Nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic đa loài bằng phương pháp đông khô

Tiêu đề: Nghiên cứu tạo chế phẩm Probiotic đa loài bằng phương pháp đông khô Tác giả: Phan Thị Phượng Từ khóa Chủ đề: bào chế Mô tả: Tóm tắt: Đánh giá sự ảnh hưởng của thời gian tiền đông đến độ ổn định của chế phẩm. Đánh giá sự ảnh hưởng của tá dược đến độ ổn định của chế phẩm. Đánh giá sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ ổn định của chế phẩm Nhà xuất bản: ĐHDHN Ngày tháng: 2009 Loại hình, kiểu: Khóa luận Mô tả vật lý: 45 Tr Ngôn ngữ: Vie Nơi chứa: Thư viện Đại học Dược . Giá: Miễn phí Bình chọn: 1 2 3 4 5 Ngày tạo: 01042013 Điểm bình chọn: 0 Chuyên đề: Công nghiệp dược bào chế

Trang 1

BO Y TE TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI * * * PHAN THỊ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHE PHAM

PROBIOTIC DA LOAI BANG PHUONG PHAP DONG KHO

(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SY KHOA 2004 - 2009)

Người hướng dẫn : ThS Lê Xuân Hoành

Nơi thực hiện : Bộ môn Công Nghiệp Dược

Thời gian thực hiện : Từ 10/2008 đến 05/2009

Gry 2143 VÀ “\

vw -\ \- `

of | (É) 4F:

Trang 2

LOI CAM ON

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới thây giáo, thạc sĩ Lê Xuân Hoành, người thây đã luôn trực tiếp

động viên, hướng dân tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Từ Minh Koóng TS Dam Thanh Xuan

những người đã đóng góp nhiễu ý kiến quỷ báu giúp tơi hồn thành khóa luận

nay

Đông thời, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thây cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Cóng Nghiệp Được

Xin cam ơn gia đình và bạn bè đã luôn ting hộ, tao điều kiện cho tÔi trong

Trang 3

MUC LUC

Trang

DANH MUC CAC BANG

DANH MUC CAC HINH

CAC CHU VIET TAT

DAT VAN DE |

PHAN I TONG QUAN 2

1.1 Đại cương ve Probiotic 2

1.1.1 Khai niém vé Probiotic 2 1.1.2 Các vi khuẩn dùng làm probiotic và ưu điểm của sự phối hợp đa 5

loài probiotic

1.1.3 Cơ chế tác động của probiotic 5

1.1.4 Tac dung va tmg dung cua Probiotic 5

1.1.5 Van dé an toan khi str dung ché pham Probiotic 7 1.2 Phương pháp đông khô và sản xuất chế phẩm sinh hoc bang

phương pháp đông khô i

1.2.1 Phương pháp đông khô 7

1.2.2 San xuat ché pham sinh hoc bang phương pháp đông khô § 1.3 Một số nghiên cứu gần đây về probiotic 12

PHAN II NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Thiết bị 14

2.1.3 Một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14

Trang 4

2.2.1 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 2.2.2 Phương pháp tạo địch tế bảo (nhân giống)

2.2.3 Phương pháp pha loãng tính số lượng tế bào

2.2.4 Phương pháp đông khô chế tạo chê phẩm probiotic

2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền đông tới độ ôn định của chế phẩm đông khô

2.2.6 Phương pháp đánh giá tỷ lệ sống sót của VSV probiotic trước và ngay sau đông khô

2.2.7 Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của môi trường độn tới độ

ôn định của chế phẩm đông khô

2.2.8 Phuong pháp đánh giá sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản tới

độ ôn định của chế phẩm đông khô

PHAN ILI KET QUA VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền đông tới độ ốn định của chế phẩm đông khô 3.2 Đánh giá tỷ lệ song sót của VSV probiotic trước và ngay sau đồng khô 3.3 Đánh øiá sự ảnh hưởng của môi trường độn tới độ ôn định của chế phẩm đông khô

3.4 Đánh giá sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản tới độ on định

của chế phẩm đông khô BÀN LUẬN

Trang 5

DANH MUC CAC BANG

SIT Tén bang Trang 1.1 | Một số tá dược sử dụng trong đông khô 10

1.2 | Cac thé hé bao ché probiotic 12

- Số lượng vi khuẩn trước và sau đông khô với thời gian tiền đông 6

khac nhau

4 Số lượng vi khuẩn trước và sau đông khô với các môi trường độn -

— | khác nhau

=i Số lượng vi khuẩn trong 0,10 g ché pham đông khô với các môi -

| trường độn ở điều kiện 5°C

MET: số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với các tá ¬

được tại hai lần định lượng liên tiếp

đế Số lượng vi khuẩn trong 0.10 g chế phẩm đông khô với các môi 0

| trường độn ở điều kiện 37C

" Số lượng vi khuẩn trong 0.10 ø chế phẩm đông khô với các môi -

trường độn ở điều kiện nhiệt độ phòng tránh ánh sáng

T Số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với sữa gầy 10% theo các điêu kiện nhiệt độ số

Trang 6

DANH MUC CAC HINH STT Tén hinh Trang T Ảnh dưới kính hiển vi điện tử của một số chủng vi khuan LAB 5 — | điển hình

1.2 | Giản đồ pha của nước 7

1.3 | Hình ảnh và cấu tạo máy đồng khô 11

Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ vi khuẩn sông sau đông khô trong các mẫu sỹ

— |PI, P2, P3, P4 theo thời gian

T Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn trên dia petri cla mau probiotic dong 3

~ | khé véi sita gay 10%

sã Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 g chế phẩm đông khô với tá sở

_ | dược sữa gầy tại hai lần định lượng liên tiếp

hai Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với tá =

dược maltodextrin tại hai lần định lượng liên tiếp

TY Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 g chế phẩm đông khô với tá -

| được lactose tai hai lan định lượng liên tiếp

- Tý lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 g chế phẩm đông khô với các ”

tá dược tại hai lần định lượng liên tiếp

trọ với tá dược sữa gây 10% ở các điêu kiện bảo quản Sự biến thiên số lượng vi khuẩn trong 0,1 ø chế phẩm đông khô sẽ

Trang 7

CAC CHU VIET TAT

FAO (Food and Agriculture Organization)

LAB (Lactic acid bacteria)

Trang 8

DAT VAN DE

Trong co thé người, hệ tiêu hóa được biết đến là nơi chứa đựng một lượng vi

sinh vật không lồ nhất Ngoài việc tham gia vào quá trình hấp thu và chuyên hóa

của cơ thê chúng còn tạo nên hệ sinh thái ôn định giúp cân băng vi sinh vật, ức chê

—_

sự phát triển của vi sinh vật có hại ‘a

Theo định nghĩa của FAO/WHO (2002), probiotic là những VSV “có loi”

khi được bổ sung đây đủ sẽ giúp duy trì sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruội

Probiotic có nhiều ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm, nuôi trồng thủy hải

sản Trong dược phẩm ứng dụng quan trọng nhất của các chế phẩm này là điều trị

các bệnh đường tiêu hóa (tiêu chảy do dùng kháng sinh, ung thư ruột kết ) Chế

phẩm probiotie có thể thiết kế ở đạng đơn loài hay đa loài, song nhiều nghiên cứu

cho thấy dạng phối hợp đa loài có tác dụng điều trị tốt hơn

Hiện nay đông khô là phương pháp rất tốt đễ bào chế các thuốc có dược chất kém bên với nhiệt, dé bị thủy phân hoặc các chất mang bản chất sinh học Các VSV sau đông khô có khả năng sông sót cao trong quá trình bảo quản, đặc biệt là vi khuẩn Gram đương ví dụ như Lactobacillus va Bifidobacterium [17]

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các chế phẩm probiotic ngày càng được

quan tâm và sử dụng nhiều hơn do hiệu quả điều trị và độ an toàn của nó Xuất phát

từ những lí do trên chúng tôi tiễn hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm Probiotie đa loài bằng phương pháp đông khô” với các mục tiêu sau:

