Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ (polygonum multiflorum thumb)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  HỒ THỊ ÁNH MY NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM THUMB) Ngành: Sƣ phạm Sinh học Ngƣời hƣớng dẫn: TS Võ Châu Tuấn NIÊN KHÓA 2012 - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi.Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Hồ Thị Ánh My LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Một lần em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên Hồ Thị Ánh My MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược thuốc 1.1.1 Khái niệm thuốc 1.1.2 Đặc điểm thuốc 1.1.3 Vai trò giá trị thuốc 1.2 Những nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nhân giống in vitro bảo tồn nhân nhanh loài thuốc .5 1.2.1 Những nghiên cứu giới .5 1.2.2 Những nghiên cứu nước 1.3 Nuôi cấy in vitro thực vật 1.3.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro 1.3.2 Quy trình nhân giống in vitro 1.3.3 Những vấn đề nuôi cấy in vitro 1.3.4 Môi trường nuôi cấy .10 1.3.5 Điều kiện nuôi cấy 13 1.3.6 Nhân giống in vitro thực vật .14 1.4 Vài nét Hà thủ ô đỏ 15 1.4.1 Nguồn gốc phân bố .15 1.4.2 Đặc điểm hình thái 16 1.4.3 Giá trị dược liệu .16 1.4.4 Thành phần hóa học .17 1.5 Tình hình nuôi trồng nghiên cứu Hà thủ ô đỏ 17 1.5.1 Tình hình nuôi trồng sản xuất Hà thủ ô đỏ giới Việt Nam 17 1.5.2 Những nghiên cứu nuôi cấy in vitro Hà thủ ô đỏ .18 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .20 2.1.2 Thời gian địa điểm 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 21 2.3.2 Phương pháp tạo rễ in vitro 21 2.3.3 Phương pháp đưa đất 21 2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu .21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Khảo sát môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi hà thủ ô đỏ 22 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi in vitro 22 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro 24 3.1.3 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro 25 3.2 Khảo sát môi trường tối ưu để tạo rễ in vitro hà thủ ô đỏ 27 3.3 Ảnh hưởng đường sucrose đến khả tạo rễ in vitro 29 3.4 Ảnh hưởng độ pH đến khả tạo rễ in vitro 31 3.5 Khả sống hà thủ ô đỏ in vitro đất .32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .36 Kết luận 36 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid BA : 6-benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine IBA : Indole 3-butyric acid KIN : Kinetin ĐHST : Điều hòa sinh trưởng MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng BA đến khả nhân chồi in vitro hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 23 3.2 Ảnh hưởng KIN đến khả nhân chồi in vitro hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 24 3.3 Ảnh hưởng BA, NAA đến khả nhân nhanh chồi hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 26 3.4 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 28 3.5 Ảnh hưởng đường sucrose đến khả tạo rễ sau tuần nuôi cấy 30 3.6 Ảnh hưởng độ pH đến khả tạo rễ sau tuần nuôi cấy 31 3.7 Ảnh hưởng giá thể đến khả sống sót hà thủ đỏ ngồi nhà lưới 33 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang Hình 2.1 Hà thủ đỏ ngồi tự nhiên 20 Hình 3.1 Nhân nhanh chồi hà thủ ô đỏ sau tuần ni cấy với BA 2mg/l 24 Hình 3.2 Nhân nhanh chồi hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy với KIN 1,5mg/l 25 Hình 3.3 Nhân nhanh chồi hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy với BA mg/l NAA 0,5 mg/l 27 Hình 3.4 Cây hà thủ ô đỏ tạo rễ sau tuần nuôi cấy Các rễ mơi trường P (A) có NAA mg/l, P (B) có NAA 0,5 mg/l, P (C) có NAA 1,0 mg/l, P (D) có NAA 1,5 mg/l , P ( E) có NAA 2,0 m/l 29 Hình 3.5 Cây hà thủ ô đỏ tạo rễ sau tuần nuôi cấy môi trường MS tỉ lệ sucrose Các chồi mơi trường P (A) có NAA 0,5 mg/l 10 g/l sucrose, P (B) có NAA 0,5 mg/l 20 g/l sucrose, P (C) có NAA 0,5 mg/l 30 g/l sucrose 30 Hình 3.6 Cây hà thủ ô đỏ tạo rễ sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung NAA với độ pH Các rễ mơi trường P (A) có NAA 0,5 mg/l pH: 5,5, P (B) có NAA 0,5 mg/l pH : 5,7, P (C) có