“Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)” Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm Hoàng Hộ, 1999). Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực. Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu, thông sữa, kiết lỵ nặng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh lăng được dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và saponin (Vo et al., 1998). Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985). Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol và hepadeca 1,8 (e) dien 4,6 diyn 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu trong nhân sâm, điều này cho thấy có khả năng sử dụng Đinh lăng để thay thế cho nhân sâm (Nguyễn Trần Châu và cs, 2007). Trong khi đó, một trong các nguyên nhân khiến cho các sản phẩm chứa Đinh lăng còn khá ít trên thị trường là do nguồn cung cấp cây giống chủ yếu là giâm cành, chất lượng cây giống lại không cao, nếu trồng theo phương pháp tự nhiên thì mất 35 năm mới thu hoạch rễ và hàm lượng saponin triterpen tự nhiên trong cây không đủ đáp ứng nhu cầu về dược liệu. Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đinh lăng là phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giống đồng đều, sạch bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam đây là một hướng đi tương đối mới, cho nhiều tiềm năng kinh tế đang được các nhà khoa học cũng như các nhà nhân giống quan tâm từ mức độ nghiên cứu đến quy mô sản xuất thương mại. Để đáp ứng những nhu cầu thực tế trên, tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)”
Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực Tôi cam đoan rằng các thông tin, trích dẫn của luận văn đó được chỉ dẫn nguồn gốc và nghiên cứu đầy đủ Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Ngọc LỜI CẢM ƠN 1 Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: 1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo, kĩ thuật viên phòng thí nghiệm - Khoa Nông học - Trung tâm Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại trường Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Chuyên, đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Ngọc MỤC LỤC 2 Khóa luận tốt nghiệp 2 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BA Cs : Benzyl-amino-purine : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng IBA : Indole-3-butyric acid Kineti : Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and skoog NAA : Naphthalene Acetic Acid 3 Khóa luận tốt nghiệp 3 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC BIỂU ĐỒ 4 Khóa luận tốt nghiệp 4 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và có nhiều cây thuốc quý Trong số đó có cây Đinh lăng Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình, phòng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao Đinh lăng còn có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần và lipid toàn phần trong huyết thanh (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2001) Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ… Trong đó loài đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm Hoàng Hộ, 1999) Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu, thông sữa, kiết lỵ nặng Tại Ấn Độ, theo K M Naikairai, Đinh lăng được dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và saponin (Vo et al., 1998) Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm Hợp chất polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng 5 Khóa luận tốt nghiệp 5 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học nấm Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985) Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol và hepadeca 1,8 (e) dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu trong nhân sâm, điều