Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng 20 primer ngẫu nhiên (tên và trình tự primer được mô tả trong bảng 2.5) có độ dài 10 nucleotide để phân tích mức độ đa hình của các mẫu biến dị so sánh với mẫu đối chứng. Kết quả nhận được là 6/20 primer thể hiện tính đa hình đối với mẫu Vân Hài và đối với Hài Hồng là 7/20 primer, trong đó các primer thể hiện tính đa hình cao nhất là OPD2, OPD5, OPD6, OPD12. Đặc biệt là có một số primer cho kết quả hoàn toàn âm tính, nghĩa là không có một phân đoạn DNA nào được nhân bản, hoặc các phân đoạn DNA được nhân bản giống nhau giữa các dòng biến dị và dòng đối chứng, do đó các primer này không được dùng để phân tích tính đa hình của các mẫu. Kết quả điện di sản phẩm RAPD cũng cho thấy một số mẫu có phân đoạn DNA được nhân bản trong khi mẫu khác thì không ghi nhận được phân đoạn DNA nào được nhân bản khi sử dụng cùng một primer. Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA của các mẫu khi điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi đã thiết lập mối liên quan giữa các giống. Số liệu sau đó được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc Version 2.1 để phân tích và tính toán hệ số tương đồng.
Với 7 primer thể hiện tính đa hình ở giống Hài Hồng, cụ thể là các primer OPD2, OPD3, OPD4, OPD5, OPD6, OPD7, OPD12 thu được tổng cộng 78 phân đoạn, trung bình mỗi mẫu thể hiện 3,7 phân đoạn có độ dài ước tính từ 0,4kb đến 3,0kb. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD của giống lan Hài Hồng.
STT Ký hiệu mẫu OPD2 OPD
3 OPD 4 OPD 5 OPD 6 OPD7 OPD12 1 HĐC 6 8 4 4 7 4 9 2 HI 3-1 9 2 5 2 5 3 6 3 HI 3-2 0 4 5 1 7 1 5
Dựa trên các số liệu thu được ở bảng 3.13 chúng tôi sử dụng phần mềm NTSYS pc. Version 2.1 để phân tích hệ số tương đồng di truyền của các dòng Hài Hồng in vitro biến dị. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.14.
Bảng 3.14 Hệ số tương đồng của các dòng Hài Hồng
HĐC HI 3-1 HI 3-2
HĐC 1,0
HI 3-1 0,11 1,0
HI 3-2 0,52 0,54 1,0
Số liệu thu được cho thấy các dòng Hài Hồng nghiên cứu có hệ số tương đồng di truyền từng cặp nằm trong khoảng từ 0,11 đến 0,54. Kết quả này cho thấy các dòng biến dị đều có sự khác biệt di truyền ở mức độ phân tử so với dòng mẹ và so với nhau. Trong đó, dòng HI 3-1 có mức độ sai khác di truyền so với dòng mẹ lớn hơn dòng HI 3-2 (hình 3.10)
Hình 3.10 So sánh đa hình 3 dòng lan Hài Hồng ở mức độ phân tử
Phân tích kết quả điện di sản phẩm RAPD của các mẫu Vân Hài với primer OPD6 (hình 3.11) cho thấy số band trung bình là 5,6/mẫu, nhiều nhất là 10 band, ít nhất là 1 band, các band nằm trong khoảng từ 0,65kb đến 4kb. Đây là primer cho kết quả đa hình khá phong phú. Sản phẩm điện di cho thấy mẫu số 2 (dòng VI 3-1- 1) là mẫu có số phân đoạn DNA nhiều nhất (10 phân đoạn), mẫu số 3 (dòng VI 3-2- 1) và mẫu số 6 (dòng VI3-2-3) chỉ thể hiện 1 phân đoạn nhưng ở những vị trí khác nhau cho thấy các phân đoạn này không có độ dài tương đồng. Hai mẫu 4 (dòng VI 3-1-2) và mẫu 5 (dòng VI 3-2-2) cũng được ghi nhận có các phân đoạn DNA được nhân bản giống nhau và có cùng độ dài.
Hình 3.11 Kết quảđiện di sản phẩm RAPD với primer OPD5 và OPD6 của 6 dòng Vân Hài (từ trái sang phải - số thứ tự các dòng trong bảng 3.11)
Đối với Vân Hài, các primer thể hiện tính đa hình là OPD2, OPD3, OPD4, OPD5, OPD6, OPD12, thu được tổng số 136 phân đoạn DNA có độ dài ước tính từ 0,65kb đến 4,8kb, trung bình mỗi mẫu thể hiện 3,8 phân đoạn khác nhau. Kết quả được ghi nhận trong bảng 3.15.
