Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)

“Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)” Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm Hoàng Hộ, 1999). Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực. Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu, thông sữa, kiết lỵ nặng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh lăng được dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và saponin (Vo et al., 1998). Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985). Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol và hepadeca 1,8 (e) dien 4,6 diyn 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu trong nhân sâm, điều này cho thấy có khả năng sử dụng Đinh lăng để thay thế cho nhân sâm (Nguyễn Trần Châu và cs, 2007). Trong khi đó, một trong các nguyên nhân khiến cho các sản phẩm chứa Đinh lăng còn khá ít trên thị trường là do nguồn cung cấp cây giống chủ yếu là giâm cành, chất lượng cây giống lại không cao, nếu trồng theo phương pháp tự nhiên thì mất 35 năm mới thu hoạch rễ và hàm lượng saponin triterpen tự nhiên trong cây không đủ đáp ứng nhu cầu về dược liệu. Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đinh lăng là phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giống đồng đều, sạch bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam đây là một hướng đi tương đối mới, cho nhiều tiềm năng kinh tế đang được các nhà khoa học cũng như các nhà nhân giống quan tâm từ mức độ nghiên cứu đến quy mô sản xuất thương mại. Để đáp ứng những nhu cầu thực tế trên, tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)”

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện Các số liệu

và kết quả trong luận văn là trung thực Tôi cam đoan rằng các thông tin, trích dẫncủa luận văn đó được chỉ dẫn nguồn gốc và nghiên cứu đầy đủ Nếu sai tôi hoàntoàn chịu trách nhiệm

Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Ngọc

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo, kĩ thuật viên phòng thínghiệm - Khoa Nông học - Trung tâm Công nghệ sinh học - Trường Đại họcNông - Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt thờigian thực tập tốt nghiệp tại trường.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Chuyên, đã

tận tình chỉ bảo, hướng dẫn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôitrong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đãluôn động viên, khích lệ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình họctập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Ngọc

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại cây Đinh lăng 4

1.2 Đặc điểm sinh thái 4

1.3 Đặc điểm hình thái 5

1.4 Thành phần hóa học 6

1.5 Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới 7

1.5.1 Trên thế giới 7

1.5.2 Ở Việt Nam 8

1.6 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.6.1 Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật 8

1.6.2 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

1.6.3 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy 11

1.6.4 Tính toàn năng của tế bào thực vật 12

1.6.5 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 13

1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.7.1 Vật liệu nuôi cấy 14

1.7.2 Điều kiện nuôi cấy 14

1.7.3 Thành phần môi trường nuôi cấy 14

1.7.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 24

2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 24

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 24

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 25

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 27

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu Đinh lăng lá nhỏ sau 30 ngày 29

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cytokine (kinetine,BA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 30 ngày 32

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợp nhất (A) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 30 ngày 35

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 20 ngày 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

MS : Murashige and skoogNAA : Naphthalene Acetic Acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bàothực vật 16Bảng 1.2 Bốn loại vitamin thường dùng 17Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2(0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu cấy sau 30 ngày 29Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cytokine (kinetine,BA)đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 30 ngày 32Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợpnhất (A) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lánhỏ sau 30 ngày 35Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng

ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 20 ngày 37

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 (0,1%) đến khảnăng vô trùng mẫu cấy sau 30 ngày 30Biểu đồ 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cytokine(kinetine,BA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 30ngày 33Biểu đồ 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợpnhất (A) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lánhỏ sau 30 ngày 36Biểu đồ 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khảnăng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 20 ngày 38

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và

có nhiều cây thuốc quý Trong số đó có cây Đinh lăng

Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe,

chống stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình,phòng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao Đinh lăng còn cótác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng

hạ cholesterol toàn phần và lipid toàn phần trong huyết thanh (Nguyễn ThịThu Hương và cs, 2001)

Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinhlăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ… Trong đó loài đinh lăng

lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãilàm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (PhạmHoàng Hộ, 1999)

Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạngthuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làmthuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè Đặc biệtrượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng đểchữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực Trong dân gian, ngoàicông dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu,thông sữa, kiết lỵ nặng Tại Ấn Độ, theo K M Naikairai, Đinh lăng đượcdùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen vàsaponin (Vo et al., 1998) Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tíchcực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm Hợp chấtpolyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng

nấm Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin khôngthay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985).

Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol và hepadeca 1,8 (e) dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu trong nhânsâm, điều này cho thấy có khả năng sử dụng Đinh lăng để thay thế cho nhânsâm (Nguyễn Trần Châu và cs, 2007)

-Trong khi đó, một trong các nguyên nhân khiến cho các sản phẩm chứaĐinh lăng còn khá ít trên thị trường là do nguồn cung cấp cây giống chủ yếu làgiâm cành, chất lượng cây giống lại không cao, nếu trồng theo phương pháp tựnhiên thì mất 3-5 năm mới thu hoạch rễ và hàm lượng saponin triterpen tự nhiêntrong cây không đủ đáp ứng nhu cầu về dược liệu Việc đáp ứng nhanh và bềnvững nguồn cây giống có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách

Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đinh lăng là

phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giốngđồng đều, sạch bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu.Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Namđây là một hướng đi tương đối mới, cho nhiều tiềm năng kinh tế đang đượccác nhà khoa học cũng như các nhà nhân giống quan tâm từ mức độ nghiêncứu đến quy mô sản xuất thương mại

Để đáp ứng những nhu cầu thực tế trên, tôi quyết định thực hiện đềtài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias

fruticosa L Harm)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật in

vitro để nhân nhanh giống cây Đinh lăng lá nhỏ.

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl20.1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine (kinetine,BA)đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợp nhấtkết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng NAA đến khả năng ra rễcủa chồi cây Đinh lăng lá nhỏ

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp tài liệu khoa học về ảnhhưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của

giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp in vitro.

Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhângiống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu thành công sẽ bổ sung tài liệu tham khảo phục vụcho giảng dạy và các nghiên cứu khác Đồng thời nâng cao kỹ năng tiếp cậncông tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho sau này

Góp phần nhân giống cây Đinh lăng, tạo ra một số lượng cây giống lớn,đồng đều có chất lượng cao để cung cấp phục vụ cho sản xuất và thị trườngtiêu dùng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại cây Đinh lăng

Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie thuộc cộng hòa Pháp

nằm ở phía nam Thái Bình Dương Tên khoa học của Đinh lăng là Polyscias

fruticosa L.Harms, được L.Harms mô tả và định tên vào năm 1894 Ngoài ra,

Đinh lăng còn có tên gọi khác là cây gỏi cá hay cây Nam dương lâm

- Giới: Plantae - Giới thực vật

Chi Polyscias có gần 100 loài, phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt,nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam, có 7 loài, đều là cây trồng(Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

1.2 Đặc điểm sinh thái

Đinh lăng là loại cây chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt ở vùngđất, tơi xốp có độ ẩm trung bình (Nguyễn Bá Hoạt, 2005) Cây cũng có thểchịu bóng râm, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất

ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai ((ĐỗHuy Bích và cs, 2004) Đinh lăng sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, ra hoa

và quả vào tháng 4 đến tháng 7 Cây trồng ở các tỉnh phía bắc có hiện tượngtàn lụi vào mùa đông do khí hậu lạnh, thường trồng bằng cành sau 2 đến 3năm thì cây có quả, hạt Đinh lăng có khả năng tái sinh dinh dưỡng mạnhnhưng chưa quan sát được cây con mọc từ hạt Cây thường được trồng bằng

cách giâm cành, cây được 4 đến 5 tuổi trở lên sẽ cho nhiều hoạt chất nhất.(Đỗ Huy Bích và cs, 2004).

