và đời sống. Kỹ thuật này được sử dụng nhằm các mục tiêu chính:
- Khuếch đại số lượng mẫu DNA và RNA: ứng dụng quan trọng nhất của kỹ thuật PCR là nhân bản nhanh chóng một đoạn DNA hoặc RNA mục tiêu trong thời gian ngắn và ít tốn kém hơn so với các phương pháp cổ điển khác. Dựa vào các nguyên lý của kỹ thuật PCR, người ta đã phát triển các kỹ thuật định tính và định lượng DNA và RNA trong nghiên cứu và đời sống như kỹ thuật xác định một đoạn gen gây bệnh di truyền, virus (y học), xác định nhân thân (khoa học hình sự), xác định cha mẹ con, phân loại thực vật, phân tích DNA, xác định đột biến, chọn lọc giống cây trồng…
- Sản xuất mẫu dò: sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò dùng trong các phương pháp lai bằng cách sử dụng các nucleotit có đánh dấu.
- Kỹ thuật in situ PCR: dùng khuếch đại một đoạn RNA hoặc DNA ngay trên lát cắt mô và tế bào được cố định trên lam. Kỹ thuật này giúp phát hiện tế bào, mô có đoạn DNA mục tiêu (tế bào nhiễm virus…).
- Định lượng DNA và RNA bằng PCR: thường được sử dụng để nghiên cứu các trình tự DNA hoặc RNA có số lượng bản sao rất thấp không dùng các phương pháp lai cổ điển để định lượng được. Người ta thường khuếch đại đồng thời một trình tự đích (cần xác định nồng độ) và một trình tự chứng (biết trước nồng độ) trong cùng một ống nghiệm với cùng một cặp mồi. Hai trình tự đích và trình tự chứng này phải có hai đầu nơi bắt cặp mồi giống nhau và phần trung tâm có độ dài khác nhau để có thể phân biệt sản phẩm bằng điện di sau phản ứng PCR. Nếu sản phẩm khuếch đại của trình tự chứng là như nhau trong các phản ứng, số chu kỳ khuếch đại không vừa đủ, thì người ta có thể so sánh hàm lượng sản phẩm của trình tựđích, từđó tính ra được số lượng bản sao mẫu ban đầu [5].
1.4.2.4 Các hạn chế của phương pháp PCR
- Kích thước của trình tự cần khuếch đại: phương pháp PCR thường không hoạt động được với trình tự DNA lớn hơn 3kb. Độ dài đoạn DNA mục tiêu dưới 1.5kb thường cho kết quả tốt nhất với phương pháp này. Với những đoạn DNA mục tiêu lớn hơn, điều kiện tối ưu của phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.
- Sự ngoại nhiễm: đây là vấn đề lớn nhất của phương pháp PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của lần thao tác trước. Vấn đề này đặc biệt quan trọng trong các ứng dụng về chuẩn đoán và dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiêm trọng [5].
1.4.2.5 Kỹ thuật phân tích tính đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNAs – RAPD). ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNAs – RAPD).
William và cộng sự (1990) đã phát hiện hiện tượng đa hình của phân tử DNA dựa trên phản ứng khuếch đại phân đoạn DNA bằng các đoạn mồi có trình tự nucleotid ngẫu nhiên. Kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật phát hiện tính đa hình của DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD). Đây là một trong các kỹ thuật phân tích đánh giá genome thực vật đơn giản, dựa trên các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật PCR.
Sựđa hình các sản phẩm của RAPD là kết quả của sự thay đổi các điểm gắn của mồi (ví dụ do đột biến điểm) hoặc do thay đổi nhiễm sắc thể trong các vùng được nhân bản (ví dụ thêm đoạn, đảo đoạn hoặc mất đoạn) sẽ gây ra sự thay đổi về kích thước hay ngăn cản sự nhân bản của DNA khuôn. Do đó, các đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus.
Các đoạn mồi được tổng hợp thường chỉ dài 10 nucleotide theo một trình tự nhất định. Đoạn mồi được tiếp hợp với khuôn DNA ở nhiệt độ không cao (340C-400C) cho nên sẽ có nhiều đoạn DNA khác nhau được nhân bản.