"_ Đánh giá sự ảnh hưởng của thời gian tiên dong đến độ ổn định của chế phẩm

" Đánh giá sự ảnh hưởng của tá dược đến độ ôn định của ché phẩm

Trang 9

PHAN I TONG QUAN

1.1 Dai cuong vé Probiotic

1.1.1 Khai niém vé Probiotic

Thuật ngir Probiotic xuất phát tir tiémg Hy Lap nghia la “for life” Ra đời dau

tién vao nam 1965 (Lilly va Stillwell), cho tới nay probiotic cé rất nhiều định nghĩa

Song có thể thấy rang probiotic chinh la nhiing VSV “cé lợi” trong hệ tiêu hóa bình

thường Sự cạnh tranh về eơ chất, thức ăn, vị trí bám giúp các VSV có lợi kiềm

chế được sự phát triển của các V§V “có hại”, tạo nên một thê cân bằng nhất định

Probiotie hạn chế ngăn chặn sự xâm nhập và phát triển của những VSV gây bệnh

qua đường tiêu hóa [1 5], [16] [22] [25]

Mặc dù tên gọi mới xuất hiện trong những thập niên gần đây, nhưng thực tế

con người đã sử dụng vi khuẩn probiotic từ rất lâu đời Đó chính là việc sử dụng các thực phẩm /ên men chứa các vi khuẩn có lợi như: dưa muối, bơ, pho mát, sữa

chua Nhà bác học Nga Metchnikoff đã nhận thấy rằng những người nông dân Bulgari luôn sông khỏe mạnh vì thường xuyên sử dụng sữa chua lên men chứa vi

khuan lactic Ong cho rang cdc vi khuan lactic cé kha nang sinh acid lam giảm pH

đường tiêu hóa, kìm hãm sự phát triển của VSV phân hủy sinh chất độc như phenol,

indol, amoni giúp cơ thể khỏe mạnh hơn [10], [16] [21]

Nam 1974, Parke nhan định: “Probiotic là những VSV gồm vi khuân hay

nắm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật

đường ruột cua sinh vat chu” [7], [21]

Nam 1992, Havenaar va Huis da mở rộng định nghia vé probiotic: “Probiotic là những dạng đơn độc hoặc kết hợp của các vi sinh vật song ma khi dua vao co thé động vật hay người thì sẽ có hiệu quả tăng cường tác dụng có lợi của hệ vi khuẩn

đường ruột” [10] [21]

Năm 2002, FAO/WHO đưa ra định nghĩa được coi là hoàn chỉnh tới hiện tại: “Probiotie là những VSV sống mà khi được bồ sung đây đủ sẽ giúp duy trì sự cân

băng của hệ vi khuẩn đường ruột” [8] [10] [21]

Trang 10

những tác dụng tiềm ân của probiotic để ửng dụng thêm vào điều trị

Ngoài ra, probiotic còn được biết đến dưới một số tên khác như: Probiont, Beneficil bacteria, Probiotic bacteria [7], [8]

1.1.2 Các vi khuan ding lam Probiotic va ưu điểm của sự phối hợp đa loài

probiotic

Hệ tiêu hóa người bình thường chứa khoảng 400 loài vi khuẩn khác nhau

Các vi khuẩn có lợi kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn có hại giúp củng cô

chức năng hệ tiêu hóa Chiếm đa phân trong số các loài probiotie là nhóm vi khuẩn

lactic (Lactie acid bacteria: LAB) Trong đó, hai chỉ được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp là Lactobacillus va Bifidobacterium, dién hinh nhat la Lactobacillus

acidophillus co nhiéu trong sita chua [5], [7], [10], [22]

Các VSV probiotie được lựa chọn dùng cho người rất phong phú, có thê là LAB, Enterococcus, Saccharomyces, hoặc dạng phơi hợp đa lồi Một sô VSV

thường được sử dụng trong chế phẩm probiotie như: [5] [6] [7] [20]

e B£ bifidum, B.breve, B.infantis, B.longui

e L, acidophilus, L.bulgaricus, L.plantatum, L.rhamnosus, L.caséi e § thermophilus, Sfaecalis, S.cremoris

L.acidophilus S faecalis B bifidum

Hình 1.1 Anh đưới kính hiến vi điện tử của một số chủng vi khuẩn LAB điển

hình

Vi khuẩn sinh acid lactic nằm chủ yếu trong các chỉ Lacfobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc Nhin chung tat ca các vi khuẩn lactic

Trang 11

la Gram dương chúng không có khả năng di động và hầu hết không tạo bào tử Với

hình dạng và kích thước tương đối đa dạng như: hình cầu, hình que, có thể là tế bảo đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi Chúng có nhu cầu về đinh dưỡng phức tạp ưa acid,

pH tối thích từ 3,5 - 5 Lacfobacills được tìm thấy trong các môi trường sống chứa

nhiều carbonhydrate ví dụ như lớp chất nhây của người và động vật chất thải và

thực phẩm lén men Bifidobacteria là những vì khuẩn có đặc điểm tương tự LAB nhưng có dạng hình que phong phú phần lớn kị khí bắt buộc Cùng với LAB,

Bjìdobacteriuim là thành phần chính của VSV đường ruột, những vi khuẩn thân thiện này đóng vai trò quan trọng trong viỆc đây mạnh sự kháng lại VSV ngoại

sinh, nhất là những vi khuẩn mang bệnh [5] [6] [7] [20]

Các VSV dùng làm probiotie để thực sự có hiệu quả cao trong điêu trị phải

tuân thủ các yêu cầu, đặc tính khắt khe sau: [6]

° Chủng VSV có nguồn gốc từ con người

° Có khả năng bám dính vào đường tiêu hóa của niêm mạc ruột và ngăn

không cho vi khuẩn gây bệnh bám

® Chống chịu được tác động của dịch dạ dày và acid mật để đến ruột Tại ruột,

probiotic phải phóng thích tốt và sản sinh nhanh chóng đề phát huy tối đa tác dụng

° Có khả năng thật sự kháng được vi khuẩn gây bệnh

° Được công nhận có tác động tích cực trong chữa trị và an toàn khi sử dụng

Uu diém của sự phối lợp đa loài

Việc phối hợp nhiều loài probiotie với nhau nhăm: [21] [22]

e _ Tăng khả năng bám dính và sống sót của VSV trong đường tiêu hóa

Vì probiotic thường được dùng đường uống nên chịu nhiều tác động của hệ tiêu

hóa Trước tiên, chúng cần dính lại trên biểu mô ruột, sau đó cần phải chịu được sự

tác dụng của acid, muối mật để sống Hơn nữa do thường được uống cùng kháng sinh nên probiotic cũng phải chịu được kháng sinh Mỗi loài có khả năng chống

chịu nhất định nên khi phối hợp nhiều loài với nhau thì khả năng sông được trong

Trang 12

Probiotie có nhiều tác dụng, song mới chứng mỉnh được với một số loài nhất định

Mỗi nhóm VSV đều có có ưu điểm riêng và đều có ảnh hưởng đến môi trường VSV ở ruột nên sự phối hợp đa loài giúp chúng bổ sung tác dụng cho nhau hoặc tăng cường hoặc hiệp lực do đó chế phâm phối hợp đa loài có chất lượng điều trị tốt hơn

1.1.3 Co ché tac dng cia probiotic

“San sinh các chất ức chế

Lactobacillus sp san sinh bacteriocin tte ché vi khuan Gram duong, cac

probiotic & bién sinh enzym phn giai chong lai vi khuan Vibrio parahaemolyticus

Cạnh tranh các chất thiết yêu

Đó là cạnh tranh về chất dinh dưỡng và nang lugng, vi du probiotic sinh

S$iđerophore hòa tan sắt làm vi khuẩn thiểu sắt cần cho sự tăng trưởng [3] [7|] [10]

“ Cạnh tranh vị trí bám

Nhờ chất bám dính (adhesin) hoặc nhờ các receptor trên bẻ mặt probiotic

có khả năng ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn có hại Ví dụ Car»obacferiun K]

ngdn can duge su lan rong cia V.anguillarum ở cá [3] [7] [10] “ Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Kháng nguyên của probiotic kích thích niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại các tác nhân gây bệnh Probiotic có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn

địch tự nhiên [7], [10], [15], [21], [22], [23]

