đề tài bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài

Mục lục I. Sơ lược về bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................................................... 3 II. Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ........................................... 3 III. Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro trong thời gian dài ............................................ 3 III.1. Sự da dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh ........................ 4 III.2. Các bước tiến hành ........................................................................................................ 4 III.2.1. Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng ........................................... 5 III.2.2. Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh ............................................................. 5 III.2.3. Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp ............................................................................. 6 III.2.4. Lưu trữ trong nito lỏng (1960C) ............................................................................. 7 III.2.5. Giải đông ................................................................................................................. 8 III.2.6. Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh .................................................................... 9 III.2.7. Xác định khả năng sống sót .................................................................................... 9 III.2.8. Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh .................................................................................................................................... 9 III.3. Một số phương pháp được sử dụng trong bảo quản đông lạnh...................................... 9 III.4. Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) .............................................................. 14 III.5. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự hồi phục của tế bào đông lạnh .................................... 15 III.5.1. Độ tuổi, đặc tính và mật độ tế bào ........................................................................ 15 III.5.2. Các tác nhân bảo quản lạnh ................................................................................. 16 III.5.3. Tốc độ làm lạnh và phương pháp giải đông ......................................................... 16 III.5.4. Nhiệt độ lưu trữ ..................................................................................................... 16 IV. Ưu và nhược điểm của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................... 16 IV.1. Ưu điểm ....................................................................................................................... 16 IV.2. Nhược điểm ................................................................................................................. 17 V. Khả năng ứng dụng của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................... 17 VI. Kết luận .............................................................................................................................. 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 19 Tiếng Việt: ............................................................................................................................ 19 Tiếng Anh: ............................................................................................................................ 19 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 20 Các chữ viết tắt: .................................................................................................................... 20 So sánh các phương pháp bảo tồn in vitro ............................................................................ 20 Khả năng làm sạch virus (Virus elimination) ....................................................................... 21