này cho thấy có khả năng sử dụng Đinh lăng để thay thế cho nhân sâm (Nguyễn Trần Châu và cs, 2007) Trong khi đó, một trong các nguyên nhân khiến cho các sản phẩm chứa Đinh lăng còn khá ít trên thị trường là do nguồn cung cấp cây giống chủ yếu là giâm cành, chất lượng cây giống lại không cao, nếu trồng theo phương pháp tự nhiên thì mất 3-5 năm mới thu hoạch rễ và hàm lượng saponin triterpen tự nhiên trong cây không đủ đáp ứng nhu cầu về dược liệu Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đinh lăng là phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giống đồng đều, sạch bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam đây là một hướng đi tương đối mới, cho nhiều tiềm năng kinh tế đang được các nhà khoa học cũng như các nhà nhân giống quan tâm từ mức độ nghiên cứu đến quy mô sản xuất thương mại Để đáp ứng những nhu cầu thực tế trên, tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L Harm)” 2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật in vitro để nhân nhanh giống cây Đinh lăng lá nhỏ 3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0.1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn 6 Khóa luận tốt nghiệp 6 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine (kinetine,BA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợp nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp tài liệu khoa học về ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp in vitro Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu thành công sẽ bổ sung tài liệu tham khảo phục vụ cho giảng dạy và các nghiên cứu khác Đồng thời nâng cao kỹ năng tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho sau này Góp phần nhân giống cây Đinh lăng, tạo ra một số lượng cây giống lớn, đồng đều có chất lượng cao để cung cấp phục vụ cho sản xuất và thị trường tiêu dùng 7 Khóa luận tốt nghiệp 7 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại cây Đinh lăng Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie thuộc cộng hòa Pháp nằm ở phía nam Thái Bình Dương Tên khoa học của Đinh lăng là Polyscias fruticosa L.Harms, được L.Harms mô tả và định tên vào năm 1894 Ngoài ra, Đinh lăng còn có tên gọi khác là cây gỏi cá hay cây Nam dương lâm - Loài: P fruticosa - Chi: Polyscias - Phân họ: Aralioideae - Họ: Araliaceae - Họ ngũ gia bì - Bộ: Apiales - Lớp: Dicolyledoneae - Lớp hai lá mầm - Ngành: Magnoliophyta - Ngành Mộc lan - Giới: Plantae - Giới thực vật Chi Polyscias có gần 100 loài, phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam, có 7 loài, đều là cây trồng (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) 1.2 Đặc điểm sinh thái Đinh lăng là loại cây chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt ở vùng đất, tơi xốp có độ ẩm trung bình (Nguyễn Bá Hoạt, 2005) Cây cũng có thể chịu bóng râm, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai ((Đỗ Huy Bích và cs, 2004) Đinh lăng sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, ra hoa và quả vào tháng 4 đến tháng 7 Cây trồng ở các tỉnh phía bắc có hiện tượng tàn lụi vào mùa đông do khí hậu lạnh, thường trồng bằng cành sau 2 đến 3 năm thì cây có quả, hạt Đinh lăng có khả năng tái sinh dinh dưỡng mạnh nhưng chưa quan sát được cây con mọc từ hạt Cây thường được trồng bằng 8 Khóa luận tốt nghiệp 8 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học cách giâm cành, cây được 4 đến 5 tuổi trở lên sẽ cho nhiều hoạt chất nhất (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) 1.3 Đặc điểm hình thái Đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) nên nó mang một số đặc điểm chung của họ này như: Là cây thân gỗ hay cây bụi, đôi khi là các cây thân thảo sống lâu năm, chúng thường có lá kép hình lông chim hay hình chân vịt và có các