NAA 0,5 mg/l pH: 5,9, P (D) có NAA 0,5 mg/l pH: 6,0, P (E) có NAA 0,5 mg/l pH: 6,2 32 Hình 3.7 Hình 3.8 Cây hà thủ ô đỏ sinh trưởng sau tuần trồng nhà lưới giá thể P (A) Xơ dừa + Đất + Cát (1:1:1), P (B) Xơ dừa+ đất Cây hà thủ đỏ sinh trưởng sau tuần trồng ngồi nhà lưới giá thể Xơ dừa + Đất + Cát (1:1:1) 33 34 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, với phát triển xã hội, dân số tăng nhanh, nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng Thảo dược nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để chế biến sản xuất lồi thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh phục hồi sức khỏe người Nguồn dược liệu người sử dụng tổng hợp nhiều đường khác tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu khai thác từ thực vật người sử dụng từ lâu ngày có nhu cầu lớn [3] Với phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật áp dụng vào lĩnh vực: nhân giống in vitro, dung hợp tế bào trần, tạo sinh khối tế bào thực vật hệ lên men… việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật theo hướng tạo nguồn nguyên liệu ổn định cung cấp cho trình tách chiết hoạt chất sinh học đóng vai trò quan trọng việc sản xuất dược chất ngành dược phẩm [12] Trong số loài thảo dược phổ biến hà thủ đỏ (Polygonum multiflorum Thumb) thuộc họ rau răm (Polygonaceae) lồi dược liệu có giá trị kinh tế, có sách đỏ Việt Nam cần bảo vệ Hà thủ đỏ tìm thấy Trung Quốc vào năm 713 sử dụng loại thảo dược trường sinh người Trên giới, hà thủ đỏ có nhiều Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản Ấn Độ Ở Việt Nam hà thủ ô phân bố chủ yếu miền núi phía Bắc Hà Giang, Lào Cai… Trong y học cổ truyền, hà thủ đỏ có tác dụng thơng tiểu, giải độc, bổ gan, ích tinh huyết, tăng lực, tóc khơ hay rụng, làm đen tóc kéo dài tuổi thọ…[2] Trong hà thủ đỏ có số hợp chất quan trọng như: emodin, physcion, rhein, lecithin…Trong tự nhiên hà thủ ô trồng hạt giâm cành Tuy nhiên, Lin (2003), xác định hà thủ đỏ có nguồn gốc in vitro cho tỉ lệ chất emodin physcion cao ngồi tự nhiên Trước đây, nguồn hà thủ đỏ tự nhiên nước ta dồi gần bị khai thác mức nạn phá rừng tràn lan nên trữ lượng hà thủ ô đỏ bị giảm sút nghiêm trọng, không cấp đủ nguồn dược liệu cho việc chế biến sản xuất thuốc chữa bệnh cho người dân Nếu nhân giống theo phương pháp truyền thống cần thời gian dài sản lượng không ổn định [17] Trong nghiên cứu trước Hoàng Thị Kim Hồng (2011) xây dựng hồng chỉnh quy trình nhân giống in vitro hà thủ ô đỏ Cây nuôi cấy mô sinh trưởng phát triển tốt điều kiện khí hậu Huế [5] Mặc dù quy trình tác giả thu số chồi trung bình tạo thành mẫu môi trường nhân chồi tốt đạt 8,54 chồi/mẫu, cao công bố Chang Lin cs (2003) 4,7 chồi/mẫu, Trần Thị Kim Thu cs (2008) 6,5 chồi/mẫu [17],[18] Tuy nhiên hiệu nhân chồi chưa cao lắm, nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu khả nhân nhanh chồi in vitro hà thủ ô đỏ, số tổ hợp môi trường khác nhằm tìm mơi trường tối ưu cho việc nhân nhanh giống hà thủ ô đỏ [13] Xuất phát từ sở tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thumb) Mục tiêu đề tài Xây dựng hồn thiện quy trình nhân nhanh giống hà thủ ô đỏ với hệ số nhân giống cao, sức sống tốt Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học điều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần nhân nhanh hồn thiện quy trình nhân giống hà thủ đỏ 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài giúp chúng tơi đề xuất quy trình nhân giống hà thủ ô đỏ kĩ thuật nuôi cấy mơ tế bào, nhằm sản xuất giống nhanh,góp phần phục tráng giống, bảo tồn phát triển bền vững nguồn gen thuốc quý Việt Nam 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BA, NAA đến khả nhân nhanh chồi hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy Chất ĐHST BA NAA (mg/l) (mg/l) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 Số chồi/mẫu Khả nhân nhanh chồi Chiều cao Đặc điểm chồi chồi (cm) 4,45a 9,46b 7,9c 7,12d 6,16d 2,33a 3,13b 2,47c 2,36d 2,11e Nhỏ, xanh non To, khỏe, xanh đậm To, xanh đậm Trung bình, xanh đậm Trung bình, xanh non Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p