. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.3
Kết quả nhận được từ bảng 3.3 cho thấy 2,4D là tác nhân chính trong quá trình hình thành callus ở lan Hài. Khi môi trường có hàm lượng 2,4D nhỏ hơn 4mg/l thì không ghi nhận được sự hình thành callus ở tất cả các nghiệm thức. Nồng độ 2,4D từ 5mg/l trở lên có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành callus trong môi trường. Các kết quả thực nghiệm cũng cho thấy nghiệm thức sử dụng phối hợp 2,4D với TDZ không những có tỉ lệ tạo callus cao hơn mà các mẫu còn không bị nâu vàng, nồng độ cho kết quả tối ưu là 2,4D 10mg/l:0,1mg/l TDZ. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Lin (2000) trên một đối tượng lan Hài khác [38]. Khảo sát cũng cho thấy tỉ lệ tạo callus ở lan Hài Hồng (96%) cao hơn so với mẫu Vân Hài (83%).
Chúng tôi cũng nhận thấy rằng so với nhiều đối tượng khác thì việc tạo callus lan Hài rất khó khăn không chỉ yêu cầu điều kiện nuôi cấy mà thời gian hình thành callus khá dài (khoảng 90 ngày). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu nhân giống trên đối tượng lan Hài trước đây [37],[43]. Các mẫu callus hình thành khi được chuyển sang môi trường khoáng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thì kết quả cho thấy hầu hết các mẫu đều hình thành PLB trong khoảng thời gian 8 – 12 tuần khi nuôi cấy trong điều kiện sáng.
Bảng 3.3 Khả năng tạo callus từ PLB
Nồng độ ĐHST, mg/l
Hài Hồng Vân Hài
STT 2,4D TDZ % mẫu tạo callus % mẫu tạo PLB % mẫu chết % mẫu tạo callus % mẫu tạo PLB % mẫu chết 1 0 0 0 95 5 0 99 1 2 0 0,1 0 95 5 0 99 1 3 0 0,5 0 95 5 0 100 0 4 0 1,0 0 97 3 0 100 0 5 1,0 0,1 50 47 3 30 70 0 6 1,0 0,5 44 52 4 32 66 2 7 1,0 1,0 42 53 5 35 65 0 8 5,0 0,1 52 46 2 40 60 0 9 5,0 0,5 54 42 4 45 54 1 10 5,0 1,0 56 39 5 47 52 1 11 10,0 0,1 96 2 2 83 15 2 12 10,0 0,5 82 12 6 71 24 5 13 10,0 1,0 80 12 8 76 14 10
3.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB
Protocorm like body (PLB) của lan được xem là một cấu trúc sinh tạo cơ quan. Các tế bào bề mặt của PLB có tiềm năng tương tự tế bào phôi, từđó chúng dễ phát sinh nhiều đỉnh sinh trưởng bất định [18]. Chính vì vậy, từ các PLB chúng ta có thể thực hiện quá trình nhân giống với hệ số nhân cao.
Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy khả năng nhân nhanh PLB của lan Hài tỏ ra rất hạn chế nếu bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ, kể cả khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ cao thì hầu hết các mẫu đều hình thành chồi thay vì tạo PLB. Nhưng khi phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng thì khả năng tạo PLB của lan Hài được cải thiện rõ rệt.