Hình 1.4 Sơđồ nguyên lý kỹ thuật RAPD [33].
Các bước cơ bản của kỹ thuật RAPD:
- Tách chiết và tinh sạch DNA.
- Tiến hành PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên.
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, xác định mức độ đa hình giữa các mẫu.
- Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập dendrogram để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học các mẫu nghiên cứu.
Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là thực hiện nhanh, dễ thao tác, ít tốn kém, thường được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài
hay giữa các cá thểđể phục vụ cho công tác chọn giống hoặc phân loại. Chúng cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng, như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông hoặc tính trạng kháng virus ở cây cà chua [4],[6],[15].
Đối với thực vật, các primer RAPD thường thể hiện 5-15 band của những đoạn DNA dài từ 200 đến 400 bp. Do đó mức độ khuếch đại của nó khá tốt và dễ nhận biết bằng điện di nhưng tần suất đa hình khá hạn chế. Ngoài ra, những gen điều khiển tính trạng có tính lặn (recessive) khó tìm thấy sự đa hình trong điện di, kỹ thuật RAPD lại có tính chất ngẫu nhiên, nên việc lập lại phân tích điện di để tìm liên kết gen và marker thường cho kết quả không thống nhất [4]. Đây là những khuyết điểm chính khi sử dụng kỹ thuật RAPD trong phân tích di truyền thực vật.
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 VẬT LIỆU
- Hạt và đỉnh sinh trưởng của lan Hài được thụ phấn và thu nhận ở vườn ươm của các cơ sở trồng hoa ở Đà Lạt.
- Mô lan Hài Hồng và Vân Hài được nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau: callus, PLB, chồi và cây.
- Hóa chất và môi trường dùng trong nghiên cứu nhân nhanh của hãng Wako, Takara (Nhật), Sigma (Mỹ), Biolabs (New England).
- Tách chiết DNA bằng bộ kit Dneasy Plant Mini Kit của hãng QIAGEN. - Các hóa chất dùng trong phản ứng RAPD được cung cấp bởi hãng Takara (Nhật), Biolabs (New England), các primer do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp. Ladder của hãng Invitrogen (CA).
- Máy PCR và máy đo quang phổ hấp phụ của hãng Eppendorf (Đức).
- Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu: Phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh.
- Chiếu xạ tia gamma 60Co tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt, chiếu xạ chùm tia ion bằng máy gia tốc ion (Synchrotron) tại Viện Nghiên cứu Hóa bức xạ Tiên tiến Takasaki, Nhật Bản.
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu
Khử trùng mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy có vai trò rất quan trọng trong quy trình nuôi cấy mô thực vật. Mẫu được khử trùng tốt sẽ cho tỉ lệ tái sinh cao, mức độ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thấp. Đây là các yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy.
Trong nuôi cấy mô thực vật, chất khử trùng thường được dùng là NaOCl, H2O2, HgCl2, Ca(OCl)2… Dung dịch Ca(OCl)2 10% trong thời gian từ 10 – 20 phút được cho là phù hợp cho mục đích khử trùng mô thực vật trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy vì tác dụng khử trùng tốt và ít gây độc đối với mẫu [2].
Mẫu gồm các đỉnh sinh trưởng, cành phát hoa và quảđược tách từ cây trong vườn ươm, cắt bỏ phần thừa, sau đó được rửa sạch bằng nước máy, ngâm rửa 30 phút trong xà phòng, rửa lại bằng nước cất 3 lần trước khi rửa nhẹ trong cồn 70o hai lần và sau cùng mẫu được khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 10% với các khoảng thời gian khác nhau để khảo sát thời gian thích hợp nhất cho mục đích khử trùng mẫu.
- Đối với đỉnh sinh trưởng và cành phát hoa Hài thì thời gian khử trùng được thực hiện trong thời gian là 10, 15, 20, 25 phút.
- Đối với quả lan Hài, thời gian khử trùng được thực hiện trong thời gian là 20 và 25 phút.