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC ĐỀ TÀI: BẢO TỒN NGUỒN GEN IN VITRO TRONG THỜI GIAN DÀI LÂM THỊ TUYẾT Đà lạt, tháng 10 năm 2016 Mục lục I Sơ lược bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài II Ý nghĩa việc bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài III Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro thời gian dài III.1 Sự da dạng cách xử lý đóng băng mô thực vật chịu lạnh III.2 Các bước tiến hành III.2.1 Tạo nguồn mô nuôi cấy huyền phù tế bào vô trùng III.2.2 Bổ sung tác nhân bảo quản đông lạnh III.2.3 Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp III.2.4 Lưu trữ nito lỏng (-1960C) III.2.5 Giải đông III.2.6 Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh III.2.7 Xác định khả sống sót III.2.8 Tái sinh lại tế bào hồi phục tiếp tục nuôi cấy để tạo hoàn chỉnh III.3 Một số phương pháp sử dụng bảo quản đông lạnh III.4 Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) 14 III.5 Các nhân tố ảnh hưởng đến hồi phục tế bào đông lạnh 15 III.5.1 Độ tuổi, đặc tính mật độ tế bào 15 III.5.2 Các tác nhân bảo quản lạnh 16 III.5.3 Tốc độ làm lạnh phương pháp giải đông 16 III.5.4 Nhiệt độ lưu trữ 16 IV Ưu nhược điểm việc bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài 16 IV.1 Ưu điểm 16 IV.2 Nhược điểm 17 V Khả ứng dụng việc bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài 17 VI Kết luận 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 Tiếng Việt: 19 Tiếng Anh: 19 PHỤ LỤC 20 Các chữ viết tắt: 20 So sánh phương pháp bảo tồn in vitro 20 Khả làm virus (Virus elimination) 21 I Sơ lược bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài Ngân hàng hạt Bảo tồn Tại chỗ Ngân hàng DNA Chuyển chỗ Ngân hàng gen đồng ruộng Trang trại Bảo tồn in vitro Bảo tồn ngắn hạn Bảo tồn trung hạn Bảo tồn dài hạn Trong đó: - Bảo tồn ngắn hạn: nuôi cấy in vitro điều kiện sinh trưởng bình thường - Bảo tồn trung hạn: nuôi cấy in vitro điều kiện giảm cường độ ánh sáng, nhiệt độ, thêm chất ức chế sinh trưởng,… - Bảo tồn dài hạn: bảo tồn nito lỏng (-1960C), sở ngừng tất trình trao đổi chất phân chia tế bào II Ý nghĩa việc bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài - Duy trì phong phú đa dạng di truyền - Là nguồn vật liệu cho chọn giống trồng, phục vụ khai thác, nghiên cứu sử dụng cho tương lai - Bổ sung và thay thế để khắ c phu ̣c những ̣n chế của những phương pháp khác - Có thể trì tính bệnh trước bảo tồn, bảo tồn với số lượng lớn diện tích nhỏ Điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động III Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro thời gian dài Sử dụng phương pháp ngừng sinh trưởng tạm thời (hay bảo quản đông lạnh nito lỏng) - Đặc điểm: Mẫu nuôi cấy bảo quản nito lỏng thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng - Thời gian bảo quản: 20 – 30 năm lâu - Đối tượng: Mẫu đem bảo quản thường dạng phôi, mô sẹo, mô nuôi cấy (thường mô phân sinh),… Trước đưa vào bảo quản mẫu cần xử lý để tránh tạo thành tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu III.1 Sự da dạng cách xử lý đóng băng mô thực vật chịu lạnh Hình III.1 Sự đa dạng cách xử lý đóng băng mô thực vật chịu lạnh Trong đó: A: Làm đông ngoại bào mô vỏ Sambucus racemosa (cơm cháy) B: Làm đông quan nụ hoa Cornus officinalis (1) (sơn thù du), Rhododendron Dauricum (2) (đỗ quyên) nụ hoa thông rụng (3), PL = nguyên thủy, fl = Hoa con, scale = vảy C: Siêu lạnh sâu nhu mô xylem ray (R) cành táo III.2 Các bước tiến hành - Tạo nguồn mô nuôi cấy huyền phù tế bào vô trùng - Bổ sung tác nhân bảo quản đông lạnh (cryoprotectant) - Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp - Lưu trữ tế bào nito lỏng (-1960C) - Giải đông làm ấm nhanh tế bào - Loại tác nhân bảo quản đông lạnh cách rửa nhiều lần - Xác định khả sống sót - Tái sinh lại tế bào hồi phục tiếp tục nuôi cấy để tạo thành hoàn chỉnh III.2.1 Tạo nguồn mô nuôi cấy huyền phù tế bào vô trùng - Khử trùng bề mặt: loại chất khử trùng NaOCl, HgCl, … sau rửa nhiều lần nước vô trùng trước cắt mẫu - Cắt mẫu: cắt bỏ phần bị chất khử trùng làm cho hoại tử Các mẫu thường nuôi cấy chồi nách, non, đoạn thân non,…được cấy vào môi trường phù hợp - Tiến hành nuôi cấy vô trùng môi trường có Agar, có bổ sung chất ĐHST thích hợp để nhân nhanh số lượng mẫu cấy gồm sẹo, phôi mô phân sinh - Chuyển sang nuôi cấy lỏng lắc môi trường có chứa nồng độ auxin Cytokinin thấp Tùy theo kết cấu mô sẹo, huyền phù tế bào tạo vòng – tuần Ta cấy chuyền định kì để nhân số lượng huyền phù - Các mô nuôi cấy huyền phù tế bào tạo từ mẫu cấy non tăng trưởng mạnh III.2.2 Bổ sung tác nhân bảo quản đông lạnh - Các bình có chứa mẫu cấy chuyển vào bể ủ nước đá, phần huyền phù bên lắng phần môi trường thừa bên hút pipet - Mỗi ml mẫu có chứa tế bào nuôi cấy mật độ cao phân phối vào ống nhựa vô trùng loại bỏ phần môi trường sót lại Bổ sung tác nhân bảo quản đông lạnh phù hợp (thường DMSO – 10%) bổ sung từ từ 1ml vào ống chia làm lần, lần 0,25 ml thời gian phút - Để yên khoảng 20 – 30 phút (trong bể nước đá) Sau bổ sung tác nhân bảo quản lạnh, ống nhựa đặt nhiệt độ cực thấp đông lạnh - Trong tác nhân bảo quản đông lạnh DMSO sử dụng rộng rãi có tính chất bảo quản lạnh tốt Tuy nhiên phải sử dụng tác nhân bảo quản nồng độ tối ưu, tránh dùng nồng độ cao, bổ sung đột ngột lượng lớn gây tượng co nguyên sinh chất tế bào - Yêu cầu chất bảo quản lạnh: Có khối lượng phân tử thấp, trộn lẫn