Các cây có biểu biện đặc tính biến dị sau khi đã được chọn lọc ổn định qua 2 thế hệ trong nuôi cấy in vitro được sử dụng để tiến hành kiểm tra vật liệu di truyền.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành kiểm tra DNA mẫu cây có biến dị và mẫu đối chứng bằng phương pháp Random Amplified Polymorphic DNA Analysis (RAPD). Mẫu sử dụng để kiểm tra là mẫu lá của cây có đặc điểm biến dị được chọn lọc ở phần trước và cây đối chứng.
Quy trình thao tác:
Tách chiết DNA từ mẫu lá:
- Thu 0,1g mẫu lá của cây tái sinh hoàn chỉnh in vitro, cắt nhỏ, nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Chuyển nhanh vào ống eppendorf. Mỗi mẫu thực hiện 2 ống eppendorf.
- Thực hiện quy trình tách chiết DNA thực vật của hãng QIAGEN với một số thay đổi về thời gian ủ mẫu trong nước nóng và đá lạnh.
Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA:
- Đo OD bằng máy quang phổ hấp thụ Biophotometer của hãng Eppendorf (Đức).
Vùng đo ở bước sóng 260nm – 280nm, sử dụng dụng dịch đệm AE của bộ kit để làm chuẩn.
Đo mẫu gồm 90ml dung dịch đệm và 10ml DNA mẫu (hệ số pha loãng 10 lần). - Tính toán hàm lượng và độ tinh sạch của DNA:
Hàm lượng DNA (ng/µl): OD260x hệ số pha loãng.
Độ sạch DNA: OD260/OD280.
- Điện di để kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8% trong điện trường có cường độ 0,3mA, hiệu điện thế 80V.
Tiến hành phân tích theo phương pháp RAPD với 20 mồi:
- Mỗi eppendorf gồm: 2,5µl dung dịch đệm PCR; 2,5 µl dNTPs; 0,25 µl Taq polymerase (0,2 µl/u); 0,6 µl primer; 50ng DNA khuôn; nước cất vừa đủ 25µl; trộn đều hỗn hợp (hóa chất được đặt trong môi trường đá để không bị mất hoạt tính).
- Tiến hành phản ứng PCR gồm 3 bước: Bước 1: T= 940C, 3 phút.
Bước 2 gồm 40 chu kỳ: T=940C, 1 phút; T= 370C, 1,5 phút; T=720C, 2,5 phút.
Bước 3: T=720C, 5 phút; sau đó lưu giữở 40C.
- Tên và trình tự các đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng để phân tích được liệt kê trong bảng 2.5.
Bảng 2.5 Tên và trình tự các đoạn mồi
STT Tên mồi Trình tự STT Tên mồi Trình tự
1 OPD1 3’ACCGCGAAGG5’ 11 OPD11 3’AGCGCCATTG5’
2 OPD2 3’GGACCCAACC5’ 12 OPD12 3’CACCGTATCC5’
3 OPD3 3’GTCGCCGTCA5’ 13 OPD13 3’GGGGTGACGA5’
4 OPD4 3’TCTGGTGAGG5’ 14 OPD14 3’CTTCCCCAAG5’
5 OPD5 3’TGAGCGGACA5’ 15 OPD15 3’CATCCGTGCT5’
6 OPD6 3’ACCTGAACGG5’ 16 OPD16 3’AGGGCGTAAG5’
7 OPD7 3’TTGGCACGGG5’ 17 OPD17 3’TTTCCCACGG5’
8 OPD8 3’GTGTGCCCCA5’ 18 OPD18 3’GAGAGCCAAC5’
9 OPD9 3’CTCTGGAGAC5’ 19 OPD19 3’CTGGGGACTT5’
Điện di sản phẩm RAPD: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Gel agarose 1,5% (25% agarose tinh, 75% agarose thường), dung môi là TBE 0,5X.
- Nhuộm gel bằng Ethidiumbromide 0,5 µg/ml (4,5µl trong 200µl TBE 0,5X).
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.
- Sản phẩm từ quy trình RAPD được phân tích thông qua kết quảđiện di. Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các band có độ dài ước tính tương ứng trên kết quảđiện di giữa các mẫu khác nhau của cùng một mồi ngẫu nhiên để xác định có hay không có sự sai khác giữa genome của các dòng biến dị so với mẫu đối chứng.