hoa nhỏ mọc thành chùy lớn, rễ cây có dáng như người gồm một rễ cái và nhiều rễ phụ Tuy nhiên, Đinh lăng cũng có một số đặc điểm riêng dùng để phân biệt với các loài khác như sau: • Thân Đinh lăng là loại cây gỗ nhỏ, dạng bụi, xanh tốt quanh năm, cây thường cao 1 - 1,5 m (có thể cao đến 2m hoặc hơn) Vỏ thân màu trắng nhạt, hơi xám, thân nhẵn, không có gai, ít phân nhánh, phân cành thấp, thân mang nhiều vết sẹo lá to hình chữ V, máu xám và những nốt lỗ vỏ, vỏ thân có mùi thơm nhẹ (Đỗ Tất Lợi, 2003) • Lá Lá kép ba lần lông chim, mọc so le, dài 20 - 40 cm, không có lá kèm rõ Lá chét có cuống nhỏ mảnh dài 3 - 15 cm, dạng màng, phiến lá chét có răng cưa không đều, đôi khi chia thùy, gốc và đầu thuôn nhọn, có chóp nhọn, dài 3 - 10 cm, rộng 0,6 - 4 cm Cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở phần cuối Lá có mùi thơm khi vò nát (Đỗ Tất Lợi, 2003) • Hoa Hoa nhỏ thành cờ, tán ngắn dài 7 - 18 cm, cụm hoa mọc ở ngọn thành chùy ngắn mang nhiều tán, mỗi tán có 15 - 20 hoa nhỏ, lá bắc rộng, sớm rụng Đài hoa hình chén, gồm 5 lá đài Hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, có 5 cánh hình trứng thuôn dài 2 - 3 mm, có 5 nhị, chỉ nhị ngắn và mảnh, dài khoảng 1,5 mm, bao phấn kéo dài, bầu hạ, 2 ô, có rìa trắng nhạt (Đỗ Tất Lợi, 2003) 9 Khóa luận tốt nghiệp 9 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học • Quả Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài 4 - 5 mm, rộng 3 mm và dày 1,5 - 2 mm, có vòi tồn tại Hạt hình thận và hình khối 3 cạnh màu trắng, kích thước 1 - 3 mm, vỏ hạt lồi lõm Cây ra hoa, quả vào tháng 4 đến tháng 7 (Từ điển bách khoa dược học, 1999) • Rễ Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5 cm, đầu trên to, phía dưới thuôn nhỏ Mặt ngoài màu trắng xám, có nhiếu nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ còn sót lại Thường hợp thành một bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỗ chiếm 2/3 bán kính, các tia ruột từ giữa tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt (Từ điển bách khoa dược học, 1999) Trong tự nhiên, dễ có sự nhầm lẫn giữa các cây cùng tên Đinh lăng nhưng không được dùng làm thuốc như: + Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Baill.): Lá thường chỉ có 3 lá chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù + Đinh lăng lá to hay Đinh lăng lá ráng (Polyscias ilicifolia (Merr.) Baill.): Lá kép, có 11 - 13 lá chét, lá chét hình mác có răng cưa to và sâu + Đinh lăng trổ hay Đinh lăng viền bạc (Polyscias guilfoylei Baill.): Lá kép có 7 lá chét, lá chét thường có viền trắng Loại này lại có 2 thứ là: - Polyscias guilfoylei Baill var laciniata Baill - Polyscias guilfoylei Baill var victoriae Baill 1.4 Thành phần hóa học Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6, C, 20 axit amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng: K, Mn, Ca, Mg, Fe, Lo, Zw và 21,10 % đường Trong lá còn có saponin tripterpen (1,65 %), một genin đã xác định được là axit oleanolic (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) 10 Khóa luận tốt nghiệp 10 Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Biểu đồ 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 20 ngày LSD0,05 đạt 0,142 và CV % = 1,3 cho thấy sự sai khác giữa các công thức của thí nghiệm kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ là có ý nghĩa với độ tin cậy là 95% Nhìn vào bảng 3.4 và đồ thị 3.4 ta thấy các công thức khác nhau cho khả năng ra rễ của cây Đinh lăng lá nhỏ khác nhau và tất cả các công thức đều cao hơn so với CT1 Điều đó cho thấy ảnh hưởng của nồng độ NAA được bổ sung sẽ làm tăng khả năng ra rễ và tăng chất lượng rễ của cây Đinh lăng lá nhỏ Với các công thức bổ sung NAA thì CT2 cho khả năng ra rễ cao hơn đối với CT1, cụ thể là trên 10% số