dễ dàng với dung môi, không độc nồng độ thấp, dễ dàng rửa khỏi tế bào hết thấm nhanh vào tế bào - Cơ chế hoạt động tác nhân bảo quản (chỉ giả thiết): + Chúng làm giảm nồng độ muối nội bào giảm hình thành tinh thể đá + Sự khử nước tế bào mà theo sau tổn thương đông lạnh hình thành liên kết SS cảm ứng tác nhân bảo quản ngăn chặn ức chế hình thành liên kết + Các tác nhân bảo quản tương tác trực tiếp gián tiếp với màng tế bào để cố định cấu trúc bậc phức hợp nước – lipid – protein Tại màng tế bào, đông lạnh làm tổn thương tính toàn vẹn sinh học, nhiên hoạt động sinh hóa tác nhân bảo quản màng tế bào chưa rõ - Các tác nhân bảo quản nồng độ cao có tác hại: Ở nồng độ cao làm giảm hô hấp, ức chế RNA ức chế tổng hợp protein tế bào mô thực vật bị cô lập, phải sử dụng nồng độ tối ưu (thường dùng – 10%) - Ngoài ra, nên sử dụng kết hợp hay nhiều tác nhân bảo quản hiệu cao (ví dụ trường hợp khoai sọ bên dưới) - Các tác nhân bảo quản thường sử dụng: + Dimethyl Sulfoxide (DMSO) + Dimethyl Sulfone (DMSO2) + Hydroxy-ethyl-starch (HES) + Polyvinyl Pyrolidone (PVP) + Polyethylene Oxide (PEO) + Propylene Glycol + Ethylene Glycol + Glycerol III.2.3 Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp - Trải qua bước tiền đông lạnh: có liên quan đến làm lạnh theo bước, làm lạnh đến nhiệt độ đóng băng ổn định tế bào (thường -300C đến -400C tùy đối tượng), sau đưa đến -1960C - Điều chỉnh tốc độ làm lạnh chậm: 1- 50C/phút tùy đối tượng Có thể kết hợp phương pháp: Ví dụ, huyền phù tế bào Sung dâu (Acer psedoplatanus) tiền đông lạnh (theo khoảng thời gian phút -150C, -230C, -300C, -400C, -500C -700C đưa xuống -1960C có tỉ lệ sống khoảng 30% + Bước xử lý sử dụng loại máy đông lạnh: Biologicail Freezer-6, Biogical Dry Freezer DPF 30, Mini – Freezer R 202,… Bước tiền đông lạnh có hiệu việc ngăn chặn giảm hình thành tinh thể nước đá nội bào Sẽ có nhiệt độ xác định mà hầu hết lượng nước đông đá tế bào bị loại khỏi tế bào nhờ đông lạnh ngoại bào, tế bào mô trạng thái không bị tổn thương, chí tiếp xúc với nhiệt độ thấp Nhiệt độ dao động khoảng -300C đến -400C thay đổi theo mức độ chịu lạnh thực vật Ở nhiệt độ này, lượng nước dễ đông lạnh loại khỏi tế bào (khử nước phần) nhờ hình thành nước đá liên bào Hình III.2.3 Máy đông lạnh Biogical Dry Freezer DPF 30 (có thể đông lạnh đến -1900C III.2.4 Lưu trữ nito lỏng (-1960C) Mẫu cấy lưu trữ nito lỏng với nhiều độ dài thời gian khác nhau, lấy giải đông lúc Thời gian lưu trữ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: phương thức xử lý mẫu, loại mẫu, phương pháp làm lạnh,…và cần kiểm tra định kì Hình III.2.4a số dụng cụ chứa mẫu để lưu trữ nito lỏng Hình III.2.4b Cấc mẫu in vitro lưu trữ nito lỏng III.2.5 Giải đông Nên làm ấm nhanh mẫu nuôi cấy bể ủ ấm 350C – 400C Ta không nên làm ấm làm tái tạo tinh thể nước đá làm ấm nhanh làm tinh thể nước đá tan trước chúng tái tạo tinh thể phát triển Các nghiên cứu cho việc tế bào làm lạnh nhanh bị chết phát triển tinh thể nước đá nội bào hình thành tinh thể ban đầu Sự tổn thương tế bào áp lực tạo tinh thể nước đá gây làm đứt gãy màng plasma bào quan Tốc độ làm ấm ảnh hưởng đáng kể lên LT50 tế bào Với tế bào động vật làm ấm chậm tốt tế bào thực vật ngược lại, vách tế bào dày, nhiên tùy đối tượng Vd: thông làm lạnh đến -450C sống sót giải đông tốc độ 50C/giờ chết tốc độ 100C/giờ Ngược lại, tế bào vỏ dâu tằm làm ấm 400C, chết làm ấm dần cách đặt không khí III.2.6 Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh Mẫu nuôi cấy sau giải đông mang li tâm, tác nhân bảo quản hút pipet tế bào rửa lần với môi trường phù hợp để loại bỏ tác nhân bảo quản tồn đọng mẫu Nếu không loại bỏ tác nhân gây độc kìm hãm sinh trưởng mẫu III.2.7 Xác định khả sống sót Gồm phương pháp: - Nhuộm diacetate huỳnh quang: dựa tượng tế bào sống nhuộm với diacetate huỳnh quang phát tia huỳnh quang ánh sáng cực tím (UV), tế bào chết không - Dùng triphenyl tetrazolium chlorur: phương pháp này, lượng tế bào sống sót tính lượng formazan hình thành giảm lượng triphenyl tetrazolium chlorur (TTC) tạo màu hồng - Đo tăng trưởng: Bằng cách sử dụng thông số khác (chỉ số nguyên phân, số lượng tế bào, thể tích nuôi cấy tế bào, trọng lượng khô tươi,…), tăng trưởng mẫu nuôi cấy đông lạnh so sánh với đối chứng III.2.8 Tái sinh lại tế bào hồi phục tiếp tục nuôi cấy để tạo hoàn chỉnh Các mẫu nuôi cấy lỏng lắc trải trực tiếp lên môi trường Agar Điều chỉnh điều kiện dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy với chất ĐHST thích hợp) vật lý (cường độ ánh sáng, nhiệt độ, thời gian chiếu sáng,…) phù hợp để tái sinh tạo hoàn chỉnh Không phải tất đỉnh chồi sống tái sinh chồi, bổ sung Pluronic F – 68 với nồng độ thấp (0,0005%) cho tỉ lệ tái sinh chồi cao