ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNAs – RAPD).
William và cộng sự (1990) đã phát hiện hiện tượng đa hình của phân tử DNA dựa trên phản ứng khuếch đại phân đoạn DNA bằng các đoạn mồi có trình tự nucleotid ngẫu nhiên. Kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật phát hiện tính đa hình của DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD). Đây là một trong các kỹ thuật phân tích đánh giá genome thực vật đơn giản, dựa trên các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật PCR.
Sựđa hình các sản phẩm của RAPD là kết quả của sự thay đổi các điểm gắn của mồi (ví dụ do đột biến điểm) hoặc do thay đổi nhiễm sắc thể trong các vùng được nhân bản (ví dụ thêm đoạn, đảo đoạn hoặc mất đoạn) sẽ gây ra sự thay đổi về kích thước hay ngăn cản sự nhân bản của DNA khuôn. Do đó, các đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus.
Các đoạn mồi được tổng hợp thường chỉ dài 10 nucleotide theo một trình tự nhất định. Đoạn mồi được tiếp hợp với khuôn DNA ở nhiệt độ không cao (340C-400C) cho nên sẽ có nhiều đoạn DNA khác nhau được nhân bản.
Hình 1.4 Sơđồ nguyên lý kỹ thuật RAPD [33].
Các bước cơ bản của kỹ thuật RAPD:
- Tách chiết và tinh sạch DNA.
- Tiến hành PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên.
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, xác định mức độ đa hình giữa các mẫu.
- Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập dendrogram để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học các mẫu nghiên cứu.
Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là thực hiện nhanh, dễ thao tác, ít tốn kém, thường được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài
hay giữa các cá thểđể phục vụ cho công tác chọn giống hoặc phân loại. Chúng cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng, như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông hoặc tính trạng kháng virus ở cây cà chua [4],[6],[15].
Đối với thực vật, các primer RAPD thường thể hiện 5-15 band của những đoạn DNA dài từ 200 đến 400 bp. Do đó mức độ khuếch đại của nó khá tốt và dễ nhận biết bằng điện di nhưng tần suất đa hình khá hạn chế. Ngoài ra, những gen điều khiển tính trạng có tính lặn (recessive) khó tìm thấy sự đa hình trong điện di, kỹ thuật RAPD lại có tính chất ngẫu nhiên, nên việc lập lại phân tích điện di để tìm liên kết gen và marker thường cho kết quả không thống nhất [4]. Đây là những khuyết điểm chính khi sử dụng kỹ thuật RAPD trong phân tích di truyền thực vật.
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 VẬT LIỆU
- Hạt và đỉnh sinh trưởng của lan Hài được thụ phấn và thu nhận ở vườn ươm của các cơ sở trồng hoa ở Đà Lạt.
- Mô lan Hài Hồng và Vân Hài được nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau: callus, PLB, chồi và cây.
- Hóa chất và môi trường dùng trong nghiên cứu nhân nhanh của hãng Wako, Takara (Nhật), Sigma (Mỹ), Biolabs (New England).
- Tách chiết DNA bằng bộ kit Dneasy Plant Mini Kit của hãng QIAGEN. - Các hóa chất dùng trong phản ứng RAPD được cung cấp bởi hãng Takara (Nhật), Biolabs (New England), các primer do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp. Ladder của hãng Invitrogen (CA).
- Máy PCR và máy đo quang phổ hấp phụ của hãng Eppendorf (Đức).
- Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu: Phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh.
- Chiếu xạ tia gamma 60Co tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt, chiếu xạ chùm tia ion bằng máy gia tốc ion (Synchrotron) tại Viện Nghiên cứu Hóa bức xạ Tiên tiến Takasaki, Nhật Bản.
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu
Khử trùng mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy có vai trò rất quan trọng trong quy trình nuôi cấy mô thực vật. Mẫu được khử trùng tốt sẽ cho tỉ lệ tái sinh cao, mức độ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thấp. Đây là các yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy.
Trong nuôi cấy mô thực vật, chất khử trùng thường được dùng là NaOCl, H2O2, HgCl2, Ca(OCl)2… Dung dịch Ca(OCl)2 10% trong thời gian từ 10 – 20 phút được cho là phù hợp cho mục đích khử trùng mô thực vật trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy vì tác dụng khử trùng tốt và ít gây độc đối với mẫu [2].
Mẫu gồm các đỉnh sinh trưởng, cành phát hoa và quảđược tách từ cây trong vườn ươm, cắt bỏ phần thừa, sau đó được rửa sạch bằng nước máy, ngâm rửa 30 phút trong xà phòng, rửa lại bằng nước cất 3 lần trước khi rửa nhẹ trong cồn 70o hai lần và sau cùng mẫu được khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 10% với các khoảng thời gian khác nhau để khảo sát thời gian thích hợp nhất cho mục đích khử trùng mẫu.
- Đối với đỉnh sinh trưởng và cành phát hoa Hài thì thời gian khử trùng được thực hiện trong thời gian là 10, 15, 20, 25 phút.
- Đối với quả lan Hài, thời gian khử trùng được thực hiện trong thời gian là 20 và 25 phút.
- Sau khi khử trùng, mẫu được rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu trên môi trường MS và theo dõi sau 4 -6 tuần nuôi cấy.