mẫu đưa vào nhằm mục đích ra rễ Khi tăng nồng độ lên từ 0,1 mg/l đến 1 mg/l cho tỷ lệ ra rễ tăng dần Nồng độ NAA sử dụng để bổ sung trong thí nghiệm này tại 1 mg/l đạt tỷ lệ ra rễ cao nhất lên đến 96,67 % Tăng nồng độ vượt quá 1 mg/l thì tỷ lệ ra rễ lai có xu hướng giảm đi còn 83,33% tại CT5 với nồng độ NAA là 1,5 mg/l Điều này cho thấy tăng thêm nồng độ chất kích thích vượt quá ngưỡng thích hợp sinh trưởng NAA trong quá trình ra rễ của cây Đinh lăng lá nhỏ , có thể gây ức chế hoạt động ra rễ của cây Đinh lăng lá nhỏ Vì vậy dùng NAA 1 mg/l trong quá trình ra rễ cho mẫu Đinh lăng lá nhỏ cho tỷ lệ ra rễ cao nhất Hình 3: Hình ảnh Đinh lăng lá nhỏ trong giai đoạn ra rễ 42 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 43 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Sau một thời gian nghiên cứu nhân nhanh cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thức vật trên môi trường MS cơ bản bổ sung chất kích thích sinh trưởng như: BA, Kinetin, NAA với nồng độ khác nhau tôi rút ra một số kết luận sau: - Thời gian khử trùng mẫu: mẫu được khử trùng bằng dung dịch HgCl 20,1% trong 10 phút cho kết quả tốt nhất Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 88,89 % - Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ khi bổ sung Kinetine và BA là: MS + agar 6 g/l + đường 25 g/l + Kinetine 1,0 mg/l cho hệ số nhân trồi 2,26 lần, chất lượng chồi tốt, các chồi mập, đẹp lá to, xanh đậm - Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ khi bổ sung kết hợp Kinetine và NAA là : MS + agar 6 g/l + đường 25 g/l + Kinetine 1,0 mg/l + NAA 1,0 mg/l, hệ số nhân chồi đạt 2,8 lần - Môi trường thích hợp nhất cho sự cảm ứng rễ Đinh lăng lá nhỏ khi bổ sung thêm NAA là : MS + agar 6 g/l + đường 25 g/l + NAA 1,0 mg/l, số rễ/cây đạt 16,33 và cho tỷ lệ chồi ra rễ là 96,67% Đề nghị Do thời gian thực tập có hạn nên tôi mới chỉ tiến hành được những thí nghiệm nói trên Vì vậy tôi đưa ra đề nghị sau: 1 Cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khi bổ sung kết hợp với các chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất như BAP, IAA, IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ 3 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt 44 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 1 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương,Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mái,Phạm Kim Mãn, Đàm Thị Như, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc, Tập I, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Trang 793-796 2 Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thúy Hòa (2003), Giáo trình công nghệ sinh học Nxb Nông nghiệp Hà Nội 3 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cấy trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 4 Phạm Hoàng Hộ (1999), Quyển II, Cây cỏ Viêt Nam, Nxb Trẻ, Trang 516-518 5 Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam 6 Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 7 Ngô Ứng Long (1985), “So sánh tác dụng tăng lực và sinh thích nghi của Đinh lăng Polycias frusticosa L Harms, Chân chim và Eleuterococ”, Tạp trí Dược liệu, Tập 2, (Số 1), Trang 24-27 8 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vi ̣ thuốc Viêt Nam , Nxb Y học Trang 828-830 9 Trần Công Luận (1996), “Phân lập và xác đinh cấu trúc hợp chất polyacetylen trong lá Đinh lăng (Polyscias Fruticosa (L.) Harms Araliaceae)”, Tập 1 10.Trần Công Luận và cs (2000), “Nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc thuộc họ nhân sâm (Araliaceae) có tác dụng chống stress và tăng lực”, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học, Bộ Y Tế 11.Ninh Thi ̣ Phím, “Một số biện pháp kỹ thuật tăng hiệu quả nhân giống, Của cây đinh lăng lá nhỏ, Polyscias