Hoặc chiếu sáng cường độ thấp thời gian đầu (6 µmol) cường độ cao thời gian tiếp (40 µmol) tăng tỉ lệ tái sinh III.3 Một số phương pháp sử dụng bảo quản đông lạnh - Phương pháp lạnh chậm truyền thống (Two – step Cooling) (0,50C – 20C/phút): Các mẫu cấy xử lý với có mặt dung dịch bảo vệ đông lạnh, thường dùng DMSO nồng độ trung bình – 15% glycerol, sucrose…, Sau chúng làm lạnh từ từ với tốc độ 0,2 – 0,3oC/phút -35oC, ngâm nito lỏng Khả tái sinh dao động từ – 85% tùy loài Nhìn chung, phương pháp bảo quản phức tạp tốn thời gian, cần thiết bị đặc biệt Sau hạ nhiệt độ xuống -300C đến -40oC, dung dịch tế bào đông kết dạng kính nhúng nito lỏng Phương pháp ngày sử dụng bảo tồn mô không tổ chức callus dung dịch tế bào huyền phù - Tạo hạt nhân tạo/khử nước (Encapsulatin/Dehydration): Các mô thực vật gói vỏ alginate (có chứa muối khoáng, chất hữu cơ) Những hạt sau xử lý đường sucrose nồng độ cao, giảm độ ẩm xuống 20 – 30% (bằng dòng không khí chất hút ẩm gel silica) làm đông lạnh nhanh nito lỏng Thường ta giảm độ ẩm nhờ loại bỏ phần nước tự tế bào, phần nước liên kết loại bỏ Các chất dinh dưỡng bao quanh mô kích thích mô tái sinh sau làm tan đóng băng có lợi cho sử dụng - Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification): Đây phương pháp sử dụng phổ biến Quá trình thủy tinh hóa mô tả đông đặc chất lỏng không kết tinh Khi dung dịch tế bào trở thành dạng thủy tinh, tế bào “trạng thái thủy tinh” vô định hình Chúng thiếu cấu trúc tổ chức có đặc tính học vật lý chất rắn Kĩ thuật xử lý dung dịch đông lạnh đậm đặc lên mô thực vật (15 phút – 2giờ), sau nhúng nito lỏng mà bước khử nước đông lạnh cảm ứng (tế bào mô phân sinh khử nước theo cách thẩm thấu dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao) Khác với phương pháp tiền đông lạnh truyền thống (thủy tinh hóa phần, có cytosol thủy tinh hóa) Quá trình thủy tinh hóa cần dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao, khử nước đầy đủ cytosol mà không gây tổn thương chúng chuyển thành dạng thủy tinh bền vững đưa vào nito lỏng Kết dung dịch đông lạnh dung dịch tế bào đông kết + Dung dịch đông lạnh gồm hỗn hợp chất bảo vệ đông lạnh thấm không thấm Chất thông thường gồm PVS2 (độc tính thấp): 30% glycol, 15% DMSO 0,4M sucrose, không thấm vào cytosol suốt trình khử nước Dung dịch dễ dàng hạ nhiệt độ xuống -1000C theo tốc độ làm lạnh thực tế cuối hóa rắn -1150C + Để cảm ứng khả chịu đựng khử nước, chồi đỉnh cắt từ in vitro cấy vào môi trường nồng độ sucrose cao (0.3 – 0.6M) 16 sau xử lý với hỗn hợp glycerol 2M bổ sung sucrose 0.4M (dung dịch LD) 20 phút trước khử nước với PVS2 Trong phương pháp này, ảnh hưởng gây tổn thương trình khử nước giảm loại bỏ 10 cách tối ưu hóa thời gian tiếp xúc với PVS2 cách khử nước đỉnh chồi dần bước: dung dịch LD 250C, sau dung dịch PVS2 00C + Vấn đề chủ yếu để lưu trữ lạnh thành công phương pháp cảm ứng chịu đựng mẫu khử nước với dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao Trong phương pháp thủy tinh hóa, tế bào mô phân sinh cắt thường nuôi cấy trước môi trường giàu sucrose sobitol ngày để cảm ứng khả chịu đựng khử nước Nồng độ đường sobitol tích lũy cao suốt trình nuôi cấy trước bảo quản cho quan trọng việc nâng cao khả sống sót tế bào mô phân sinh trữ lạnh Sự tích lũy đường tăng độ ổn định màng điều kiện nước nghiêm trọng - Sarkar Naik (1998) sử dụng phương pháp thủy tinh hóa cho giống S Tuberosum (cây nguyệt hạ dương) ‘Kufri Basha’, ‘Kufri Chandramukhi’, ‘Kufri Lalima’, ‘Kufri Lauvkar’ ‘Kufri Sindhuri’ Trong phương pháp thủy tinh hóa này, đỉnh chồi có kích thước 0,5 – 0,7 mm lần phân lập từ 30 ngày tuổi tiền nuôi cấy ngày cầu giấy lọc môi trường ½ MS có bổ sung 8,7 mM GA3 kết hợp nồng độ khác sucrose (0.3, 0.5 0.7M) mannitol (0, 0.2 0.4M) 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng khoảng 40 µmol m-2s-1, 240C Các đỉnh chồi sau thả vào 20% PVS2 (30 phút, 240C), sau 60% PVS2 (15 phút, ngâm nước đá) 100% PVS2 đông lạnh (5 phút) trực tiếp 100% PVS2 (5 phút) - Năm đỉnh chồi chuyển vào cryovial đầy với 0,7 ml PVS2 cuối cho vào nito lỏng Sau làm ấm nhanh 350C cốc nước phút, cryovial đổ vào môi trường pha loãng (MS với 1,2M sucrose) ủ 30 phút Sau đỉnh chồi nuôi cấy môi trường tái sinh (MS với 0.2M sucrose, 5.8 mM GA3, 1.0 mM BAP g/l agar Nobel (HiMedia, Ấn Độ) nuôi cấy ánh sáng khuếch tán (khoảng µmol m-2s-1, 16h chiếu sáng) 240C tuần Sau đó, đỉnh chồi chuyển vào môi trường chuẩn (MS với 0.09M sucrose, 2.9 mM GA3 g/l agar) điều kiện cường độ ánh sáng khoảng 40 µmol m-2s-1, 240C, 16 chiếu sáng - Để tái sinh thành công, tiền nuôi cấy với kết hợp sucrose mannitol cần thiết, nồng độ mannitol 0.2M bất lợi Các đáp ứng cao quan sát cách áp dụng tiền nuôi cấy với 0.3M