1.3 Đặc điểm hình thái

Đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì

(Araliaceae) nên nó mang một số đặc điểm chung của họ này như: Là câythân gỗ hay cây bụi, đôi khi là các cây thân thảo sống lâu năm, chúng thường

có lá kép hình lông chim hay hình chân vịt và có các hoa nhỏ mọc thành chùylớn, rễ cây có dáng như người gồm một rễ cái và nhiều rễ phụ Tuy nhiên,Đinh lăng cũng có một số đặc điểm riêng dùng để phân biệt với các loài khácnhư sau:

 Thân

Đinh lăng là loại cây gỗ nhỏ, dạng bụi, xanh tốt quanh năm, cây thườngcao 1 - 1,5 m (có thể cao đến 2m hoặc hơn) Vỏ thân màu trắng nhạt, hơi xám,thân nhẵn, không có gai, ít phân nhánh, phân cành thấp, thân mang nhiều vếtsẹo lá to hình chữ V, máu xám và những nốt lỗ vỏ, vỏ thân có mùi thơm nhẹ(Đỗ Tất Lợi, 2003)

 Lá

Lá kép ba lần lông chim, mọc so le, dài 20 - 40 cm, không có lá kèm rõ

Lá chét có cuống nhỏ mảnh dài 3 - 15 cm, dạng màng, phiến lá chét có răngcưa không đều, đôi khi chia thùy, gốc và đầu thuôn nhọn, có chóp nhọn, dài 3

- 10 cm, rộng 0,6 - 4 cm Cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở phần cuối Lá

có mùi thơm khi vò nát (Đỗ Tất Lợi, 2003)

 Hoa

Hoa nhỏ thành cờ, tán ngắn dài 7 - 18 cm, cụm hoa mọc ở ngọn thànhchùy ngắn mang nhiều tán, mỗi tán có 15 - 20 hoa nhỏ, lá bắc rộng, sớm rụng.Đài hoa hình chén, gồm 5 lá đài Hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, có 5cánh hình trứng thuôn dài 2 - 3 mm, có 5 nhị, chỉ nhị ngắn và mảnh, dài khoảng1,5 mm, bao phấn kéo dài, bầu hạ, 2 ô, có rìa trắng nhạt (Đỗ Tất Lợi, 2003)

 Quả

Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài 4 - 5 mm, rộng 3 mm vàdày 1,5 - 2 mm, có vòi tồn tại Hạt hình thận và hình khối 3 cạnh màu trắng,kích thước 1 - 3 mm, vỏ hạt lồi lõm Cây ra hoa, quả vào tháng 4 đến tháng 7

(Từ điển bách khoa dược học, 1999).

 Rễ

Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5

cm, đầu trên to, phía dưới thuôn nhỏ Mặt ngoài màu trắng xám, có nhiếu nếpnhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ cònsót lại Thường hợp thành một bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻlởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỗ chiếm 2/3 bán kính, các tia ruột từ

giữa tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt (Từ điển bách khoa dược học, 1999).

Trong tự nhiên, dễ có sự nhầm lẫn giữa các cây cùng tên Đinh lăngnhưng không được dùng làm thuốc như:

+ Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Baill.): Lá thường chỉ có 3

lá chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù

+ Đinh lăng lá to hay Đinh lăng lá ráng (Polyscias ilicifolia (Merr.)

Baill.): Lá kép, có 11 - 13 lá chét, lá chét hình mác có răng cưa to và sâu

+ Đinh lăng trổ hay Đinh lăng viền bạc (Polyscias guilfoylei Baill.): Lá

kép có 7 lá chét, lá chét thường có viền trắng Loại này lại có 2 thứ là:

- Polyscias guilfoylei Baill var laciniata Baill.

- Polyscias guilfoylei Baill var victoriae Baill.