1.1.4 Tac dung va trng dung cua Probiotic

1.1.4.1 Tac dung trén co thé nguéi

“ Tăng khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác

Lacidophilus và Bifidobacterra có hiệu quả trong việc cải thiện khả năng

tiêu hóa lactose nhờ tiết enzym lactase Søceeharomyees eerevisiae giúp tiêu hóa

saccarose ở trẻ sơ sinh do thiếu saccarase [7] [23]

` Trị tiêu chay do khang sinh

Trang 13

17% [3], [6], [10], [15], [21], [23] ote Trị viêm đường tiêu hóa

Thực tế cho thấy các sản phâm probiotic có hiệu quả phòng bệnh tốt ở trẻ

em Tré so sinh uéng Bifidobacterium bifidum va Sirepfoeoeeus thermophilus có thé

làm giảm nguy cơ mặc bệnh đường tiêu chảy và viêm đường tiêu hóa do virus rota

[3], [7], [10], [15], [22]

s Tac dung lén Helicobacter pylori

Kết quả nghiên cứu cho thây các chất kháng khuẩn chứa acid ogamic do một số loài LAB tiết ra có khả năng ức chế sự tồn tại và phát triển của H.P [10], [15]

[22], [23]

“te Điều trị ung thư ruột kết

LAB có thể hạn chế ung thư do chúng có khả năng giảm mức ÿ- glucoronidase và các tác nhân gây ung thư khác [1Š] [22] [23]

“Tae dụng tăng miễn dịch, giảm viêm

Đó là khả năng tăng cường một số tế bào miễn dịch (macrophase,

lymphocyte), đại thực bào, NK hoặc các yếu tố miễn dịch (cytokin, globulin

interferon) [3], [7] [10] [15] Tác dụng lên bệnh dị ứng

VSV probiotic kích thích tổng hợp IgA đặc hiệu ở niêm mạc ruột, tăng

cường chức năng hàng rào VSV đường ruột, ức chế sự sản sinh Interleukin 10 va

Cytokin là các chất trung gian gây viêm [7] [10] [15] [23] “te Giam Cholesterol máu, hạ huyết áp

Nghiên cứu cho thay probiotic có khả năng làm giảm lượng cholesterol

trong cơ thê đo tự dị hóa và giáng chức cholesterol, hạn chế hấp thu lại cholesterol

vao mau dé san xuat catabolic [7] [10] [15]

1.1.4.2 Tac dung trong nuéi trong thiy san

Hiện nay, xu hướng sử dụng probiotie trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng Theo Boyd (1995) sử dụng probiotic có thể ngăn ngừa mùi vị giảm thành

Trang 14

và nâng cao khả năng phân hủy chất hữu cơ Ví dụ các dòng chọn loc Bacillus spp được dung dé tc ché Vibrio [3], [7], [8], [10]

1.1.5 Van dé an toan khi sir dung ché pham Probiotic

Probiotic duge cho la an toan khi str dung béi dé 1a nhimg vi khuẩn có sẵn

trong hệ tiêu hóa của người Bình thường dùng probiotic đơn độc an toàn, mặc dù ít

khi xảy ra nhưng sự kết hợp giữa probiotic với các thuốc khác có thể giảm tính an

toàn, nếu có tác dụng phụ thì triệu chứng thường nhẹ

Cần đặc biệt lưu tâm đến trẻ em, phụ nữ mang thai và cho con bú Khi sử

dụng chế phẩm cần chú ý đến một số tác dụng phụ như: dị ứng thuốc, rối loạn chuyền hóa, kích thích miễn dịch, tương tác thuốc [21], [22], [23]

1.2 Phương pháp đông khô và sản xuất chế phẩm sinh học bằng phương

pháp đông khô

1.2.1 Phương pháp đông khô

1.2.1.1 Khái niệm về phương pháp đông khô

Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm ở nhiệt độ thấp, dưới các điều kiện

cho phép đề loại trừ nước bằng cách thăng hoa (thay đỗi trang thái từ thể rắn sang

thé hoi) không phải qua thể lỏng [1], [11], [12], [19]

Hình 1.2 Giãn đồ pha của nước

Trên giản đồ pha của nước có 3 đường biểu diễn quan hệ giữa: nhiệt độ

nóng chảy - áp suất (đường nóng chây): giữa nhiệt độ sôi - áp suất (đường bay hơi);

giữa nhiệt độ thăng hoa - áp suất (đường thăng hoa) Tại điểm ba (0,0099°C; 4,579

mmHg) nước tổn tại ở cả 3 pha răn - lỏng - khí Tại điểm mà áp suất và nhiệt độ

chất rắn đông lạnh bay hơi không chuyển pha qua pha lỏng là điểm Eutectie, quá

Trang 15

1.2.1.2 Các giai đoạn của qHá trình đồng khơ [ Ì | [7] [LI] [12] [19] Giai đoạn đông lạnh

Đông lạnh thường tiến hành ở trên dưới - 40°C, tốc độ không quá I”C/ phút

Nhiệt độ hạ thấp đến mức thích hợp để nước (dung môi) tách ra khỏi các chất hòa

tan và đóng băng thành đá Các chất tan cô thành khói kết tỉnh hoặc chuyển thành

hệ rắn vô định hình chứa khoảng 1% lượng nước trong dung dịch đầu Cần phải

đảm bảo sự kết tỉnh hoàn toàn và đồng đều

« Giai đoạn làm khô sơ cấp

Là g1ai đoạn nước đá thăng hoa, nước đá được tách khỏi sản phẩm tới buông ngưng và kết tinh lại trên các đĩa lạnh làm giảm độ dày của lớp băng và tăng độ đày của sản phẩm Áp suất có ảnh hưởng lớn tới tốc độ thăng hoa nước áp suất buồng

khoảng 0,1 - 0.2 Torr là tối ưu

+ Giai đoạn làm khô thứ cấp

Là giai đoạn loại bỏ phần nước không đóng băng do quá trình phản hấp phụ

Độ ẩm còn lại của sản phâm càng nhỏ thì càng tốt giúp đảm bảo độ ồn định của chế

phẩm cả về cấu trúc hay hóa học trong quá trình bảo quản Nhiệt độ sấy sản phẩm

thường từ 25 - 50C tùy thuộc mức bền với nhiệt của sản phẩm Tốc độ sây thường

la 0,1 - 0,15C/ phút

1.2.2 Sản xuất chế phẩm sinh học bằng phương pháp đông khô

1.2.2.1 Uu diém và nhitng kho khan cua viée san xuất chê phẩm đông khô

Phương pháp đông khô được biết đến từ chiến tranh thế giới thứ II (dùng để

bảo quản huyết tương) Trong những năm gần đây, dạng bào chế này được ứng

dụng rộng rãi và đang tiếp tục được nghiên cứu - phát triển

Trong dược phẩm đông khô thường tiến hành với một số được chất như: hỗn

hop vitamine, chéng viém phi steroid, chống phù nề, điều trị ung thư, kháng sinh,

thuốc đùng trong nhãn khoa, eó nguồn góc sinh hoc (enzyme, vi khuan, vaccine,

huyết tương, nọc ran, bột tỏi ) [I1]

Phương pháp đông khô có một số ưu điểm: [11] [19]

Trang 16

chat kém 6n định như thuốc tiêm thuốc nhỏ mắt

° Tăng khả năng hòa tan nên được dùng trong một số dạng bào chế đặc biệt

như: viên nén rã nhanh bột vô khuẩn dùng cho đường hô hấp

° Rất thích hợp bào chế các chế phâm đông khô probiotic hoặc bảo quản

nắm sợi, nắm men, virus sau nhiều năm bảo quản chúng không bị biến đổi về di

truyền

e — Ngồi ra phương pháp đơng khô cũng được ứng dụng trong thực phẩm

như bảo quản rau, quả, cá, thịt

Tuy nhiên đông khô là một quá trình khá phức tạp và chịu ảnh hưởng của

nhiều yếu tố Thời gian đông khô dài; giá thành sản phẩm cao; một số thuốc có bản

chất protein dễ bị phá hủy bởi quá trình đông lạnh và làm khô; độ ôn định của các

chủng VSV ở các đợt đông khô khác nhau là khác nhau nên vấn đề tối ưu hóa các

thông số trong quá trình đông khô cần phải được nghiên cứu nhiều trong quá trình

phát triển chế phâm đông khô [1] [7] [11] 1.2.2.2 Thành phân “ Dược chất Dược chất thường kém bên với nhiệt, dễ bị thủy phân hoặc ít tan, các chất mang bản chất sinh học «` Dung mỗi Dung môi chủ yếu là nước cất Tá dược