sucrose 0.2 M mannitol sau thủy tinh hóa với tỉ lệ tái sinh chồi cao 56% - Phương pháp DMSO giọt – giọt đóng băng (DMSO Droplet Method – Droplet Freezing): Đây phương pháp tối ưu hóa phương pháp làm lạnh cực nhanh Từ “giọt” đề cập đến giọt chất bảo vệ lạnh nhôm, 11 đó, đỉnh chồi đặt để làm lạnh tái làm ấm Cũng giọt agarose với đỉnh chồi môi trường lỏng sử dụng để tái sinh Ý tưởng sáng tạo nhôm bắt nguồn từ Kartha et al (1982), người bảo quản lạnh đỉnh chồi sắn kim loại sử dụng phương pháp làm lạnh bước Schäfer-Menuhr et al (1994) thông qua ý tưởng phương pháp làm mát nhanh cho đỉnh chồi khoai Các kim loại giá đỡ tốt việc chuyển số lượng lớn đỉnh chồi lúc cách nhanh chóng vào khỏi nito lỏng so với việc sử dụng kim tiêm, có đỉnh chồi chuyển thời điểm Hơn nữa, nhôm chất dẫn nhiệt tốt, điều quan trọng việc làm lạnh nhanh làm ấm lại mẫu cấy SchäferMenuhr et al (1994) sử dụng kim loại có kích thước 20 x x 0.03 mm, mà hai vừa vặn cryovial Về tình trạng nước trình làm lạnh, thông tin trạng thái nước (đóng băng thủy tinh) giọt nghiên cứu Tuy nhiên, theo quan sát Benson et al (1992) sử dụng sắn, nhiều khả thủy tinh hóa xảy (Benson et al 2006) - Phương pháp giọt thủy tinh hóa (Droplet Vitrification) - Đây kết hợp yếu tố phương pháp giọt DMSO phương pháp thủy tinh hóa, phương pháp tương đối bảo quản lạnh Trong phương pháp giọt thủy tinh hóa, đỉnh chồi đặt nhôm mỏng suốt trình làm mát, phương pháp giọt DMSO, loại chất bảo quản lạnh chẳng hạn PVS2 sử dụng Việc sử dụng nhôm làm cho việc luân chuyển đỉnh chồi vào khỏi nito lỏng dễ dàng nhanh Điều quan trọng trình sử dụng PVS2, thời gian ủ dài chút gây độc cho đỉnh chồi Sử dụng giọt thủy tinh hóa, kết thành công trình bày Halmagyi et al (2005) ba giống khoai tây (‘Desiree’, ‘Ostara’, ‘sante’) Các nhân lên môi trường MS không chất ĐHST trì mức 240C với cường độ ánh sáng 39,06 µmol m-2s-1 16 chiếu sáng Đỉnh chồi với kích cỡ khác (1 – mm chiều dài) tách kim tiêm từ – tuần tuổi ủ giấy lọc với môi trường MS lỏng bổ sung 0.4 mg/l GA3, 0.5 mg/l zeatin 0.2 mg/l IAA 240C 24 Sau tiền nuôi cấy với nhiều loại đường khác (sucrose, glucose, mannitol sorbitol) thực 240C 24h Sau đỉnh chồi làm nước giọt ml với PVS2 nhôm (0,6 x 1,5 cm) nhiệt độ phòng 10 – 30 phút, trước chuyển vào cryovial làm lạnh sơ sau chuyển vào nito lỏng Làm ấm nhanh chóng thực cách lắc nhôm môi trường lỏng nhiệt độ phòng Để tái sinh đỉnh chồi cấy vào môi trường bán rắn với 12 3,5 g/l agar 240C 20 ngày Sau chồi kéo dài chuyển vào môi trường rắn với g/l agar (Halmagyi et al (2005)) Các tần số tái sinh chồi cao giống khoai tây 55% ‘Desiree’, 51% ‘Ostara’, 46% ‘Sante’ Panta et al (2006) sử dụng giống tiền nuôi cấy 60C môi trường MS với 0,07 M sucrose tuần Sau đỉnh chồi tách (2 – mm) ủ dung dịch MS với M glycerol 0,4 M sucrose 20 phút Các đỉnh chồi chuyển vào PVS2 00C 50 phút, đặt nhôm, đưa vào cryovial thả vào nito lỏng Làm ấm thực nhanh chóng môi trường MS làm giàu với 1,2 M sucrose 20 phút Mẫu cấy sau nuôi môi trường MS với 0,04 mg/l kinetin 0,1 mg/l GA3 0,1 – 0,3 M sucrose, giảm mức độ 0,1 M sucrose ngày Khả tái sinh đỉnh chồi phụ thuộc vào kiểu gen dao động mức 8% S tuberose ‘Wila Yari’ đến 47% ‘Desiree’ (Panta et al 2006; bảng 2) Panta et al (2009a) phân tích hợp chất sinh hóa định, chẳng hạn phospholipid, glycolipid, amin thơm polyamin để tìm liên kết đến khả bảo quản lạnh - Họ nhận thấy kiểu gen kháng sương giá có tỉ lệ tái sinh cao đáng kể sau bảo quản lạnh hàm lượng acid lioleic tương quan tuyệt khả chịu bảo quản lạnh Nó kết luận việc bổ sung putrescine cho môi trường tiền nuôi cấy nâng cao tỉ lệ phục hồi cho kiểu gen tái sinh Trong năm gần đây, số lượng loài bảo quản lạnh thành công cách sử dụng phương thức giọt thủy tinh hóa kết hợp với làm lạnh nhanh làm ấm lại liên tục tăng (Gonzalez-Arnao et al 2008; Halmagyi et al 2005; Kim et al 2006; Leunufna Keller năm 2005; Panta et al 2006; Sakai Engelmann 2007; Sant et al 2008; Senula et al 2007; Yoon et al 2006), phương pháp làm lạnh hai bước sử dụng thường xuyên sau nhiều trường hợp cho mô sẹo dịch huyền phù (Gnanapragasam and Vasil năm 1992; Mikula et al 2005) Lý cho việc sử dụng ngày tăng giọt thủy tinh hóa nằm ứng dụng nhanh chóng dễ dàng mà không cần thiết bị làm mát đắt tiền mà lại cần thiết cho làm mát bước - Các phương pháp khác: tiền xử lý in vitro, tiền xử lý in vitro/khử nước, tạo hạt nhân tạo/thủy tinh hóa… 13 III.4 Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) Hình III.4 Bảo quản đông lạnh khoai sọ phương pháp thủy tinh hóa - Vật liệu: loại mô phân sinh đỉnh: đỉnh hở (O: lá), phần bao bọc (PC: lá) bao bọc hoàn toàn (FC: lá) sơ khởi bên - Phương pháp thủy tinh hóa Chuẩn hóa mẫu (Preconditioning): Chuẩn bị trước