1.4 Thành phần hóa học

Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6,

C, 20 axit amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiềunguyên tố vi lượng: K, Mn, Ca, Mg, Fe, Lo, Zw và 21,10 % đường Trong lácòn có saponin tripterpen (1,65 %), một genin đã xác định được là axitoleanolic (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

Từ lá Đinh lăng, trung tâm sâm và dược liệu TP.Hồ Chí Minh thuộcViện Dược liệu đã phân lập được năm hợp chất polyacetylen là panaxynol,panaxydol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol, heptadeca - 1,8 (E)

- dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on và heptadeca - 1,8 (Z) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10

on Hai hợp chất sau chỉ có trong lá Đinh lăng mà chưa thấy có trong các câykhác thuộc chi Panax và họ Araliaceae, điều đó nói lên sự độc đáo về mặt hóahọc của Đinh lăng Trong rễ Đinh lăng cũng tìm thấy năm hợp chấtpolyacetylen nhưng chỉ có panaxydol, panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien -4,6 diyn - 3,10 diol là trùng hợp với các chất trong lá Ba chất này có tác dụngkháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

Hai hợp chất chính và quan trọng trong cây Đinh lăng là polyacetylen vàsaponin tripterpen Trong đó, hợp chất polyactylen tác chiết được có tính khángkhuẩn rất mạnh và kháng một số dạng ung thư, còn hợp chất saponin tripterpen

có tác dụng chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa rất tốt Đồng thời,hai hợp chất panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trongcây Đinh lăng cũng là hai hợp chất chủ yếu trong cây Nhân sâm, điều này chothấy khả năng sử dụng Đinh lăng thay thế Nhân sâm làm thuốc chữa bệnh

(Trần Công Luận và cs, Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000).

1.5 Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới

1.5.1 Trên thế giới

Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ đảo Polynésie ở Thái Bình Dương.Hiện nay, cây được trồng rộng rãi ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào,Việt Nam, Trung Quốc (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

Tại Ấn Độ, theo Naikarai K.M., Đinh lăng được dùng làm thuốc săn da

và trị sốt Tại Trung Quốc, Đinh lăng được sử dụng để tăng cường sức khỏe,chữa chứng mất ngủ, chữa ho, dị ứng… Ở Campuchia, người ta còn dùng láphối hợp với các loại thuốc khác làm bột hạ nhiệt và cũng dùng làm thuốcgiảm đau

1.5.2 Ở Việt Nam

Đinh lăng đã xuất hiện từ rất lâu trong nhân dân và được trồng khá phổbiến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện… để làm cảnh, làm thuốc

và rau gia vị (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

Trong y học cổ truyền, Đinh lăng được sử dụng nhiều trong điều trị cáccăn bệnh như ho ra máu, dị ứng, mẩn ngứa, làm lành vết thương, lợi tiểu, kiết

lị nặng, tăng sức dẻo dai của cơ thể… Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặctrải giường cho trẻ em nằm phòng bệnh kinh giật Phụ nữ sau khi sinh uốngnước sắc lá Đinh lăng khô, thấy cơ thể nhẹ nhõm khỏe mạnh, có nhiều sữa, látươi 50 - 100g băm nhỏ cùng với bong bóng lợn, trộn với gạo nếp nấu cháo ăncũng lợi sữa Cả thân, rễ và lá Đinh lăng đều có thể sử dụng nhưng rễ tốt hơnthân và lá (Võ Văn Chi, 2004), (Lê Trần Đức, 1997)

Hiện nay, để thuận tiện hơn cho việc sử dụng đinh lăng làm thuốc, Công

ty cổ phần Dược phẩm Traphaco đã sản xuất cao đặc Đinh lăng dưới dạngthuốc bổ, viên nén hoạt huyết dưỡng não Ngoài ra, còn có một số chế phẩm từĐinh lăng hiện dùng như tinh sâm PANA (Viện Y học Quân sự), rượu thuốcngọt, viên ngậm DINLAN (Trung tâm Sâm Việt Nam), trà Đinh lăng

1.6 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.6.1 Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã

đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồmnhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào phân hóa đều mang cácthông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và

là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (NguyễnĐức Thành, 2000)

Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tếbào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thànhmột cá thể hoàn chỉnh Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy mô tế bào đã phân lập,

người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng” Ông cũng đãtiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium,Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).

Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lạithực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoàthảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinhtrưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinhtrưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại,mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bàothực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môitrường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men.Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng cácvitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J H., Roberts L W, 1999)

Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinhtrưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài Năm 1941, Van Overbeek vàcộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi

và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J H., Roberts L W, 1999) Cũng trong thờigian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA,2,4-D đã được tổng hợp Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D vàNAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật

mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005)

Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vàomôi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá Ông nhận thấy chế phẩm này cótác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt Một năm sau, Skoog vàcộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine vàđặt tên là kinetin Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác

dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung

là nhóm cytokinin Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên làzeatin có trong mầm ngô Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phânchia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt

đã phơi khô (Dodd J H., Roberts L W, 1999)

Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được cácprotocorm (mô sẹo) từ địa lan Khi để trong các điều kiện nhất định, cácprotocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh Cùngnăm đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bàotrần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzymxenlulaza Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túiphấn của cây cà độc dược (Datura inoxia) Việc tạo cây đơn bội thành công ởnhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rấtlớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2009)

Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọngcủa kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata vàTakebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo đượcxenlulozo Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplastcủa cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai

xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009)

1.6.2 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên

liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phùhợp được nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và môi trườngthích hợp để tạo thành mô hay cây hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009)

Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên cóthể tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không

phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của câyban đầu (Nguyễn Ngọc Dung, 1998), (Ngô Ứng Long, 1985).

1.6.3 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy

Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triểnmạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể nói đây là công cụ cần thiếttrong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học

Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus,nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần con người đã thúc đẩy thựcvật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Điều này sẽgóp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của

cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất với quy môlớn (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006), (Vũ Văn Vụ và cs, 2008)

Ngoài ra, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản đượcnhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài sinhvật sinh dưỡng Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ranhững con lai về mặt di truyền mà phương pháp nhân giống cổ điện không thựchiện được Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứcấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sảnxuất thực vật ở ngoài tự nhiên “Mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôicấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận cáchợp chấp trên quy mô công nghiệp” (Quách Thị Liên, 2004)

Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro dễ sản

xuất các hợp chất thứ cấp:

Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo màkhông phụ thuộc vào thời tiết và địa lý Không cẩn thiết để vận chuyển và bảoquản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu quả sản phẩm bằng cách loại bỏnhững trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của

nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quátrình vận chuyển và bảo quản.

Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mô dịchhuyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006)

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung các kỹ thuật nhân giống

vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng một kỹthuật tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực

kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997)

Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là

mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơchế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý sinh dưỡng ởcác tế bào thực vật và nhiều đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và cs, 2008)

1.6.4 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hànhnuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng Haberlandt chorằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để pháttriển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bàođều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó cónghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiếtcủa một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó

có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơthể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềmnăng tổng hợp những kiểu protein – enzym giống hệt nhau và nếu được nuôitrong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưngcho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường Khả năng đó của tế bào được gọi

là tính toàn năng của tế bào thực vật” (Nguyễn Đức Thành, 2002)

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở líluận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toànchứng minh được khả năng tái tạo của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một

tế bào riêng rẽ (Nguyễn Đức Thành, 2002)

1.6.5 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Theo (PGS.TS Nguyễn Quang Thạch, 2015): Cơ thể thực vật trưởngthành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khácnhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên(tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tếbào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa)

Sau đó từ tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các

tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể

Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt.Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năngchuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trongtrường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tếbào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng táisinh thành cây hoàn chỉnh Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hóa tếbào,ngược lại với phân hóa tế bào Sự phân hóa và phản phân hóa được biểuthị bằng biểu đồ:

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất làkết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào

thực vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thựcvật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.Trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2002).

1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.7.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân

giống in vitro Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết

Đối với Đinh lăng, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có

thể là chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, hoặc đoạn thân non Các vật liệu này cần

được đảm bảo vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in vitro Phương pháp vô

trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học Đối với

các thí nghiệm nuôi cấy Đinh lăng in vitro, tôi sử dụng đỉnh sinh trưởng đã qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro.