- Sau khi khử trùng, mẫu được rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu trên môi trường MS và theo dõi sau 4 -6 tuần nuôi cấy.
2.2.2 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài
- Sử dụng hạt và đỉnh sinh trưởng của lan Hài để tạo mẫu in vitro ban đầu. - Tiến hành nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung chất dinh dưỡng và các chất điều hoà sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau để xác định nồng độ tối ưu. Việc nuôi cấy được tiến hành trên các giai đoạn: callus, PLB, chồi và cây nhằm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau của mẫu.
- Các PLB được sử dụng để khảo sát khả năng hình thành callus. Để khảo sát khả năng nhân nhanh PLB và khả năng nhân chồi, mẫu cấy là các PLB được hình thành từ các cụm PLB. Khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh được khảo sát từ các chồi được hình thành từ các cụm chồi. Môi trường nuôi cấy bao gồm 1/2 khoáng MS, vitamin MS có bổ sung nước dừa, oligochitosan và các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) (2,4D, BA, TDZ và NAA) được hấp vô trùng bằng nồi hấp autoclave ở 121oC trong 15 phút. Các mẫu cấy được nuôi ở 25 ± 1oC, cường độ chiếu sáng 2000lux và thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày.
2.2.2.1 Khảo sát môi trường hình thành callus của lan Hài
Tạo callus là một công đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro. Callus tạo thành là nguồn nguyên liệu cho bước nghiên cứu tạo đột biến tiếp theo. Trong môi trường tạo callus, 2,4D là chất thường được sử dụng cho tất cả các loại cây. Nhiều tài liệu cho thấy hiệu quả tạo callus của 2,4D sẽ cao hơn nếu sử dụng phối hợp với NAA hoặc TDZ, mà sự phối hợp giữa 2,4D và TDZ thường cho hiệu quả cao hơn [9],[38]. Vì thế, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu ứng tạo callus của mô lan Hài sử dụng chất điều hòa sinh trưởng là 2,4D phối
hợp với TDZ. Mẫu cấy là các protocorm đã đạt kích thước 2-3mm, chọn những protocorm phát triển trong điều kiện nuôi cấy tối, chưa lên chồi và tương đối đồng đều. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS bổ sung thêm đường, agar, than hoạt tính, nước dừa, pepton… Tiến hành thử nghiệm trên 13 nghiệm thức theo bảng 2.1, mỗi nghiệm thức cấy từ 6-9 mẫu, nuôi cấy trong điều kiện tối trong phòng nuôi cây. Theo dõi 10-12 tuần và ghi nhận các số liệu.
Bảng 2.1 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo callus.
STT Nồng độ ĐHST, mg/l STT Nồng độĐHST, mg/l 2,4D TDZ 2,4D TDZ 1 0 0 8 5,0 0,1 2 0 0,1 9 5,0 0,5 3 0 0,5 10 5,0 1,0 4 0 1,0 11 10,0 0,1 5 1,0 0,1 12 10,0 0,5 6 1,0 0,5 13 10,0 1,0 7 1,0 1,0
2.2.2.2 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB
Protocorm like body (PLB) của lan là một cấu trúc có khả năng tạo cơ quan. Các tế bào protocorm có chức năng gần giống chức năng của tế bào tạo phôi do đó từ protocorm có thể thực hiện quá trình nhân nhanh bằng cách cắt nhỏ chúng và nuôi cấy trên môi trường phù hợp [18]. Để nhân nhanh PLB, người ta thường sử dụng phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng như BA và NAA theo tỉ lệ khác nhau tùy loài [9],[27],[31]. Dựa trên kết quả trước đây về nhân giống lan Hài in vitro của Lê Quang Luân (2007) [8],[9], trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng BA 2,0mg/l phối hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau để tìm ra nghiệm thức phù hợp nhất cho mục đích nhân nhanh PLB của lan Hài. Các nghiệm thức khảo sát được liệt kê trong bảng 2.2. Mẫu cấy là các PLB đạt kích thước từ 2-3mm, mỗi nghiệm thức cấy 9 mẫu, nuôi cấy trong điều kiện sáng ở phòng nuôi cây. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung nước dừa, than hoạt tính, agar, đường… Theo dõi 10-12 tuần và tiến hành ghi nhận tổng số PLB hình thành trên mỗi nghiệm thức, căn cứ vào số PLB ban đầu để tính ra hệ số nhân của nghiệm thức đó.