tháng với môi trường ½ MS + – 12% sucrose Lựa chọn đỉnh sinh trưởng (Meristem selection): Có loại O, PC FC Tiền xử lý in vitro (Preculture): – đêm, môi trường MS + 0.3 – 0.7 M sucrose Thả vào ống eppendoff (Loading): 20 phút, dung dịch glycerol 2M + sucrose 0.4 M 5: Khử nước (Dehydration): 40 – 60 phút 250C PVS2 Chuẩn thể tích 0.7 ml Giữ nito lỏng (LN storage): Chỉ sử dụng ống eppendoff 0.7 ml, làm lạnh nhanh Giải đông (Thawing): làm tan nhanh chóng, lắc 80 giây nước 400C Lấy khỏi ống (Unloading): 15 phút, môi trường MS lỏng + 1.2 M sucrose 14 10 Đặt giấy thấm (Blotting): – đêm, giấy lọc môi trường MS lỏng với 0.3 M sucrose 11 Phục hồi (Recovery): Trên môi trường tái sinh + 3% sucrose Trong đó, FC thể khả chịu đựng khử nước PVS2, PC O nhạy cảm Nhưng sau giải đông khả tái sinh cao PC, đến O cuối FC (77.6%, 33.5%, 4.6%) Giải thích: với mô FC bao bọc toàn nên phần đỉnh không khử nước chuẩn, mô loại O toàn đỉnh tiếp xúc trực tiếp với PVS2 nên overdehydrate hóa bị hư hỏng trình xử lý mẫu cấy có mô loại PC với phần đỉnh tiếp xúc với tác nhân bên nên coi mẫu đỉnh đông lạnh phù hợp - Làm nước với mục đích làm tăng độ nhớt, làm nước thành công khi: tế bào bị tổn thương tối thiểu, có khả biến đổi thành thủy tinh làm lạnh nito lỏng - Dung dịch thủy tinh hóa (PVS2): 30% glycerol + 15% ethylene glycol + 15% DMSO + 0.4 M sucrose - Tiền xử lý in vitro đường (Sucrose preculture): để tăng khả sống sót sau giải đông - Sucrose môi trường chuẩn hóa mẫu (Sucrose preconditioning): để làm cứng VPTM, thường lạnh cứng – 50C, mô phân sinh khoai môn lạnh cứng 10 – 150C III.5 Các nhân tố ảnh hưởng đến hồi phục tế bào đông lạnh III.5.1 Độ tuổi, đặc tính mật độ tế bào - Các tế bào mô phân sinh: Huyền phù tế bào chuyển định kì tăng trưởng mạnh phase tăng trưởng hàm mũ tốt mẫu nuôi cấy lâu với tế bào lớn có vách dày với tế bào chất Các tế bào có không bào to dễ dàng bị chết tích lũy ngập tràn tinh thể nước đá bên không bào - Lượng nước: Tế bào hay mô chứa lượng nước cao dễ bị tổn thương đông lạnh Các đỉnh chồi thường có khả sống sót cao tế bào đỉnh không bào có vách mỏng, gần giống với tế bào huyền phù tăng trưởng mạnh - Tế bào: dòng tế bào nhỏ có chứa tế bào nhiều tế bào chất có tỉ lệ sống cao Một lượng lớn mô sẹo lưu trữ nito lỏng trở nên xốp chết giải đông, hình thành tinh thể nước đá xuyên mạch làm cho không khí thoát Các cụm tế bào thường có sức sống cao tế bào đơn 15 - Mật độ tế bào: ống có chứa nhiều huyền phù nén đặc thường có tỉ lệ tế bào sống sót cao ống có mật độ thấp - Mức độ chịu lạnh: tùy vào loại mẫu III.5.2 Các tác nhân bảo quản lạnh (đã giải thích trên) III.5.3 Tốc độ làm lạnh phương pháp giải đông - Tốc độ làm lạnh: trình làm lạnh không gây ảnh hưởng đến tế bào Vd, trực tiếp hạ nhiệt độ ảnh hưởng xấu đến đường sinh hóa vật lí nội bào, hình thành tinh thể nước đá ngoại bào nội bào thay đổi chất tan tế bào dẫn đến trình khử nước Sự hình thành tinh thể nước đá nội bào nguyên nhân gây tổn thương đông lạnh thường gây chết Vì việc làm lạnh phải thực đủ chậm để tất lượng nước đông thoát tế bào trình làm lạnh - Phương pháp giải đông: thường làm ấm nhanh III.5.4 Nhiệt độ lưu trữ Nhiệt độ phải đủ thấp để lưu trữ tế bào thời gian dài để ngưng hoạt động biến dưỡng, ngăn tổn thương mặt sinh hóa, thường lưu trữ nhiệt độ nito lỏng IV Ưu nhược điểm việc bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài IV.1 Ưu điểm - Bảo tồn đồng dạng di truyền: Tế bào thực vật nuôi cấy có đa dạng biến thiên di truyền lớn phụ thuộc vào nguồn gốc kết cấu di truyền mô, chịu ảnh hưởng đáng kể điều kiện vật lý chất ĐHST làm ổn định nhiễm sắc thể Sau nhiều chu kì nuôi cấy, tế bào có khuynh hướng trải qua trình nội nguyên phân (endomitosis), kết nuôi cấy thu nhiều mức độ bội nhiễm sắc thể khác - Bảo quản gen hiếm: loài đột biến, loài lai tạo ra,… - Lưu trữ tế bào thực vật sống thời gian dài mà không tính toàn tế bào - Tạo trì vật liệu bệnh, đặc biệt khả làm virus - Có thể chọn lọc dòng đột biến chịu lạnh 16 - Duy trì ưu phát sinh hình thái: Nuôi cấy mô thời gian dài làm khả phát sinh hình thái, cách lưu trữ đông lạnh, ưu phát sinh hình thái trì khoảng thời gian dài - Làm chậm biến dưỡng lão hóa: Ở nhiệt độ cực thấp, toàn tế bào giữ trạng thái bất hoạt mặt biến dưỡng Điều ngăn chặn gần làm ngưng trình lão hóa Biến dưỡng hay trao đổi chất trình sinh hoá xảy thể sinh vật với mục đích sản sinh nguồn lượng nuôi sống tế bào (quá trình dị hoá) tổng hợp vật chất cấu tạo nên tế bào (quá trình đồng hoá), tảng tượng sinh học - Đối tượng hình thức lưu trữ đa dạng - Chỉ cần không gian nhỏ hẹp để lưu trữ lượng mẫu lớn - Tránh rủi ro điều kiện ngoại cảnh: dịch bệnh, thiên tai,… IV.2 Nhược điểm - Chi phí bảo quản lớn - Đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao trang thiết bị đại - Có khă tạo biến dị soma (ít xảy ra): chủ yếu xảy trình nuôi cấy mô tái sinh - Chưa có đánh giá đầy đủ mối tương tác yếu tố môi trường - Chưa xác định thời gian bảo quản tối đa cho đối tượng V Khả ứng dụng việc bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài - Trong nông nghiệp: bảo tồn trồng chuyển gen, lai F1, trồng bệnh, tạo virus,… - Trong công nghiệp: dây chuyền sản suất giống phương pháp nuôi cấy mô - Trong y học: bảo tồn dược liệu - Trong nghiên cứu khoa học: bảo tồn giống quý nằm sách đỏ, lưu trữ tế bào thực vật sống thời gian dài mà không tính toàn tế bào, … VI Kết luận - Có nhiều nhiều cách bảo tồn nguồn gen in vitro thời gian dài có điểm chung bảo tồn nito lỏng, sử dụng tác nhân bảo quản 17 đông lạnh giảm nước tế bào Trong phương pháp Thủy tinh hóa (Vitrification) sử dụng phổ biến - Để thành công việc lưu trữ lạnh, cần phải tránh việc gây đông bên làm chết tế bào vốn thường xảy trình làm lạnh nhanh nito lỏng Do mẫu cần lưu trữ phải khử nước cẩn thận để tránh xảy đông nội bào Sự thủy tinh hóa chế chống đông cho phép tế bào, mô quan hydrate hóa sống sót nhiệt độ nito lỏng (Các mẫu nước khả sống sót cao hơn, ví dụ đỉnh sinh trưởng) Sự thủy tinh hóa trình vật lý, định nghĩa chuyển phase dung dịch nước từ dạng lỏng sang trạng thái rắn thủy tinh vô định hình nhiệt độ gọi nhiệt độ hóa thủy tinh tránh tạo thành tinh thể nước đá với cạnh sắc nhọn gây tổn thương tế bào mô Thủy tinh lấp chỗ trống mô, suốt trình khử nước góp phần vào việc ngăn cản hủy hoại mô nhiều hơn, nồng độ chất tan thay đổi pH Dạng thủy tinh có độ nhớt cao làm ngừng phản ứng hóa học đòi hỏi có khuếch tán phân tử, hình thành dạng dẫn đến ngủ ổn định thời gian dài - Việc bảo tồn nguồn gen in vitro có nhiều ý nghĩa đặc biệt nông nghiệp nghiên cứu khoa học 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Dương Tấn Nhựt, Công nghệ sinh học thực vật – nghiên cứu ứng dụng, tập 1, NXB Nông Nghiệp, Hồ Chí Minh, 2011 Vũ Văn Liết, Giáo trình quỹ gen bảo tồn quỹ gen, Bộ Giáo dục đào tạo trường Đại học nông nghiệp Hà Nội, 2009 Tiếng Anh: Nguyen Tien Thinh, Hiroko Takagi and Akira Sakai, Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of some vegetatively propagated tropical monocots by vitrification, Cryopreservation techniques, p 227 – 232 Masaya Ishikawa, Hiroyuki Ide, William S Price, Yoji Arata and Tomomi Kitashima, Freezing behaviours in plant tissues as visualized by NMR microscopy and their regulatory mechanisms, Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm, p 22 – 35 A Review, Anja Kaczmarczyk, Veli – Matti Rokka, E R Joachim Keller, 2011, Potato Shoot Tip Cryopreservation, Potato Research, 54: 45 – 79 Biao Wang, Zhenfang Yin, Chaohong Feng, Xiao Shi, Yupeng Li, Qiaochun Wang, 2008, Cryopreservation of Potato shoot Tips, Global Science Books 19 PHỤ LỤC Các chữ viết tắt: - DMSO: Dimethyl sulfoxide - MS: Murashige and Skoog (1962) - PVS2: Plant vitrification solution 2: hỗn hợp dung dịch đông lạnh thực vật số - ĐHST: Điều hòa sinh trưởng thực vật - LD: hỗn hợp glycerol 2M bổ sung sucrose 0.4M - BAP: – Benzyl amino purine - GA3: Gibberellic acid - IAA: Idole – – acetic acid So sánh phương pháp bảo tồn in vitro Giống nhau: - Cùng chung mục đích bảo quản hạn chế cấy chuyền nhiều lần gây biến dị, giữ giống, trì phong phú đa dạng di truyền loài, loài hệ sinh thái nói chung để làm sở cho việc khai thác sử dụng chúng cách hợp lý cho tương lai - Đều bổ sung tác nhân bảo quản bảo quản nhiệt độ thấp - Được thực điều kiện bảo quản vô trùng hạn chế ảnh hưởng đến sức sống mẫu in vitro - Lựa chọn vật liệu xử lý bệnh Khác nhau: Bảo quản ngắn hạn: nuôi cấy in vitro điều kiện sinh trưởng bình thường Bảo quản dài hạn Phương Phương pháp bảo quản pháp ngừng sinh trưởng tạm thời Nguyên lý Làm cho mẫu ngừng sinh trưởng tạm thời Đặc điểm -Mẫu bảo quản nito lỏng -Trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng -Có thể bảo quản 20-30 năm lâu Bảo quản trung hạn Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu Làm cho tốc độ sinh trưởng mẫu giảm tới mức tối thiểu -Sử dụng chất ức chế sinh trưởng ABA, CCC; chất gây áp suất thẩm thấu mannitol, sorbitol, saccarose -Trong thời gian bảo quản mô tế bào tiếp tục sinh trưởng với tốc độ chậm -Có thể kéo dài vài năm 20 Đối tượng Mẫu đem bảo quản dạng Mẫu dạng phôi, chồi, mầm, phôi, mô sẹo, mô nuôi cấy… Điều kiện Nito lỏng -1960C Cường độ ánh sáng yếu kết hợp nhiệt độ bảo quản thấp 0-50Cvới loài nguồn gene chịu lạnh; 15-200C với nhiệt đới Xử lý mẫu Phá băng -350C đến - Mẫu chuyển sang môi trường sau bảo 400C pha chế đặt điều kiện tối thích quản thời gian ngắn để kích thích tái sinh trưởng mẫu trước bắt đầu chu kì bảo quản Khả làm virus (Virus elimination) Phương pháp bảo tồn loại bỏ virus với tần số cao: Ví dụ: virus PVY (Potato virus Y) khoai tây tách đỉnh sinh trưởng loại 65% phương pháp loại 91 – 95% Ngoài ra, phương pháp tách đỉnh sinh trưởng cần 87 ngày để tạo virus với kích thước đỉnh sinh trưởng nhỏ (0,01 – 0,05 mm) phương pháp có 55 ngày với kích thước đỉnh chồi tách lớn nhiều (1 – mm) (Biao Wang, Zhenfang Yin, Chaohong Feng, Xiao Shi, Yupeng Li, Qiaochun Wang, 2008, Cryopreservation of Potato shoot Tips, Global Science Books.) 