1.7.2 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và

mô trong quá trình nuôi cấy in vitro Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là

ba điều kiện có vai trò quan trọng nhất (Nguyễn Đức Thành, 2002)

Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào vàcác quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổnđịnh ở 25 - 280C, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin (Vũ Văn

Vụ và cs, 2009)

Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phátsinh hình thái mẫu nuôi cấy Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thờigian chiếu sáng, cường độ ánh sáng khác nhau Thời gian chiếu sáng với đa sốcác loài cây thích hợp là 12 - 18h/ngày Cường độ ánh sáng thích hợp chonuôi cấy mô là 1000 - 2500 lux (Vũ Văn Vụ và cs, 2009)

Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là 100%

1.7.3 Thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô tế bào có thành phần thay đổi tùy theo loàithực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy Đối với cùng một loại mô,

cơ quan nhưng mực đích nuôi cấy mô không giống nhau, môi trường sử dụngcũng khác nhau khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạnsinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009)

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiếtcho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thànhcông hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào thực vật Mỗi một loại vật liệu khácnhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiêncứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứumột loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấythục vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác được sử dụng chomục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổbiến như MS, WP Ví dụ môi trường MS ( Murashige & Skoog, 1962) là môitrường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môitrường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Hay môi trườngGramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sửdụng trong tách và nuôi tế bào trần

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưngđều gồm một số thành phần cơ bản sau (Lê Trần Bình, 1997):

- Các muối khoáng đa lượng vi lượng

- Nguồn cacbon

- Các vitamin và aminoacid

- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

- Các chất điều hòa sinh trưởng

1.7.3.1 Nguồn cacbon

Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu vì vậy phải

bổ sung thêm nguồn cacbon để mẫu cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơgiúp tế bào phân chia Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường saccharose

và glucose với liều lượng 20-30 g/l dung dịch (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

1.7.3.2 Nhóm nguyên tố vi lượng

Là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn300mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh làkhông thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co Cácnguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme (Đỗ VănVịnh, 2007)

Bảng 1.1 Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong

nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.7.3.3 Nhóm nguyên tố đa lượng

Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K,

Mg, Ca, Na, S, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Các nguyên tố này cóchức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật vớimôi trường và xây dựng nên thành tế bào, môi trường nhiều nito thích hợpcho việc hình thành chồi, với môi trường nhiều kali sẽ giúp cho quá trình traođổi chất diễn ra mạnh mẽ (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

1.7.3.4 Vitamin

Do các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp đượchầu hết các loại vitamin nhưng không đủ về số lượng Do đó trong quá trình

nuôi cấy in vitro, các vitamin cần được bổ sung vào môi trường với nộng độ

thích hợp Đặc biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 Trong

đó, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật(Nguyễn Đức Thành, 2002)

Bảng 1.2 Bốn loại vitamin thường dùng

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến

1000 lần dung dịch làm việc Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩnnhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiệnlạnh dưới 0OC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng (Đỗ Văn Vịnh, 2007)

1.7.3.5 Các chất phụ gia hữu cơ

Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sựsinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan khác như: Nước dừa, khoai tây, chuối,dịch chiết nấm men Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu

cơ, đường, Myo – inositol và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit củaCytokinin Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thànhphần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cựcđến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009)

1.7.3.6 Các chất làm đông cứng môi trường

Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại đểtạo thành giá thể cho mẫu phát triển như agar: Dây là một loại polysaccharidlàm từ rong biển và có khả năng ngậm nước cao, ở 800C Agar ngậm nước vàtồn tại ở trạng thái lỏng, còn ở dưới 400C nó tồn tại ở trạng thái rắn Trongmôi trường có tính axit cao, khả năng đông đặc của agar giảm Nồng độthường sử dụng 5-8g/l (Trần Thị Lệ và cs, 2008).