Các nghiên cứu về nhân giống lan Hài của Lê Quang Luân (2007) [8],[9] cho thấy sử dụng BA với nồng độ 2mg/l cho kết quả nhân nhanh PLB rất tốt. Do đó trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng BA 2mg/l kết hợp với NAA để khảo sát tác động của các chất điều hòa sinh trưởng này lên khả năng nhân nhanh PLB của lan Hài. Kết quả cho ở bảng 3.4 cho thấy nghiệm thức phối hợp giữa BA với nồng độ 2mg/l và NAA với nồng độ 0,1mg/l cho kết quả tạo PLB rất tốt. Kết quả này cho thấy việc sử dụng kết hợp giữa BA và NAA cho hiệu quả tạo PLB cao hơn khi sử dụng kết hợp 2,4-D và TDZ như nghiên cứu trước đây [38]. Chúng tôi cũng nhận thấy môi trường có bổ sung NaH2PO4 và oligochitosan cho kết quả tốt hơn môi trường không bổ sung hai chất này.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB
Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, mg/l
Hệ số nhân STT Môi trường cơ bản BA NAA HH VH 1 0 1,0 1,0 2 0,1 5,8 6,1 3 0,2 5,1 5,4 4 0,3 4,9 5,2 5 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa 2,0 0,5 4,8 5,0 LSD0,05 0,7 0,7 6 0 2,2 2,1 7 0,1 10,3 10,7 8 0,2 7,4 7,9 9 0,3 6,9 7,4 10 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 2,0 0,5 6,6 7,1 LSD0,05 0,4 0,6 11 0 3,24 3,0 12 0,1 11,8 11,9 13 0,2 8,9 9,3 14 0,3 7,5 7,9 15 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 + 50mg/l oligochitosan 2,0 0,5 7,1 7,5 LSD0,05 0,5 1,2
3.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi.
Trong kỹ thuật nhân giống in vitro, lan Hài là loại cây được cho là rất khó khăn trong vấn đề gia tăng hệ số nhân. Trên cơ sở tham khảo các công trình trước đây đã nghiên cứu trên một số đối tượng lan Hài khác [38], chúng tôi chọn môi trường cơ bản là môi trường ½ MS bổ sung niacine, myo-inositol, thiamine-HCl và các chất điều hòa sinh trưởng như BA, NAA và TDZ. Kết quảđược ghi nhận trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi của lan Hài.
Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, mg/l Hệ số nhân chồi STT Môi trường cơ bản BA TDZ NAA HH VH 1 0 2,4 2,6 2 1,0 4,1 4,5 3 2,0 5,1 5,6 4 1/2 khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 3,0 0 0 3,5 3,9 LSD0,05 0,3 0,3 5 0 2,4 2,6 6 0,5 7,9 8,6 7 1,0 6,0 6,6 8 1/2 khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 0 1,5 0 5,1 5,5 LSD0,05 0,3 0,4 9 0 2,4 2,6 10 0,1 3,1 3,3 11 0,5 3.0 3,2 12 1/2 khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 0 0 1,0 2,4 2,6 LSD0,05 0,3 0,3 13 0 2,4 2,6 14 0,1 11,9 13,3 15 0,2 7,5 8,2 16 1/2 khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 0 0,5 0,3 6,2 6,8 LSD0,05 0,4 0,5
Kết quả của các nghiệm thức cho ở bảng 3.5 chứng tỏ ở môi trường cơ bản có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho hệ số nhân chồi cao hơn môi trường không được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Hoạt chất TDZ thể hiện tác động ở mức cao hơn NAA và BA. Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy nghiệm thức phối hợp TDZ với hàm lượng 0,5mg/l và NAA 0,1mg/l cho hiệu quả nhân chồi cao nhất.
a
b
a
d c
Hình 3.1 Mẫu lan Hài in vitro ở các giai đoạn khác nhau
3.1.5 Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh
Nhiều nghiên cứu về nhân nhanh lan Hài bằng phương pháp nuôi cấy mô trước đây cho thấy mặc dù giai đoạn tái sinh cây hoàn chỉnh thông thường là giai đoạn đơn giản nhất trong quy trình, nhưng đối với lan Hài thì giai đoạn này không dễ dàng như các giống lan khác [38]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát sự ra cây hoàn chỉnh của cây lan Hài trên môi trường cơ bản là ½ khoáng MS, vitamin MS có bổ sung các chất khác như nước dừa, NaH2PO4, oligochitosan và NAA. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6 Khả năng tái sinh hoàn chỉnh của cây lan Hài
STT Môi trường Chiều cao
cây, cm
Chiều dài rễ, cm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 ½ khoáng MS +Vitamin MS 2,5+0,2 2,3+0,2
2 ½ khoáng MS + Vitamin MS + nước dừa 20%
2,6+0,1 2,7+0,2
3 ½ khoáng MS + Vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4
3,6+0,2 2,9+0,1
4 ½ khoáng MS + Vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4 +0,1ng/l NAA
3,3+0,1 3,2+0,1
5 ½ khoáng MS + Vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4 +0,1ng/l NAA +
Oligochitosan