21 [...]... định được thời gian bảo quản tối đa cho từng đối tượng V Khả năng ứng dụng của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài - Trong nông nghiệp: bảo tồn các cây trồng chuyển gen, cây lai F1, cây trồng sạch bệnh, tạo cây sạch virus,… - Trong công nghiệp: các dây chuyền sản suất giống bằng phương pháp nuôi cấy mô - Trong y học: bảo tồn các cây dược liệu - Trong nghiên cứu khoa học: bảo tồn các giống... tồn các giống cây quý nằm trong sách đỏ, lưu trữ tế bào thực vật sống trong thời gian dài mà không mất tính toàn thế của tế bào, … VI Kết luận - Có rất nhiều nhiều cách bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài nhưng đều có một điểm chung là bảo tồn trong nito lỏng, sử dụng các tác nhân bảo quản 17 đông lạnh và giảm nước trong tế bào Trong các phương pháp đó thì Thủy tinh hóa (Vitrification) được... đủ thấp để lưu trữ tế bào trong thời gian dài và để ngưng mọi hoạt động biến dưỡng, ngăn các tổn thương về mặt sinh hóa, thường lưu trữ ở nhiệt độ của nito lỏng IV Ưu và nhược điểm của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài IV.1 Ưu điểm - Bảo tồn được sự đồng dạng di truyền: Tế bào thực vật nuôi cấy có sự đa dạng và biến thiên di truyền rất lớn phụ thuộc vào nguồn gốc và kết cấu di truyền... hiện tại và trong tương lai - Đều bổ sung các tác nhân bảo quản và bảo quản ở nhiệt độ thấp - Được thực hiện dưới điều kiện bảo quản vô trùng và hạn chế ảnh hưởng đến sức sống của mẫu in vitro - Lựa chọn vật liệu và xử lý sạch bệnh Khác nhau: Bảo quản ngắn hạn: nuôi cấy in vitro dưới điều kiện sinh trưởng bình thường Bảo quản dài hạn Phương Phương pháp bảo quản pháp ngừng sinh trưởng tạm thời Nguyên... ngừng sinh trưởng tạm thời Đặc điểm -Mẫu được bảo quản trong nito lỏng -Trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng -Có thể bảo quản 20-30 năm hoặc lâu hơn Bảo quản trung hạn Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu Làm cho tốc độ sinh trưởng của mẫu giảm tới mức tối thiểu -Sử dụng chất ức chế sinh trưởng như ABA, CCC; chất gây áp suất thẩm thấu như mannitol, sorbitol, saccarose -Trong. .. và sự thay đổi pH Dạng thủy tinh có độ nhớt rất cao và làm ngừng mọi phản ứng hóa học đòi hỏi có sự khuếch tán phân tử, sự hình thành của dạng này sẽ dẫn đến sự ngủ và ổn định trong thời gian dài - Việc bảo tồn nguồn gen in vitro cũng có rất nhiều ý nghĩa đặc biệt là trong nông nghiệp và nghiên cứu khoa học 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1 Dương Tấn Nhựt, Công nghệ sinh học thực vật – nghiên cứu... nhau - Bảo quản được các bộ gen hiếm: các loài đột biến, các loài được lai tạo ra,… - Lưu trữ tế bào thực vật sống trong thời gian dài mà không mất tính toàn thế của tế bào - Tạo và duy trì được vật liệu sạch bệnh, đặc biệt khả năng làm sạch virus - Có thể chọn lọc được các dòng đột biến chịu lạnh 16 - Duy trì ưu thế phát sinh hình thái: Nuôi cấy mô trong thời gian dài sẽ làm mất khả năng phát sinh hình... ĐHST: Điều hòa sinh trưởng thực vật - LD: hỗn hợp glycerol 2M bổ sung sucrose 0.4M - BAP: 6 – Benzyl amino purine - GA3: Gibberellic acid - IAA: Idole – 3 – acetic acid So sánh các phương pháp bảo tồn in vitro Giống nhau: - Cùng chung mục đích bảo quản là hạn chế cấy chuyền nhiều lần gây biến dị, giữ giống, duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung... sang môi trường mới sau bảo 400C pha chế và đặt trong điều kiện tối thích quản một thời gian ngắn để kích thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kì bảo quản mới Khả năng làm sạch virus (Virus elimination) Phương pháp bảo tồn này có thể loại bỏ virus với tần số cao: Ví dụ: virus PVY (Potato virus Y) ở khoai tây nếu tách đỉnh sinh trưởng chỉ loại được 65% trong khi phương pháp này... thủy tinh hóa nằm trong ứng dụng nhanh chóng và dễ dàng mà không cần thiết bị làm mát đắt tiền mà đó lại là cần thiết cho làm mát 2 bước - Các phương pháp khác: tiền xử lý in vitro, tiền xử lý in vitro/ khử nước, tạo hạt nhân tạo/thủy tinh hóa… 13 III.4 Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) Hình III.4 Bảo quản đông lạnh cây khoai sọ bằng phương pháp thủy tinh hóa - Vật liệu: 3 loại mô phân sinh