Tá được rất đa dạng, có thể gồm: tá được độn (lactose, sữa gây ), chất ổn

định giai đoạn đông lạnh (saccarose trehalose các acid amin, đường đôi, polyol )

chất ồn định giai đoạn làm khô (đường đôi, đường ba không khử), chất ôn định

trong quá trình bảo quản (chất chống oxy hóa hệ đệm ), chất màu, chất mùi

Các tá dược bảo vệ VSV trong quá trình đông khô và bảo quản nhìn chung

Trang 17

tránh một số hiện tượng như biến tính protein gel hóa tế bào vì màng tế bảo là vị

trí quan trọng chịu nhiều tác động của quá trình đông khô [12] Với tiêu chí hạ thấp

hàm am của sản phẩm sau đông khô và giảm phân tử nước hoạt động các tá được

thường được sử dụng như: [II] [I3] [17] [18]

Bang 1.1 Một số tá dược sử dụng trong đông khô Hàm âm sau đông Tá dược Nhóm Tác dụng Nước hoạt động khô (%) Cellulose vi tinh ; 0,04 LA ni Tạo bánh đông Tinh bột khoai | thổ, ấu tịnh giai xố ; tay Polysaccharid Ộ : đoạn đông lạnh và Maltodextrin làm khô 0.25 a Dextran 4 0,02 - Mannitol phun : 5 0.36 < 0,5

say Sugar - On dinh giai doan

Sorbitol alcohol đông lạnh 0.43 <20 Maltitol 0.46 <1,0 Tạo bánh đông khô Sucrose a Disaccharid | ôn định giai đoạn 0,36 < 0,1 (Saccarose) đông lạnh làm khô Sữa gầy Tạo bánh đông khô 0,71 - 1.2.2.3 Cae yéu t6 anh huwéng téi chat hrong san pham déng khé [11] > Công thức

Bao gồm các yếu tố: thành phần của dung địch đông khô những thay đồi về

đặc điểm vật lý và hóa học xảy ra trong các giai đoạn đông lạnh và đông khô Đặc biệt cần chú ý đến các yếu tổ vật lý nhiệt như: nhiệt độ chuyển hóa “thủy tinh”, nhiệt độ Eutetic

+

“te Dac điểm của bao bì đóng gói frực tiếp

Tốc độ làm khô phụ thuộc vào kích thước lọ và thể tích dung địch chứa trong

Trang 18

đó Tốc độ thăng hoa từ dung dịch đông lạnh phụ thuộc vào diện tích lỗ hồng miệng

lọ và sự cản trở tốc độ lưu thông hơi nước của lớp sản phẩm khô Nêu chiêu cao của dung dịch trong lọ lớn và hàm lượng chất rắn cao thì sự cản trở thoát hơi nước càng

lớn

s»* Các thông số kỹ thuật về nhiệt độ và độ chuyến khối

Nhiệt lượng cần thiết cho sự thăng hoa là 670 calo/ g dùng cho quá trình

truyền nhiệt và chuyển khói Quá trình truyền nhiệt phụ thuộc vào áp suất buông

đông khô nên kiểm soát áp suất là điều rất quan trọng để duy trì độ đồng nhất giữa

các lô Độ chuyển khối là lượng nước trong quá trình thăng hoa đi tới bộ phận

ngưng tụ Sự cản trở của lớp chất rắn khô tăng theo độ dày và độ đậm đặc của nó

~ Điều kiện bảo quản

Gồm: độ âm còn lại của chế phẩm thời gian và nhiệt độ bảo quản

Độ ẩm có ảnh hưởng lớn tới khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Do

đó, giảm hàm âm tới mức thích hợp sẽ giảm được hoạt động của chúng Chế phẩm

probiotic bảo quản tôi ưu ở 5ŸC, tránh ánh sáng

s* Máy móc thiết bị đông khô

Cần có các thiết bị kiểm soát nhiệt độ và áp suất, Cấu tạo máy gồm máy bơm

khí và hơi nước; buồng khô và thiết bị cấp nhiệt, giá và thiết bị đạy nút, ông nhiều

A Co

— -

* 200) M+†+trPMsea healeddghewes — '9HẾMEðD - vy.um pump Hình 1.3 Hình ảnh và cầu tạo máy đông khô

Trang 19

Việc bảo vệ các VSV probiotic để chúng sống sót và phát huy tác dụng khi đến ruột là vẫn đề thực sự quan trọng Đến nay, probiotic qua 4 thế hệ bào chế như sau: [6] Bảng 1.2 Các thế hệ bào chế probiotic Đặc điêm vi Thế hệ sinh vật Ưu điểm Nhược điểm probiotic

VSV song nhu | Gig rénén duge sit | VSV gần như không

trong kim chi, sữa chua, pho ~ dụng nhiều CÀ sông sót khi đi qua dạ 4 ROCESS Ha ä ; day va dich mat

mat

Phai mat nhiéu thoi

gian dang bảo tử mới

Đầu tiên Thuận lợi cho nuôi ee ee te

(Non-coated) Bào tử cây, sản xuât, lưu dụng > phát huy được tác tác dụng

| probiotic trong thoi

gian nhanh nhat

con cham, bj han ché kha

năng cạnh tranh với VSV sây bệnh

Probiotic chết Không khai thác hêt

đông khô tac dung cua probiotic

( lacteol) sống VSV đưa vào

dưới dạng viên soa rea

Théhé2 | nén, viên nang = kệ bone a 2 Mất thời gian tan rã đề

Entericcoated | có lớp bao a on phóng thích VSV ngoài tan trong NHÀ

ruột

Then? Blodn thién }teang | CE AUEe Phu Gage

Micro- ad ee nhược điêm của thê hệ

| encapsulated của thê hệ 2 2

VSVcó tỷ lệ sông Đòi hỏi công nghệ và

cao trong sản xuất | kỹ thuật bào chế hiện

và bảo quản đại máy móc thiết bị

Chịu được acid dạ | đất tiên

Thế hệ 4 Lớp bên trong | dày và muối mật Giá thành cao

Tạo lớp bao là protein lớp | Lớp bao kép thông

kép bên ngoài là | minh phóng thích (Dual-coated) | polysaccharid | nhanh phát huy tác

dung cua VSV

Trang 20

1.3 Một số nghiên eứu gan day vé probiotic

Trên thế giới

Theo Yukie Miyamoto-Shinohara, Junji Sukenobe, Takashi Imaizumi va

Toro Nakahara (Nhật Bản) nghiên cứu về khả năng sống sót của vi khuẩn sau đông khô năm 2008 dura trén cac chung Gram 4m va Gram duong nhu: Enterococcus,

Chryseobacterium, Pseudomonas, Comamonas, Lactobacillus, Streptococcus cho

thấy răng trong quá trình bảo quản vi khuẩn Gram âm sau đông khô thường có tỷ lệ

sóng thấp hơn vi khuẩn Gram dương Khả năng sống sót này liên quan đến cấu trúc

thành tế bào, đó là sự có mặt của polysaccharide, acid teichoic va lipopolysaccharid Trong quá trình bảo quản, polysaeeharide thành tế bào làm giảm con acid teichoic màng tê bào làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn Đề tăng khả năng này lên cần giảm sự giữ nước cuả tế bào, giảm hàm lượng nước trong ông đựng, giảm sự hoạt

động của nước phân tử [17]