fruticosa (L.) Harms”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, Tập 11, (số 2), 168-173 12.Nguyễn Đức Thành (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 13.Nguyễn Quang Thạch (2005) Giáo trình công nghệ sinh học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 14.Ngô Văn Thu (1990), Hóa Học saponin, Khoa dược, trường Đại Học Y Dược Tp-HCM, Trang 194 45 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học 15.Lê Thiên Thư, Võ Thị Bạch Mai (2005), “Nghiên cứu về sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L Harms”, Tạp trí Phát triển Khoa học và Công nghệ Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, Tập 8, (số 11), trang 47-51 16 Đỗ Văn Vịnh (2007), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội II Tài liệu tiếng Anh 17.Vo D H., Yamamura, S., Ohtani, K., Kassai, R., Yamasaki, K., Nguyen, T.N., Hoang, M.C (1998) Oleanaae Saponins from Polysias Frutisoca Phytochemistry, Vol 29, No 12 2472 18.RH Smith (2005) Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments 2ndedn Elsevier Publishers, New Dalhi 19.Murashige, T and Skoog, F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissu culture Physiol Plant, Vol 15, pp 473- 497 20.Dodd J H., Roberts L W.(1999), Experiments in plant tissue culture, Cambridge University press, United Kingdom 46 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học PHỤ LỤC THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG MURASHIGE AND SKOOG – 1962 (MS) Lượng pha cho 1 lít (g/l) 7,44 5,56 82,5 95 1,24 34 1,66 0,05 0,005 74 4,8 1,72 0,005 88 0,4 0,1 0,1 0,02 Hóa chất A B C D E F Na2EDTA FeSO4.7H2O NH4NO3 KNO3 H3BO3 KH2PO4 KI Na2Mo4.2H2O CoCl2.6H2O MgSO4.7H2O MnSO4.5H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.2H2O CaCl2.2H2O Glixin Axit nicotinic (B5) Pyridoxin (B6) Thiamine (B1) Lượng sử dụng (ml/l) 5 20 5 5 5 5 PHỤ BẢNG Phụ bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE MC FILE BOOK1 30/ 5/18 22: 1 :PAGE 1 VARIATE V003 MC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= 1 NL 2 1.50000 750000 1.00 0.424 3 2 CT 3 410.000 136.667 182.22 0.000 3 * RESIDUAL 6 4.49997 749995 * TOTAL (CORRECTED) 11 416.000 37.8182 - 47 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 Khoa Nông học 30/ 5/18 22: 1 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS MC 1 4 6.25000 2 4 5.50000 3 4 6.25000 SE(N= 4) 5%LSD 6DF 0.433011 1.49786 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS MC 1 3 15.0000 2 3 7.33333 3 3 0.333333 4 3 SE(N= 3) 5%LSD 6DF 1.33333 0.499998 1.72957 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 30/ 5/18 22: 1 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 1 VARIATE MC GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 12) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 6.1496 0.86602 12 6.0000 C OF V |NL % |CT | | | | | | | | | 4.4 0.4237 0.0000 48 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học Phụ bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cytokine (kinetine,BA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 30 ngày BALANCED ANOVA FOR VARIATE CNN FILE BOOK1 30/ 5/18 12:52 :PAGE 1 ANH HUONG CUA NONG DO CYTOKINE DEN KHA NANG NHAN NHANH CHOI CAY DINH LANG LA NHO VARIATE V003 CNN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= 1 NL 2 295238E-01 147619E-01 2 CT 6 2.73143 * RESIDUAL 455238 1.82 0.202 3 56.24 0.000 3 12 971425E-01 809521E-02 * TOTAL (CORRECTED) 20 2.85810 142905 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 30/ 5/18 12:52 :PAGE 2 ANH HUONG CUA NONG DO CYTOKINE DEN KHA NANG NHAN NHANH CHOI CAY DINH LANG LA NHO MEANS FOR EFFECT NL NL NOS CNN 1 7 1.65714 2 7 1.57143 3 7 1.64286 SE(N= 7) 5%LSD 12DF 0.340067E-01 0.104786 