Bảng 3.15 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sảm phẩm RAPD của giống Vân Hài
STT Ký hiệu mẫu OPD2 OPD3 OPD4 OPD5 OPD6 OPD12
1 VĐC 4 5 5 7 4 0 2 VI 3-1-1 4 4 0 1 10 8 3 VI 3-2-1 0 0 0 0 1 0 4 VI 3-1-2 5 4 2 10 9 4 5 VI 3-2-2 4 1 0 10 9 8 6 VI 3-2-3 4 1 2 9 1 0
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu số 3 (dòng VI 3-2-1) không thể hiện tính đa hình khi thử với tất các các primer nên không đủ cơ sở dữ liệu để phân tích.
Bảng 3.16 Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng Vân Hài VĐC VI 3-1-1 VI 3-1-2 VI 3-2-2 VI 3-2-3 VĐC 1,0 VI 3-1-1 0,37 1,0 VI 3-1-2 0,69 0,45 1,0 VI 3-2-2 0,64 0,38 0,89 1,0 VI 3-2-3 0,60 0,08 0,62 0,64 1,0
Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các dòng Vân Hài nghiên cứu trong khoảng từ 0,37 đến 0,89 (bảng 3.16). Điều này thể ở các dòng cây thu được sau chiếu xạ đã có sự biến đổi di truyền so với dòng mẹ ban đầu. Trong các dòng Vân Hài biến dị, dòng VI 3-1-1 có sự khác biệt di truyền lớn nhất so với dòng mẹ; hai dòng VI 3-1-2 và dòng VI 3-2-2 có sự tương đồng di truyền khá cao mặc dù hình thái của chúng khác biệt khá rõ (hình 3.12).
Từ kết quả điện di sản phẩm RAPD với 20 primer ngẫu nhiên, trong đó có 6 primer ở Vân Hài và 7 primer ở Hài Hồng thể hiện tính đa hình giữa các mẫu được sử dụng trong phân tích cho thấy các mẫu thể hiện tính đa hình thấp hơn so với các nghiên cứu trên những đối tượng thực vật khác [3],[6],[36]. Điều này có thể được giải thích do nhiều nguyên nhân như nồng độ DNA của một số mẫu thấp (dưới 50ng/ml), độ tinh sạch của mẫu không tốt, primer không phù hợp, thao tác…
Kết quả trên cũng cho thấy sự khác biệt di truyền ở mức độ phân tử giữa các dòng Hài Hồng và Vân Hài biến dị so với dòng mẹ ban đầu, qua đó cho thấy việc xử lý bức xạ bằng ion beam đối với lan Hài đã tạo ra các dòng biến đổi di truyền ổn định qua hai thế hệ nuôi cấy vô tính. Đây là nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống lan Hài trong giai đoạn tiếp theo.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi rút ra được một số kết luận như sau: - Đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống in vitro bao gồm các giai đoạn khử trùng mẫu, nhân protocorm, nhân cụm chồi và tái sinh cây hoàn chỉnh cho hai giống lan Hài là Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Phaphiopedilum callosum). Cụ thể:
+ Ca(OCl)2 nồng độ 10% thích hợp cho mục đích khử trùng mẫu lan Hài. + Môi trường tạo callus từ PLB là môi trường cơ bản có bổ sung 10mg/l 2,4D phối hợp với 0,1mg/l TDZ cho hiệu quả tốt nhất.
+ Môi trường nhân nhanh PLB có bổ sung 0,5mg/l TDZ 0,1 mg/l NAA cho hệ số nhân cao. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Để nhân chồi hiệu quả là môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l TDZ và 0,1mg/l NAA.
+ Môi trường tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh thích hợp nhất là môi trường có chứa ½ khoáng MS, Vitamin MS, NAA 0,1mg/l, nước dừa 20%, NaH2PO4, oligochitosan, agar và than hoạt tính.
- Đã xác định được liều LD50đối với mẫu in vitro của 2 giống lan Hài, cụ thể
như sau:
+ Đối với Hài Hồng, giá trị LD50 của mẫu PLB, chồi và cây sau 4 tháng tương ứng là 20Gy, 23,7Gy và 38Gy.
+ Đối với Vân Hài, giá trị LD50 của mẫu PLB, chồi và cây sau 4 tháng tương
+ Đã xác định được mẫu PLB là thích hợp nhất cho xử lý chiếu xạ và đối với lan Hài, xử lý bằng chùm ion hiệu quả hơn bức xạ gamma cho mục đích tạo dòng biến dị và liều xạ thích hợp khi sử dụng tia ion C6+ là 3Gy.
- Đã phát hiện 12 dòng biến dị ở Vân Hài và 12 dòng biến dị ở Hài Hồng ở
thế hệ M1V1.
- Đã tạo dòng và tiến hành phân tích DNA của 5 dòng biến dị Vân Hài và 2 dòng biến dị Hài Hồng ở thế hệ M1V2 bằng phương pháp RAPD cho thấy các dòng này đều có sự khác biệt di truyền ở cấp độ phân tử so với các dòng đối chứng.