* Nam 2006, Diana Berner và Mut Viernsten thực hiện nghiên cứu trên

Laectococews lactis về ảnh hưởng của tắc nhân bảo vệ tới khả năng sống sót của vi

khuan Lactococcus lactis Sr.3.54 trong qua trinh déng khô và rã đông đã đưa ra

kết luận: các chất bảo vệ khác nhau cho khả năng sống của vi khuẩn sau đông khô

khác nhau IDiasaccharide có khả nang bao vé vi khuẩn tốt hơn monosaccharide,

với tá được Suerose/ sữa gầy kết hợp với MRS lỏng cho vi khuẩn L./zez/s khả năng

sông sót cao nhất Hơn nữa nồng độ vi khuẩn trong hỗn dịch trước tiền đông càng

cao thì khả năng sống sót của vi khuẩn sau đông khô càng cao (khoảng 10!” vi

khuẩn/ ml) [13]

lại Việt Nam

ote Dựa vào việc khảo sát khả năng chịu đựng acid, muối mật và kháng sinh trên một số probiotic đường uống như L.acidophilus, L.casei, S.faecalis, S boulardii tac

giả Nguyễn Vũ Tường Vy Nguyễn Văn Thanh va Tran Thu Hoa cho rang trong

môi trường có tính acid càng yếu thì khả năng sông sót của VSV càng cao và phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với môi trường Nên dùng sản phẩm probiotie loại này khi không quá đói hoặc quá no Với muối mật, thì tùy loài VSV mà có khả năng

Trang 21

chịu đựng khác nhau, khả năng đó càng cao khi nồng độ muối mật càng thấp và thời

gian tiếp xúc ít Trong nghiên cứu này, các VSV đều có tính đề kháng nhất định với một số kháng sinh trong đó vi khuẩn có tính đề kháng tốt nhất với Ampicillin và

Streptomycin.[9]

« Đề nâng cao độ ổn định của bột probiotic đông khô với 2 chủng nghiên cứu

la Saccharomyces boulardii, Laetobaeillus aeidophilus tác già Lê Ngọc Trân và Hồ

Thị Yến Linh đã tiền hành đánh giá khả năng chịu đựng acid và muối mật của VSV

trước và sau đông khô và thây rằng trước đông khô kha nang nay cao hon Lactose

có tác dụng bảo vệ cao nhất trong các tả dược thử Về môi trường hydrat hóa: khả

năng hồi phục cao nhất đối với L.acidophilus la maltose 10%, vGi Saccharomyces la monosodium glutamate 0.5% Môi trường đề nghị đông khô tốt nhất cho

L.acidophilus \a 1,5% lactose - 3% sữỮa gây - 10% maltose; cho S boulardii 1a 1,5% lactose - 3% sữa gay - 0.5% monosodium glutamate [4]

“Nam 2008 Phùng Thị Thu Hà tiến hành nghiên cứu thiết kế chế phẩm

probiotic chéng loan khuan ruột băng sự phéi hop da loai Lactobacillus,

Streptococcus, Saccharomyces Khao sat invitro cho thay dang két hop probiotic c6

khả năng sông sót trong môi trường acid, mudi mat va da dày ruột tốt hơn dạng đơn

loài Sự kết hop da loai L.acidophilus - L.casei - Š.themophilus cô tắc dụng tốt nhất

được lựa chọn để tiến hành đông khô [10]

Trang 22

PHAN II NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

s* Hóa chât +

Glucose (Trung Quéc)

Pepton (Trung Quoc)

Agar-agar (Viét Nam) Cao thit (Trung Quốc) Cao nắm men (Trung Quốc) ý Y YÝY Y Y YÝ Triamoni citrat (Trung Quéc) + ++ lên chủng > Lactobacillus acidopiilis ® Lactobacillus casei ® Streptococcus faecalis 2.1.2 Thiét bi > Box cay Noi hap Tủ ấm CO; May li tâm Tu lanh sau VV VW WV

Máy đông khơ

® Natri clorid (Viet Nam)

> Natri acetat (Trung Quoc)

>» Lactose (Trung Quốc) > Maltodextrin (Trung Quoc) > Sữa gây (Trung Quốc)

Các chủng probiotic dùng trong nghiên cứu:

Nguôn gốc

Bộ môn Cóng nghiệp Vtrợc

Trang 23

“- Moi trwong MRS long (MT 1) [5]:

Pepton 10g Tween 80 lg

Glucose 209 K;HPO¿ 28

Cao thịt 10g MgSO¿.7HO 0.22

Caonấmmen 5g MnSO¿4HạO 0,05g

Triamoni citrat 2g CaCO; 5g

Acetat natri 38 Nước cất vd 1000ml pH = 6.8 - 7

Môi trường MRS có thạch: (MT2) = MTI + Thạch (Agar - agar) 1,8%

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch MRS đun cho tan chảy rồi chia đều vào các ông

nghiệm, mỗi ống 5 — 6 ml nút kín Các ống nghiệm được hấp tiệt trùng ở 121°C:

0.6 atm trong 20 phút Lấy thạch ra khi còn đang ở trạng thái lỏng đặt theo độ

nghiêng thích hợp (khoảng 2⁄3 ống) Khi các ống thạch đã đông, tiến hành cấy

giống cấy từng chủng riêng rẽ Nuôi ở 37C, 5% CO; trong 24 - 48h, sau đó bảo

quản trong tủ lạnh ở i

2.2.2 Phương pháp tạo dịch tế bào (nhân giống)

Pha 10 ml môi trường MRS lỏng trong ống nghiệm nút kín rồi hấp tiệt trùng (121C: 0,6 atm 20 phút), để nguội cấy từng giống riêng rẽ và ủ trong ti CO, 5% ở

37°C trong 24h

Pha 100ml môi trường MRS lỏng trong bình nón 250 ml, nút kín rồi hap tiệt

trùng (121°C; 0.6 atm, 20 phút) để nguội Sử dụng các ống nghiệm đã nuôi cấy vi

khuẩn ở trên cây giống vào các bình nón chứa MRS lỏng và ủ trong tủ CO; 5% ở

37C sau 24 - 48h ta thu được dịch tế bào probiotic

2.2.3 Phương pháp pha loãng tính số lượng tế bào

Là phương pháp pha loãng liên tục để tính số lượng tế bào Chuẩn bị các ống

nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng (121C: 0,6

atm; 20 phút), để nguội Hút chính xác Iml địch chứa vi khuẩn cần đếm pha loãng

trong ống nghiệm thứ nhất lắc đều trong vòng 2 — 3 phút, tương tự lại hút chính xác

Trang 24

Iml dịch từ ống nghiệm thứ nhất pha loãng vào ống nghiệm thứ hai làm như vậy

cho tới ống nghiệm có nồng độ thích hợp (khoảng từ 25 — 300 vi khuẩn/ ml) Nhỏ

0,1ml dịch trong ống nghiệm cần khảo sát vào đĩa petri chứa 20 mI MT2 đã hấp tiệt

trùng để nguội sử dụng que chang dàn đều trên bề mặt đĩa Đặt các đĩa này trong tủ CO; 5% ở 37C trong 24 - 48 h, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc rồi tính kết quả [7]

Công thức tính: A =Anxnx10 (1)

Với A : là số lượng tê bào trong Iml dịch ban đầu

Aa: là số lượng tế bào tại nồng độ pha loãng n

n: là hệ số pha loãng

Trang 25

Tiến hành đông khô mẫu ứng với các môi trường độn khác nhau như: sữa gay

10%, 15%, 20%; Lactose 5%, 10%, 20%; Maltodextrin 3%, 5%, 10% theo cach sau: dùng pipetman hút chính xác 1.5 ml hỗn dịch chia vào các lọ thủy tỉnh, sau đó

tiền đông ở - 40C rồi chuyển vào máy đông khô

Quá trình đông khô kết thúc khi trên các lọ không còn lớp tuyết bao phủ Cân

toàn bộ sản phẩm (được z gram) và bảo quản các lọ ở các điều kiện khác nhau

2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền đông tới độ ôn định của chế phẩm đông khô

Chuẩn bị mẫu đông khỏ với tá được sữa gầy 15% đã hấp tiệt tring (121°C;

0.6 atm; 20 phút) Các mẫu thử từ PI đến P4 với P1 P2, P3 P4 lần lượt là các mẫu tiễn hành tiền đông trong 1h, 2h, 3h và 4h Sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, 10,

12 tuân tiến hành đêm số lượng tế bào theo mục 2.2.6

Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền đông tới độ ỗn định của chế phẩm

đông khô đựa vào tỷ lệ vi khuân đông khô sống sót sau các khoảng thời gian với SỐ lượng vi khuẩn sông sót ngay sau đông khô Từ kết quả đó rút ra được thời gian tiền đông tối ưu

2.2.6 Phương pháp đánh giá tỷ lệ sông sót của VSV probiotie trước và ngay sau

đông khô

Tiến hành đông khô theo phương pháp 2.2.4, sau đó đếm số lượng tế bào vi

khuẩn trước và ngay sau đông khô

Dùng phương pháp pha loãng liên tục đề tính số lượng tế bào A, trong Iml

hỗn địch ngay trước đông khô theo công thức (1) Từ đó suy ra tổng số lượng VSV

(B,) trong hỗn dịch trước khi đông khô:

B= A,* 50

Số lượng tế bào ngay sau đông khé (cfu/g) duge xac dinh nhu sau: can chinh xdc 0,1g ché phẩm ngay sau đông khô trên cân phân tích pha lỗng vào I0 mÌ nước

muối sinh lý đã hấp tiệt trùng (121°C; 0,6 atm, 20 phút), để nguội, lắc đều thu được

dịch nồng độ 10” Sau đó dùng phương pháp pha loãng liên tục tính số lượng tế bào

trong 1g san phẩm ngay sau đông khô theo công thức: A; = A*100 /0,1 [7] Trong

Trang 26

đó A, là số lượng tế bào trong 1g san pham ngay sau đông khô A là số lượng tế bào

trong 0,Ig sản phẩm ngay sau đông khô Từ đó tính được tông số lượng VSV (B,)

sau đông khô:

B; = A;? m

% tỷ lệ vi khuẩn sống sót sau đông khô = B,*100/ B,

2.2.7 Phương pháp danh gia su anh hưởng của môi trường độn tới độ ồn định của chế phẩm đông khô

Các mẫu sản phẩm được đông khô với các môi trường độn khác nhau tại thời

gian tiền đông tối ưu Sau đông khô các lọ được nút kín, dán nhãn và bảo quản

trong tủ lạnh TE Sau các khoảng thời gian 2, 4 6, 8, 10, 12 tuần tiền hành dém

số lượng tế bào trong 0.Ig chế phẩm với các môi trường độn khác nhau Kết quả được trình bày như bảng 3.3

% Môi trường độn là sữư gây

Các nông độ sữa gây sử dụng là 10%, 15% và 20%

s% Môi trường độn là lacfose

Các nông độ lactose sử dung la 5%, 10% và 20%

s* Môi trường độn là malfodexfrin

Các nồng d6 maltodextrin str dung 1a 3%, 5% và 10%

2.2.8 Phương pháp đánh giá sự ảnh hướng của điều kiện bảo quản tới độ ôn

định của chế phẩm đông khô

Sản phẩm sau đông khô được nút kín, dán nhăn và bảo quản ở điều kiện

5°C, 37°C va nhiệt độ phòng tránh ánh sáng Sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, 10,

12 tuân tiến hành đếm số lượng tế bào theo phương pháp 2.2.3 Các kết quả được

trình bày tương ứng ở các bảng 3.3 bảng 3.5 và bảng 3.6

Trang 27

PHAN III KET QUA VA BAN LUẬN

3.1 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền đông tới độ ôn định của chế phẩm đông khô Bang 3.1 Số lượng vi khuẩn trước và sau đông khô với thời gian tiền đông khác nhau ae Số lượng vi khuân PI P2 P3 P4 Ngay trước 1 83.2.10 10 83.2.10 10 83.2.10 10 83,2.10 10 Ngay sau ĐK 75.6.10° 66.1.10'” 7510" 5i3IP" Sau 2 tuân 57.5.10'” 33.9.10”” 26,3.10'” 24,0.10" Sau 4 tuân 50510" 40.7.10°" 36,3.10"" 26.3.10'” Sau 6 tuân 20.9.10” 10,5.10°" 72,4.10° 48.1.10° Sau 8 tuân 12.6.10'” 66.1.107 48,0.10° 29,2.10” Sau 10 tuân 43.7.10° 20,4.10° 10,2.10° 69.8.10” Sau 12 tuân 56.2.10' 48.1.10” 24,1.107 12.1.10' %4 tê bào chết cate toe 9,13 20,55 30,88 38,34

Nhân xét: Thời gian tiền đông là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn tới khả năng

sống của vi khuẩn sau đồng khô Dựa vào bang 3.1 thay trong mau P1 vi khuẩn có kha nang sông sót cao nhất, hai mẫu P2 và P3 gan tuong duong nhau, mau P4 kém

nhất cả về tỷ lệ sống sót ngay sau đông khô lẫn trong 12 tuần nghiên cứu

Mẫu PI có tỷ lệ tế bào chết sau đông khô nhỏ nhất (9,13%) lớn nhất là mẫu

P4 (38.34%) Nhìn vào biểu đồ hình 3.1 cũng cho thấy mẫu PI vi khuẩn có khả

năng sông cao nhất Mẫu P1 cho kết quả khảo sát lớn nhất có thẻ là đo thời gian tiền

đông ngắn nên không gây sốc cho vi khuẩn khi tiếp xúc với nhiệt độ lạnh, tuy thời

Trang 28

gian tiền đông ngắn nhưng nước vẫn có thể đóng băng thành đá Các mẫu thí nghiệm được làm trong các lọ nhỏ với thể tích dịch 1.5 ml nên đủ điều kiện tạo đá

trong 1h Theo lý thuyết khi tiến hành tiền đông cần chú ý tới tốc độ kết tính nước

đá khoảng 0,5 - 1°C/ phut là tốt nhất Thời gian đông khô có ảnh hưởng đến độ én

định của sản phẩm, nếu chậm sẽ kéo dài thời gian làm phá hủy hoạt chất hoặc gây

tổn thương VSV, vậy nếu rút ngắn được thời gian tiền đông sẽ rút ngắn được thời

gian đông khô [11] 120 100 co oS —o—P 1 —a—P2 \ —x—P3 Y ~x- B4 T | T J T

SauÐK Sau2 Sau Sau6 Sau8 Sau10 Sau 12

tuần 4tuan tuần tuần tuần tuần Thời gian Tỷ lệ sông sau ĐK(%}) oD © +> Oo No oS© Hình 3.1 Tỷ lệ vi khuẩn sống sau đông khô trong các mẫu P1, P2, P3, P4 theo thời gian

Kết quả trên biểu đồ cho thấy với thời gian tiền hành tiền đông ngắn (1h) chế

phẩm Ổn định hơn thời gian tiền đông dài (4h) Vì vậy khi tiến hành đông khô cần

tính toán thời gian và tốc độ làm lạnh làm sao cho tốt nhất trong từng trường hợp và

điều kiện cụ thê

3.2 Đánh giá tý lệ sông sót của VSV probiotic trước và ngay sau đông khô

Trang 29

Bang 3.2 Số lượng vi khuẩn trước và sau đông khô với các môi trường độn khác nhau

Số lượng tê bào (10 ”) :

Môi trường chât độn % tê bào chêt

Trước đông khô | Ngay sau đông khô 10% 83,1 76,2 8,27 Sữa gầy 15% 83,2 75.6 9,13 20% 86.3 11 15,78 5% 77,8 67,3 13,54 Lactose 10% $2.5 70,7 14,33 20% 72,3 60,8 15,89 3% 91,3 80,1 12,32 Maltodextrin 5% Tai 68,3 11,45 10% 90,3 78.0 13,68 Nhân xét:

Nhìn vào bảng 3.2 cho thấy số lượng vi khuẩn ngay sau đông khô giảm

chứng tỏ trong đồng khô có một lượng tế bào chết, trong đó sau đông khô tá dược

sữa gầy ở nồng độ 10% cho tỷ lệ vi khuẩn chết ít nhất (8,27%) còn tá được laetose

20% cho tỷ lệ vi khuẩn chết cao nhất (15.893)

Nông độ tá dược càng cao thì tỷ lệ vi khuẩn chết cũng càng lớn, do nồng độ

chất rắn cao trong lớp đá sẽ làm cản trở nước thăng hoa ở quá trình làm khô sơ cấp

vì vậy làm giảm độ ổn định của chế phẩm Do đó cần phải khảo sát tìm nồng độ tá

dược thích hợp cho quá trình đông khô Theo nghiên cứu của Yukie Miyamoto-

Shinohara, Junji Sukenobe, Takashi Imaizumi va Toro Nakahara về khả năng sông

của vi khuẩn sau đông khô cho thấy: vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ sống cao hơn vi

khuẩn Gram âm, điều này lý giải dựa trên cấu trúc thành và màng tế bảo vi khuẩn

(lớp peptidoglycan lipopolysaccharid, acid teichoic ) các thành phần này có tính

chất quyết định tới khả năng sống của vỉ khuẩn trước tác động của đông khô (nhiệt

độ, áp suất ) nên cần lựa chọn được tá dược bảo vệ thích hợp [17]

Trang 30

Có rất nhiều yếu tó ảnh hưởng tới độ ỗn định của chế phẩm đông khô, cả trong quá trình đông khô và trong bảo quản Phân thực nghiệm trên chỉ cho biết tỷ

lệ vi khuẩn sống ngay sau đông khô nên cần đánh giá ảnh hưởng của tá dược đến độ ổn định chế phẩm theo thời gian bảo quản

3.3 Đánh giá sự ảnh hưởng của môi trường độn tới độ On định của chế phẩm

đông khô

Để thuận tiện cho việc đánh giá ảnh hưởng của các môi trường độn đến sự on

định của chế phẩm probiotic, chúng tôi tiễn hành so sánh tỷ lệ sống của các vi

khuẩn trong cùng một điều kiện bảo quản ở tủ lạnh 5”C Theo cách bố trí phần thực

nghiệm 2.2.7 ta có các kết quả bảng 3.3

Ngay truéc DK (dia 10°) — Ngay sau ĐK (đĩa 10”) Sau ĐK §tuần (đĩa 10)

Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa petri của mẫu probiotic đông khô với sữa gầy 10%

Nhân xét:

Bảng 3.3 cho thây số lượng tế bào vi khuẩn có xu hướng giảm dân theo thời

gian bảo quản Nhìn chung lượng tế bào sống sau đông khô thu được khá cao, tuy

nhiên không đồng đều Kết quả thu được cao nhất với tá được sữa gây nông độ 10% - sau 12 tuần giảm ít nhất (135 lần), còn kết quả thấp nhất với tá dược lactose ở nông độ 20% - sau 12 tuần giảm nhiều nhát (3679 lần) Dễ nhận thấy rằng sau 2 - 8

tuần lượng vi khuẩn giảm chậm đều, song tuần 10 và 12 lại giảm rất nhanh, điều

này cho thây điều kiện bảo quản có ảnh hưởng tới độ ốn định của chế phẩm đông

khô mà ở đây là thời gian và độ âm không khí Trong quá trình bảo quản, chế phẩm

bị hút ẩm, hàm lượng nước trong chế phẩm tăng lên khiến số lượng vi khuẩn giảm

nhiều Trong nghiên cứu của hai tác giá Lê Ngọc Trân và Hồ Thị Yến Linh cũng

Trang 31

cho thay số lượng vi khuẩn L.acidophilus giảm mạnh sau 3 tháng bảo quản tại 4°C

[4] Vì vậy với điều kiện thời tiết nóng ẩm như ở Việt Nam chế phẩm đông khô hay

dược phâm nói chung cần phải bảo quản nơi khô mát

Ảnh hưởng của tá được:

Cả ba tá dược trên đều có tính chất bảo VỆ vi khuẩn trong quá trình đông khô, trong đó sữa gầy cho kết quả tốt hơn cả, tiếp đến là maltodextrin, sau tới lactose

Hai tác giả Diana Berner và Mut Viernsten đã đánh giá ảnh hưởng của tá được đến

qua trinh déng khé trén Lactococcus lactis Sr.3.54 cho biét: tá được serurose kết

hợp với sữa gầy có khả năng khôi phục sức sống của /./zefis cao nhất là 78% [13] Đối chứng với kết quả nghiên cứu này, chúng tôi thấy tá dược lactose 20% cũng cho kết quả khảo sát khá cao với khả năng khôi phục vi khuẩn sống được sau đông

khô đạt 75% (sau 12 tuần giảm từ 80.1.10Ỷ xuống 22,9.10' ) Kết quả thu được cao

là do chế phẩm kết hợp đông khé ba chting Lactobacillus acidophilus, L.casei va

S faecalis, ba ching nay có khả năng sống vượt trội nhất là chủng L.easei [10] Do vậy trong đông khô tùy từng trường hợp cụ thể mà có sự lựa chọn tá dược khác

nhau phụ thuộc vào từng chât đông khô là vi khuẩn hay protein Ví dụ: với nam

men Saccharomyces boulardii thi wu tién ding lactose 1,5% [4], con voi khang

nguyén IgY/ga thi sir dung scrurose 0,3 M là tốt nhất [14]

Sữa gầy, lactose hoặc một số đường khác là những tá dược bảo vệ được nghiên cứu nhiều do chúng vừa có tác dụng tạo bánh đông khô vừa ồn định được

giai đoạn đông lạnh và làm khô Trong nghiền cứu “Nâng cao độ ồn định của bột đông khô probiotie”[4] với hai chủng nghiên cứu là Saecharomyces boulardlii

Lactobacilius tắc giả Lê Ngọc Trân và Hồ Thị Yến Linh đã cho thấy lactose có tác dụng bảo vệ cao nhất trong các tá được thử, môi trường đề nghị đông khô tốt nhất

cho L.acidophilus 1a 1,5% lactose - 3% sữa gây - 10% maltose; cho $ bowlardii là

1.5% lactose - 3% sữa gầy - 0,5% monosodium glutamate Sita gay ngoài chứa

lactose ra còn chứa nhiều chất khác như protein enzyme nên có tác dụng hydrat

hóa tốt Có thể coi sữa gầy là tác nhân bảo vệ phân tử lớn do đó có tác dụng bảo vệ

tốt hơn lactose cũng như disaccharide là chất bao vé tét hon monosaccharide [13]

Trang 32

Bảng 3.3 Số lượng vi khuẩn trong 0,10 g chế phẩm đông khô với các môi trường độn ở điều kiện 5C Thời Sita gay Lactose Maltodextrin gian (tuần) | 10% | 15% | 20% | 5% | 10% | 20% | 3% | 5% | 10% Ngay 76,2 | 67,1 | 72.7 | 68,3 | 80,1 | 78,0 | 70.7 | 67,3 | 60,8 10° 10° I0 | 108 | 109 | 100 | 10 | 10 | 10 579 | 49/2 | 53.3 | 50,3 | 60.1 | 58,5 | 51,6 | 49,0 | 44.6 : 10Ẻ 10° 10 | 10 | 10 | 10? | 100 | 10 | 10° 531 | 448 | 50.2 | 46,8 | 45.9 | 30,0 | 45.4 | 46,4 | 38,7 ! 10° 10° 10° | 10° | w® | 10 | 10” | 10 | lữ 777, | 114 | 162 | 20,5 | 3247 | 93/3 | 145 | 3l1 | 1556 : 10Ẻ 10° mo | TỰ || to’ | te | ot | ie | 16 20.4 | 72,8 | 53,0 | 50,9 | 41,6 | 15,8 | 41,0 | 69,9 | 13,7 10° 107 10’ | 107 | 107 10 | 107 | 107 | 10 lã | 124 | Bé | TS | SG | 214 | Tếjấ, | 1X, | 25ẽ " 10’ 10’ I0 | 105 | 105 | 10 | 10” | 107 | 10 56.4 | 54,0 | 45,8 | 81/3 | 57,8 | 21,2 | 16,4 | 36,4 | 74.4 5 10° 10° 1" | to | 10” | 10) | 10” | 107 | 10

Theo kết quả thu được ta thấy nồng độ tá được cũng có ảnh hưởng tới độ én định của chế phẩm Nông độ tá dược lớn hay nhỏ để có tác đụng bảo vệ vi khuẩn tốt