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS CNN 1 3 1.06667 2 3 1.53333 3 3 2.26667 4 3 1.63333 5 3 1.43333 6 3 1.96667 7 3 1.46667 49 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang SE(N= 3) 5%LSD 12DF Khoa Nông học 0.519462E-01 0.160064 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 30/ 5/18 12:52 :PAGE 3 ANH HUONG CUA NONG DO CYTOKINE DEN KHA NANG NHAN NHANH CHOI CAY DINH LANG LA NHO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 1 VARIATE CNN GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 21) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 21 1.6238 0.37803 C OF V |NL | | | | | | | | | % |CT 0.89973E-01 5.5 0.2025 0.0000 Phụ bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợp nhất (A) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 30 ngày BALANCED ANOVA FOR VARIATE CNN FILE BOOK1 30/ 5/18 12:55 :PAGE 1 ANH HUONG CUA NONG DO CYTOKINE THICH HOP NHAT KET HOP VOI NAA DEN KHA NANG NHAN VARIATE V003 CNN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= 1 NL 2 150000E-01 750000E-02 2 CT 3 3.14250 * RESIDUAL 6 249997E-01 416661E-02 1.04750 1.80 0.244 3 251.40 0.000 3 * TOTAL (CORRECTED) 11 3.18250 289318 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 30/ 5/18 12:55 :PAGE 2 ANH HUONG CUA NONG DO CYTOKINE THICH HOP NHAT KET HOP VOI NAA DEN KHA NANG NHAN MEANS FOR EFFECT NL NL NOS CNN 1 4 2.27500 2 4 2.20000 50 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang 3 4 Khoa Nông học 2.20000 SE(N= 4) 0.322746E-01 5%LSD 6DF 0.111643 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS CNN 1 3 1.40000 2 3 2.30000 3 3 2.80000 4 3 2.40000 SE(N= 3) 0.372676E-01 5%LSD 6DF 0.128914 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 30/ 5/18 12:55 :PAGE 3 ANH HUONG CUA NONG DO CYTOKINE THICH HOP NHAT KET HOP VOI NAA DEN KHA NANG NHAN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 12) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS CNN 12 2.2250 0.53788 C OF V |NL | | | | | | | | | % |CT 0.64549E-01 2.9 0.2440 0.0000 Phụ bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 20 ngày BALANCED ANOVA FOR VARIATE SR FILE BOOK1 30/ 5/18 22:15 :PAGE 1 VARIATE V003 SR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= 1 NL 1 871109E-01 871109E-01 2 CT 4 77.1689 * RESIDUAL 4 951115E-01 237779E-01 19.2922 3.66 0.127 3 811.35 0.000 3 * TOTAL (CORRECTED) 9 77.3511 8.59457 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 30/ 5/18 22:15 51 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Khoa Nông học :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS SR 1 5 12.1733 2 5 12.3600 SE(N= 5) 0.689607E-01 5%LSD 4DF 0.270311 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SR 1 2 8.13333 2 2 10.5000 3 2 12.9000 4 2 16.3333 5 2 13.4667 SE(N= 2) 0.109036 5%LSD 4DF 0.427399 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 30/ 5/18 22:15 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 10) NO OBS SR 10 12.267 DEVIATION BASED ON BASED ON TOTAL SS RESID SS 2.9316 0.15420 C OF V |NL % |CT | | | | | | | | | 1.3 0.1273 0.0002 52 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A ... ? ?Nghiên cứu nhân giống in vitro đinh lăng nhỏ (Polycias fruticosa L Harm)? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân giống Đinh lăng nhỏ kỹ thuật in vitro để nhân nhanh giống Đinh lăng nhỏ. .. Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, Đinh lăng trổ, Đinh lăng ráng, Đinh lăng tròn Đinh lăng nhỏ? ?? Trong lồi đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) loài dân gian sử dụng rộng rãi... Hình 2: Hình ảnh Đinh lăng nhỏ giai đoạn nhân nhanh Hình 2A: Mẫu Đinh lăng nhỏ cấy chuyển Hình 2B: Đinh lăng nhỏ cấy mơi trường bổ sung Kinetine 1mg/l sau 15 ngày Hình 2C: Đinh lăng nhỏ cấy môi trường