1.7.3.7 Các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ởthực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chấtnày được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chứcnăng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo

và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởngnhất định Trong nuôi cáy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chấtđiều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin

Nhóm Auxin

Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lýhọc thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hormon thựcvật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan,kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào.Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó

Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit(2,4D), α - naphtylaxetic (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễgây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào thường được

sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con Tuy nhiên, tầmquan trọng của bất cứ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giáthông qua số các công trình nghiên cứu về chúng

Nhóm Cytokinin

Việc phát hiện ra xytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cây mô tế bàothực vật Năm 1955 Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cáthu một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽtrong nuôi cấy mô gọi là kinetin (6 - furfuryl - aminopurin - C10H 9N 5O).Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách được xytokinin tự nhiên ở dạngkết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin Sau đó người

ta đã phát hiện xytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và làmột nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây

Trong các loại xytokinin thì 3 loại sau đây là phổ biến nhất: Kinetin (6 furfuryl - aminopurin), 6 - benzin - aminopurin và Hiện nay người ta đã pháthiện ra nhiều loại xytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây.Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng xytokinin được hình thành chủ yếu trong

-hệ thống rễ Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng cókhả năng tổng hợp xytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh

Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại xytokinin có nhiều ở trongnước dừa Xytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, cóthể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc Xytokinin có thể ở dạng tự do vàdạng liên kết tương tự như các phytohormone khác Ở trong cây chúng bị phângiải dưới tác dụng của enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê Các xytokinintổng hợp được sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin

Vai trò đặc trưng của xytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh

mẽ Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào,nguyên nhân là do xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic

và protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sựhình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi

Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóarễ) và xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát

sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn Nếu tỷ

lệ auxin cao hơn xytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ xytokinin cao hơnauxin thì kích thích ra chồi

Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ xytokinin trongmôi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi Ở trong cây rễ là cơ quan tổng hợpxytokinin chủ yếu nên rễ phát triển mạnh thì hình thành nhiều xytokinin và kíchthích chồi trên mặt đất cũng hình thành nhiều Xytokinin kìm hãm quá trình giàhóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn Nếu như lá tách rời được xử lýxytokinin thì duy trì được hàm lượng protein và chlorophin trong thời gian lâuhơn và lá tồn tại màu xanh lâu hơn Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo dài tuổi thọcủa các cơ quan có thể chứng minh khi cành dâm ra rễ thì rễ tổng hợp xytokininnội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn Hàm lượng xytokinin nhiều làmcho lá xanh lâu do nó tăng quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng về nuôi lá Trêncây nguyên vẹn khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh,nếu bộ rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già Xytokinin trong một

số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và của củ Vì vậy nếu xử lýxytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt củ mầm

Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đếnkích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm này gồm: 6 - benzylaminopurine (BAP), 6 - Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin

Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quanđến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hóa cơ quan của những tế bào khôngphân chia Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã sử dụng kết hợp BAP

và NAA để tạo chồi từ mắt ngủ hay đỉnh sinh trưởng Rachael keolanui đã sửdụng BAP để tạo chồi khoai môn từ các mắt ngầm và đỉnh sinh trưởng

Nhóm Ethylen

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển củacây nhưng gần đây nó mới được coi là một hormon thực vật Ethylen thườngđược sử dụng để làm chính quả như ở chuối, hồng, hồng xiêm làm ra hoa

đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chuatrong điều kiện nồng độ ethylen cáo xẽ kéo dài khoảng ra rễ ở thân cây

Nhóm Axit absixic

Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởngđến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số câyngăn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein

Nhóm Gibberellin

Giberelin được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhàkhoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trongcác mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin có tácdụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóngcây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy.GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Trần Thị Lệ và cs, 2008)

1.7.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo (PGS.TS Ngô Xuân Bình và cs, 2003): Trong nuôi cấy mô, tếbào gồm 5 giao đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in

vitro Mục đích của giai đoạn này phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng

để đưa vào nuôi cấy

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễmthấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thờigian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là:Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, thân đoạn, mảnh, lá, rễ

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy