Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây mật nhân (eurycuma longifolia jack)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG - ĐOÀN THỊ ÁNH TUYẾT NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng - 2014 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG - ĐOÀN THỊ ÁNH TUYẾT NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ngành: Sinh – Mơi trường KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: Ths Võ Châu Tuấn Đà Nẵng - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khác Đà Nẵng, ngày 23 tháng năm 2014 Sinh viên Đoàn Thị Ánh Tuyết LỜI CẢM ƠN Đề hồn thành khóa luận em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Sư phạm, khoa Sinh – Môi trường, môn công nghệ sinh học, q thầy cơ, gia đình bạn bè tạo điều kiện thuận lợi vật chất tinh thần để em hồn thành đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Võ Châu Tuấn, thầy giáo trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em từ nhận đề tài hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Bùi Thị Thơ, Ths Nguyễn Thị Duy Nhất, người giúp đỡ em nhiều việc trau dồi kiến thức kĩ thí nghiệm suốt q trình em thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn ! Đà Nẵng, ngày 23 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Đoàn Thị Ánh Tuyết MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LỆU 1.1 Nhân giống in vitro thực vật 1.1.1 Lịch sử hình thành .3 1.1.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro .3 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro nuôi cấy tế bào thực vật .5 1.1.3.1 Nguồn mẫu vật nuôi cấy 1.1.3.2 Môi trường nuôi cấy .6 1.1.3.2 Điều kiện nuôi cấy 1.2 Sơ lược nghiên cứu nhân giống in vitro dược liệu .10 1.2.1 Những nghiên cứu giới 10 1.2.2 Những nghiên cứu Việt Nam .11 1.3 Giới thiệu mật nhân 13 1.3.1 Đặc điểm hình thái 13 1.3.2 Phân bố 13 1.3.3 Thành phần hóa học 13 1.3.4 Tác dụng dược lý 14 1.3.5 Một số nghiên cứu liên quan đến mật nhân 15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng nghiên cứu .16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 17 2.2.2 Phương pháp hình thành rễ in vitro 17 2.2.3 Khảo sát thích nghi mật nhân in vitro đưa đất 17 2.2.4 Xử lý số liệu 18 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .19 3.1 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi in vitro mật nhân 19 3.1.1 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi in vitro 19 3.1.2 Ảnh hưởng tổ hợp BA NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro mật nhân .20 3.1.3 Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi in vitro 21 3.2 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo rễ in vitro mật nhân .23 3.2.2 Ảnh hưởng NAA BA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 24 3.2.3 Ảnh hưởng NAA KIN đến khả tạo rễ in vitro mật nhân .25 3.3 Đánh giá khả sống sót sinh trưởng mật nhân in vitro đưa trồng đất 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 Kết luận 28 Đề nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT IAA : indole 3-acetic acid IBA : indole 3-butyric acid NAA : α-naphthalen acetic acid 2,4-D : diclorophenoxyacetic acid BA : 6-γ- γ-dimethyl-aminopurine BAP : 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine purine KIN : kinetin MS : Murashige Skoog cs :cộng ĐHST : điều hòa sinh trưởng NXB : nhà xuất L : lít DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cây mật nhân tự nhiên 16 2.2 Gốc thân mật nhân in vitro 16 3.1 3.2 3.3 Chồi mật nhân hình thành sau tuần ni cấy môi trường bổ sung 0,5 mg/L BA Rễ mật nhân hình thành sau tuần ni cấy mơi trường bổ sung 0,5 mg/L NAA Cây mật nhân in vitro sinh trưởng sau tuần vườn ươm 23 26 27 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Tên bảng Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi in vitro mật nhân Ảnh hưởng BA NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro mật nhân Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi in vitro mật nhân Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Ảnh hưởng NAA BA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Ảnh hưởng NAA KIN đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Trang 19 20 22 23 24 25 Ảnh hưởng chất đến khả thích nghi, sinh 3.7 trưởng phát triển mật nhân in vitro tự nhiên 27 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ hàng ngàn năm, thuốc cung cấp lượng lớn dược chất quý dùng điều trị bệnh tăng cường sinh lực cho người [27] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), giới có đến 80% dân số dựa vào phương pháp truyền thống kết hợp sản phẩm từ thiên nhiên để chăm sóc sức khỏe ¼ số thuốc chứa hợp chất chiết xuất từ thực vật [1] Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm nên nguồn thảo dược đa dạng phong phú, với 3200 loài [5] Hiện nay, nạn khai thác bừa bãi, mức loài thuốc phục vụ nhu cầu dược liệu làm suy giảm nhanh chóng số lượng, chất lượng loài thuốc đẩy nhiều loài quý, vào nguy tuyệt chủng [20] Trong nhiều thập kỷ qua, phát triển mạnh mẽ lĩnh vực công nghệ sinh học nói chung, ni cấy mơ tế bào thực vật nói riêng mang lại nhiều thành tựu lớn việc nhân giống cải thiện di truyền loài cây, đặc biệt thuốc quý Bằng kỹ thuật ni cấy in vitro thực vật, tạo lượng lớn giống thời gian ngắn với chất lượng tốt bệnh mà phương pháp nhân giống truyền thống thực [45] Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) thuốc quý, sử dụng nhiều nước Đông Nam Á Hầu hết phận sử dụng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh, chẳng hạn bệnh sốt rét, tiểu đường, viêm loét, nhiễm khuẩn…; đặc biệt có tác dụng tốt cải thiện sinh lý nam giới [56] Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học q mật nhân xác định alkaloid, quassinoid, eurycolactone, laurycolactone, eurycomalactone, canthin-6-one… [25], [40] Mật nhân loài thân gỗ lâu năm, sinh trưởng chậm, phải trồng - năm thu hoạch dùng làm thuốc [26] Hiện nước ta, nhu cầu sử dụng thực vật làm thuốc để chăm sóc sức khỏe chữa bệnh ngày tăng, việc khai khác thác mức mật nhân diễn nhiều nơi, dẫn đến nguy tuyệt chủng tương lai gần Do đó, việc 25 Tỉ lệ tạo rễ tốt 0,5 mg/L NAA (93,3%); đạt 10 rễ/chồi, rễ phát triển nhanh Khi tăng nồng độ BA lên 0,5 mg/L ức chế khả tạo rễ chồi, đồng thời kích thích tạo callus (mơi trường 0,5 mg/L NAA + mg/L BA, chồi không tạo rễ tạo callus mạnh) 3.2.3 Ảnh hưởng NAA KIN đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Kết bảng 3.4 cho thấy, sau tuần nuôi cấy kết hợp 0,5 mg/L NAA + (0,25 - 1,0 mg/L) KIN cho tỉ lệ tạo rễ giảm dần tăng dần nồng độ KIN từ 0,25 - mg/L Tỉ lệ tạo rễ tốt 0,5 mg/L NAA (93,3%), với số rễ đạt 10 rễ/chồi, rễ phát triển nhanh Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA KIN đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Chất ĐHST (mg/L) NAA KIN Khả tạo rễ in vitro Tỉ lệ mẫu tạo rễ Số rễ/ Chiều dài rễ (%) chồi (cm) 0,5 0,25 82,5 10,0a 2,8a 0,5 0,50 68,7 6,7b 2,7a 0,5 0,75 31,5 4,1bc 1,8b 0,5 1,00 16,7 2,5c 0,6c Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p