Bảng 2.2 Nghiệm thức ảnh hưởng các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB. Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, mg/l STT Môi trường cơ bản BA NAA 1 0 2 0,1 3 0,2 4 0,3 5 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa 2,0 0,5 6 0 7 0,1 8 0,2 9 0,3 10 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 2,0 0,5 11 0 12 0,1 13 0,2 14 0,3 15 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 + 50mg/l oligochitosan 2,0 0,5
2.2.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi
Nhân nhanh chồi là giai đoạn cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây trong thời gian ngắn trong nuôi cấy in vitro. Hiệu quả của giai đoạn nhân nhanh chồi được thể hiện qua hệ số nhân chồi. Hệ số nhân chồi càng cao thì thời gian nhân giống càng ngắn, giá thành sản phẩm hạ cho hiệu quả kinh tế cao, do đó nó có ý nghĩa rất lớn trong nhân giống in vitro. Đối với Hài Hồng và Vân Hài là những loài thực vật đặc hữu đang có nguy cơ tuyệt chủng thì tìm ra môi trường có hệ số nhân cao bên cạnh mục tiêu về kinh tế còn có ý nghĩa đối với công tác bảo tồn giống.
Mục đích của thí nghiệm này là xác định môi trường thích hợp cho hệ số nhân chồi cao nhất. Môi trường sử dụng là môi trường MS, bổ sung đường, agar, than hoạt tính, nước dừa…, các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được phối hợp với nhau với các nồng độ khác nhau cho từng nghiệm thức. Mẫu cấy là các PBL đạt kích thước 2-3mm, mỗi nghiệm thức cấy 6 mẫu theo bảng 2.3. Theo dõi sau 10-12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận tổng số chồi trên mỗi nghiệm thức, căn cứ vào số mẫu cấy ban đầu để tính ra hệ số nhân chồi cho mỗi nghiệm thức.
Bảng 2.3 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi. Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, mg/l STT Môi trường cơ bản BA TDZ NAA 1 0 2 1,0 3 2,0 4 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 3,0 0 0 5 0 6 0,5 7 1,0 8 1/2 khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 0 1,5 0 9 0 10 0,1 11 0,5 12 1/2 khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 0 0 1,0 13 0 14 0,1 15 0,2 16 ½ khoáng MS + Vitamin MS + 20% nước dừa + 170mg/l NaH2PO4 0 0,5 0,3
2.2.2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro
Thực chất của giai đoạn tái sinh cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro là quá trình tạo rễ của cây in vitro. Đây là công đoạn cuối cùng trong quy trình nhân nhanh, tuy được coi là đơn giản nhất nhưng cũng là công đoạn hết sức quan trọng. Cây in vitro ra được rễ, số rễ nhiều, rễ phát triển tốt thì sẽ tạo thuận lợi cho quá trình phát triển của cây khi ra vườn ươm. Để nghiên cứu môi trường phù hợp cho tiến trình tạo rễin vitro, chúng tôi thử nghiệm trên hai loại môi trường là MS có bổ sung thêm một số thành phần: đường 20g/l, agar 12g/l, than hoạt tính 1g/l.
Mẫu cấy là các chồi chưa ra rễđược tách từ cây mẹ, chồi đã đạt được chiều cao 4-5mm. Mỗi nghiệm thức cấy 9 mẫu, nuôi cấy ở điều kiện sáng trong phòng nuôi cây. Theo dõi sau 10 – 12 tuần và tiến hành ghi nhận các số liệu.
Bảng 2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro
STT Môi trường
1 ½ khoáng MS + Vitamin MS
2 ½ khoáng MS + Vitamin MS + nước dừa 20% 3 ½ khoáng MS + Vitamin MS + nước dừa 20% + NaH2PO4
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});