BÁO cáo THỰC HÀNH kỹ THUẬT DI TRUYỀN

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử,… 1.2. Mục tiêu, yêu cầu Sinh viên có cái nhìn tổng quan về sự tổ chức và hoạt động của một phòng thí nghiệm sinh học phân tử điển hình. Biết cách sử dụng các thiết bị, hóa chất trong phòng thí nghiệm. Nắm được thao tác, nguyên tắc thực hiện của kỹ thuật PCR và điện di trên gel agarose. Biết cách đọc kết quả

BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 Địa điểm

Trường Đại Học Đà Lạt, Khoa Sinh Học, Phòng Sinh Học Phân Tử

1.2 Mục tiêu, yêu cầu

- Sinh viên có cái nhìn tổng quan về sự tổ chức và hoạt động của một phòng thí nghiệm sinh học phân tử điển hình

- Biết cách sử dụng các thiết bị, hóa chất trong phòng thí nghiệm

- Nắm được thao tác, nguyên tắc thực hiện của kỹ thuật PCR và điện di trên gel agarose

- Biết cách đọc kết quả

PHẦN 2: NỘI DUNG

2.1 Cơ sở lý thuyết

2.1.1 Kỹ thuật PCR

a) Định nghĩa:

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử,…

b) Nguyên tắc:

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme plymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của enzymen DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới kỹ thuật PCR được hình thành trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và

có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:

Bước 1: biến tính tách đôi hai sợi DNA

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94-950C) trong vòng 30giây đến 1phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn Chính hai mạch đơn này đóng vai trò làm mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới

Bước 2: bắt cặp

Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với các mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 45-550C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp từ 30-60 giây

 Xác định chế độ nhiệt thích hợp

Nhiệt độ gắn mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng (nhiệt độ tăng quá cao sẽ làm hai mạch đơn DNA không thể gắn lại với nhau Nhiệt độ giảm quá thấp sẽ xuất hiện sự bắt cặp không mong muốn, vị trí sao chép sai)

Nhiệt độ gắn mồi lý tưởng đủ thấp tạo điều kiện tăng khả năng bắt cặp giữa mồi

và khuôn Đủ cao để tránh trường hợp lai khập khiễng

Nhiệt độ này có thể xác định bằng nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp lai khuôn (tùy vào số lượng, trình tự DNA mà ta có nhiệt độ khác nhau)

Tm = (4 x (G + C)) + (2 x (A + T))

Bước 3: kéo dài

Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc

bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m: là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ 1 DNA đích đã nhân bản được thành 230-240 bản sao

c) Thiết kế mồi oligonucleotide tối ưu (độ dài của mồi ảnh hưởng đến sự bắt

cặp)

Tương ứng với trình tự đặt đối đầu cho vùng nhân bản

Đầu 3’ của mồi bắt cặp cần nằm đối đầu nhau

Độ dài của đoạn DNA nhân mã không được lớn hơn 3kb, độ dài lý tưởng 1kb

2.1.2 Kỹ thuật điện di

a) Đổ gel

Chuẩn bị gel agarose

- Tuỳ theo từng kích thước đoạn ADN/ ARN mà chuẩn bị nồng độ agarose phù hợp tuy nhiên nồng độ agarose thường trong khoảng từ 0.5 đến 3% (w/v) Bản gel nồng độ 0.7% - 1% thích hợp cho phân tách trên dải rộng: 0.15 -15kb; dải 2-3% cho phân tách các đoạn PCR

- Với điện di agarose đoạn ADN tốt nhất > 0.1 kb

- Điện di ARN, các sợi ARN cần phải được biến tính trước hoặc trong quá trình điện di bằng các hoá chất phù hợp

Đổ gel

- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel

- Đặt lược vào các khe

- Gel agarose đã pha, tan đều và ở nhiệt độ 60-700C Đổ phần gel từ từ, liên tục

để tránh tạo bọt và để yên cho gel đông lại

- Cẩn thận tháo thanh chắn

- Nhấc lược ra khỏi bản gel (ngay khi tháo thanh chắn hoặc khi đã đặt vào bể điện di)

b) Chạy gel

- Gắn bể điện di với bộ nguồn

- Đặt bản gel agarose vào trong máy theo đúng chiều âm (-) đến dương (+), đổ dung dịch đệm ngập bản gel

- Trộn mẫu với thuốc nhuộm ethidium bromide và tra mẫu vào giếng Lưu ý tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel Trong bản gel điện di nên tra một giếng với marker (ladder ) chuẩn phù hợp

- Đậy nắp máy điện di, cắm điện Bật công tắc máy điện di

c) Kết thúc quá trình điện di

- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di

- Tắt công tắc nguồn

- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr và tiến hành chụp ảnh gel hoặc soi trên bàn soi gel để kiểm tra kết quả

2.2 Kết quả thí nghiệm

Thành phần phản ứng trong PCR:

- 2x Taq Onestep Kit: 10 µl

- Forward primer 10pmol/µl: 250 µl

- Reverse primer 10pmol/µl: 20 µl

- Reverse transcriptan: 20 µl

- Ribosafe Rnase inhibitor: 10 µl

- Dung dịch H2O: 145 µl

Sản phẩm của PCR được sử dụng làm nguyên liệu điện di

455 µl

Đọc kết quả điện di: mẫu tại 422kb: SLCV (Strawbery Latent C Virus)

Giếng số 1; 4; 7; 8 nhiễm nặng

Giếng số 2; 6 nhiễm nhẹ

Giếng số 3; 5 không nhiễm

Đọc kết quả điện di: mẫu SVBV (Strawberry Vein Banding Virus) tại 422kb Giếng số 1; 6; 7; 8 nhiễm nặng (trong đó giếng số 6 nhiễm nặng nhất)

Giếng số 2; 4 nhiễm nhẹ

Giếng số 5 nhiễm rất nhẹ

Giếng số 3 không nhiễm

500 kb

500 kb