Trang 33

phụ thuộc vào bản chất của tá được và nguyên liệu đông khô cụ thể Tá được có thể

tạo liên kết với các phân tử ái điện như protein, nhóm mang điện tích trên thành tế

bào VSV giúp tế bào tránh được một sé tổn hại như: gel hóa tế bảo chất, biến tính

protein Theo như nghiên cứu trên tác giả Trân và Linh cũng cho thấy có thể dùng đơn hay kết hợp tá dược với nhau để cho tác dụng bảo vệ tốt nhất Theo bảng 3.3 thì

với các tá được như trên tương ứng với sữa gây 10%, lactose 5%, maltose 5% là

nồng độ thích hợp nhất Theo như Nguyễn Văn Thành trong “Nghiên cứu tạo chế

phẩm probiotic đông khô chống loạn khuẩn ruột” [7] cho rằng nồng độ môi trường chất độn không ảnh hưởng nhiễu đến số lượng chết của tế bào, nhưng trong nghiên

cứu này chúng tôi thấy trái ngược, có thể do hai nghiên cứu có sự khác nhau về nguôn gốc vi khuẩn, về chất lượng tá dược, đặc biệt là phương pháp đông khô

Dựa vào biểu đồ hình 3.3 cho thấy sau 12 tuần bảo quản tá dược sữa gây ở

nông độ 10% có biên độ giảm ít nhất so với nồng độ 15% và 20% Ở tuần thứ 10,

thứ 12 sau đông khô tại các nông độ sữa gầy VSV đều bị chết nhiều cho thấy ảnh

hưởng của thời gian và độ 4m trong quá trình bảo quản đến độ ôn định của chế phẩm 7 — 6 = = ẬN + E ả = 4 —@=SG610% Ð 15% $, VN -a_SG16 2 a ie —_§G20% a 2 : = Cc ò.- — he 11 0 T T T —=—=r— iẳ ồn 2 4 6 8 10 12 Thời gian (tuan)

Hình 3.3 Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với tá dược

sữa gầy tại hai lần định lượng liên tiếp

Trang 34

Lượng tế bào giảm (lần) “®=Mal5% 3 =#- Mal3% ⁄ ——Mal10% : aS 1 0 :

Ngay Sau 2 Sau 4 Sau 6 Sau8 Sau 10 Sau 12

sau DK Tuan Tuan Tuan Tuan Tuần Tuần

Thoi gian (tuan)

Hình 3.4 Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 g chế phẩm đông khô với tá dược

maltodextrin tai hai lan dinh lượng liên tiếp

Với ta duge maltodextrin, hinh 3.4 cho thay tai mau đông khô với nồng độ maltodextrin 5% vi khuẩn có tỷ lệ giảm thấp nhát trong 12 tuần nên có tác dụng bảo

vệ tốt nhất Ở nồng độ 3% và 10% maltodextrin thể hiện tác dụng tương đương nhau

Tương tự với tá dược lactose, hình 3.5 cho thay 6 néng dé 5% lactose vi

khuẩn có tỷ lệ giảm thấp nhất nên có tác dụng bảo vệ tốt nhất Ở nồng độ 20%

lactose tỷ lệ giảm của vi khuẩn là cao nhất

Từ biểu đồ hình 3.6 thấy rõ được khả năng bảo vệ tế bào VSV sau đông khô

giảm theo thứ tự sữa gây (10%) > maltodextrin (5%) > lactose (5%) Nhìn chung

với cả ba tá được lượng vi khuẩn đều giảm theo một chu kỳ gần như tương đương:

5 tuần đầu sau đông khô lượng giảm ít còn từ tuần thứ 6 trở về sau số lượng vi

khuân giảm mạnh do phụ thuộc vào điều kiện bảo quản như nhiệt độ, độ âm vậy

tốt nhất nên bảo quản chế phẩm đông khô probiotic trong điều kiện 5”C tránh nhiệt

độ cao

Trang 35

12 10 lượng tế bào suy giam (lần) a —e— Lac10% —¬—Lac5% ——-Lac20% _ Ỷ Thời gian (tuần) TT LỆ

2tuần 4tuần 6tuan Btuần 10tuan 12tuan

Thời gian (tuần)

Hình 3.5 Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với tá dược

lactose tai hai lần định lượng liên tiếp 12 10 Lượng tế bào suy giàm (lần) > - Lac5% =——>- Mal5% Ngay sau ĐK 2 4 6 8 10 12 Thời gian (tuần)

Hình 3.6 Tỷ lệ số lượng vi khuẩn trong 0,10 øg chế phẩm đông khô với các tá

dược tại hai lần định lượng liên tiếp

Trang 36

Bang 3.4 Ty 1é s6 luong vi khuan trong 0,10 g ché pham déng khé v6i cac ta dược tại hai lần định lượng liên tiếp Tỷ lệ tế bào suy giảm (lần) Thời gian Sữa gây Lactose Maltodextrin LG 10% | 15% | 20% | 5% 10% | 20% 3% 5% 10% 2 132 | 136 | 136 | 436 | 1,33 1,33 La? | L387 | 138 4 1,09 | 1,10 | 1,06 | 4.97 131 2,09 LI4 |; EOS | LAs 6 1,91 | 380 | 3.10 | 23g | 202 | 321 | 3.14 | 2,20 | 2,48 8 1,36 | 1,62 | 3,06 | 403 | 546 | 5,92 | 3.53 | 3,02 | 3.24 10 5,34 | 5,87 | 3,96 | 6.76 | 7,09 | 7,28 | 5:22 | 5,09 | 5.34 12 2,36 | 2,23 | 2,92 | 9,27 | 10,16 | 10,26 | 4,78 | 3,76 | 3,44

Bang 3.4 trén cho thay số lần giảm về số lượng vi khuẩn tại hai thời điểm định

lượng liên tiếp (thời điểm trước so với thời điểm ngay sau đó)

3.2.4 Đánh giá sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản tới độ ôn định của chế

phẩm đông khô

Với mục đích đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới sự én định của

ché phẩm đông khô chúng tôi tiến hành sử dụng mẫu đông khô với các tá được sữa

Trang 37

Bang 3.5 Số lượng vi khuẩn trong 0,10 g chế phẩm đông khô với các môi

Trang 38

Bang 3.6 Số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với các môi

trường độn ở điều kiện nhiệt độ phòng tránh ánh sáng

Thời Môi trường

Trang 39

Nhân xét:

Tại nhiệt độ 37”C và nhiệt độ phòng (20 — 25”C) đều cho kết quả số lượng vi

khuẩn sông sót giảm hơn so với bảo quản ở 5°C, đặc biệt ở 37C số lượng tế bào øiảm nhanh nhất Nhìn chung sự suy giảm số lượng vi khuẩn ở đây cũng tương tự như mục 3.2.3: sữa gày có tác dụng bảo vệ tốt nhất, rồi đến maltodextrin, sau đó

đến lactose

Nhiệt độ phòng và 37C là nhiệt độ tốt cho sự khởi động quá trình sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn probiotic song do độ âm quá thấp nên chúng bị chết nhiều còn ở tủ lạnh các vi khuẩn chỉ bị kìm hãm sự phát triển do vậy probiotic tốt nhất nên bảo quản trong tủ lạnh Theo nghiên cứu cho thấy tuôi thọ bảo quản vi

khuẩn đông khô 1 tuần ở 37C bằng 1 năm trong tủ lạnh 4”C [14]

Để tháy rõ hơn sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ôn định của chê phẩm đông

khô chúng tôi đánh giá độ ổn định của cùng mẫu đông khô với sữa gầy 10% bảo

quản tại 3 điều kiện như trên

Bảng 3.7 Số lượng vi khuẩn trong 0,10 ø chế phẩm đông khô với sữa gầy 10%

Trang 40

Dựa vào bảng trên ta thấy số lượng vi khuân ở mẫu sữa gây 10% trong ba điều kiện bão quản đều giảm dần theo thời gian Mức độ giảm ít nhất ở 5“C (135 lần) và giảm nhiều nhất ở 37°C (hơn 10” lần) Sự khác biệt giữa bảo quản ở nhiệt độ phòng và 37C không lớn (khoảng ó lần) Loạ xí mi be se 5860 6 _———_ —s— | —a7aec neta = —Nđộ 2 phòng 0 Ne "3 ok 2 wi vẮ& “we Ö ` # Ny ws P a SP Ss & & SY p @® „Ð vờ a” cP ca oP oP cẰ Gv (x: số lượng khuẩn lạc) Hình 3.7 Sự biến thiên số lượng vi khuẩn trong 0,1 g chế phẩm đông khô với

tá được sữa gầy 10% ở các điều kiện bảo quản