Căn cứ Điều 13, khoản 2, điểm a Nghị định số 1552016NĐCP của Chính phủ ngày 18 tháng 11 năm 2016 quy định về xử phạt vi phạm hành chính trong lĩnh vực bảo vệ môi trường; Căn cứ Biên bản vi phạm hành chính số 02BBVPHC do Cán bộ Môi trường UBND xã Gia Hòa 1 lập hồi 10 giờ 30 phút, ngày 16 tháng 6 năm 2017 tại ấp Định Hòa, xã Gia Hòa 1, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng;
Thực hành Kỹ thuật Di truyền Môn học: Họ & tên SV: Lớp: MSSV: Nhóm: Tổ: Thời gian thí nghiệm: Bảng điểm Bài TH Phần chuẩn bị Điểm Phần báo cáo Phần câu hỏi Ghi Tổng cộng Điểm kiểm tra Tổng điểm Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Thực tập Kỹ thuật di truyền Giới thiệu tổng quan kỹ thuật thao tác thí nghiệm sinh học phân tử kỹ thuật di truyền: Giới thiệu nội quy phòng thí nghiệm Giới thiệu mục đích, nội dung thí nghiệm hình thức kiểm tra Giới thiệu sử dụng dụng cụ, thiết bị pha hóa chất phòng thí nghiệm kỹ thuật di truyền Ứng dụng PCR kỹ thuật RFLP Ứng dụng PCR kỹ thuật RAPD Kế hoạch làm việc tuần (30 tiết) học Tuần Ngày 11-18/09 Bài Nội dung Kỹ thuật RFLP Thời gian 200 p 19-25/09 Kỹ thuật RFLP 200 p 26/09-02/10 03/09/10 1 Kỹ thuật RFLP Kỹ thuật RFLP 200 p 10-16/10 17-23/10 2 Kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD Ths Trần Hồng Bảo Quyên Kỹ thuật Khuyếch đại vùng TrnL-TrnF Kiểm tra mẫu khuyếch đại Tinh mẫu Kỹ thuật RFLP Kiểm tra kết xử lý mẫu RFLP Điểm 60% Kỹ thuật RAPD Kiểm tra kết RAPD 40% Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Bài 1: Giới thiệu tổng quan kỹ thuật thao tác thí nghiệm sinh học phân tử kỹ thuật di truyền Pipette man (Micropipette) Kiểm tra tình trạng hoạt động pipette man trước sử dụng Chỉnh thể tích cần sử dụng Thao tác vặn nút nên nhẹ nhàng, tránh vặn nhanh, vặn vặn lại nhiều lần vặn vượt thể tích cho phép pipette man Không trút ngược đầu pipette Chọn đầu típ thích hợp cho loại pipette Cỡ nhỏ: Cỡ trung bình: Cỡ lớn: - 10 µl 10 - 100 µl 100 - 1000 µl Khi hút: ấn nhẹ nút vặn xuống nấc thứ hai, cho đầu típ vào dung dịch nhả từ từ để hút lượng thể tích cần dùng Khi nhả dung dịch: ấn nút vặn xuống nấc thứ ba A B C Hình 1.1: Pipette man (A &B), Đầu típ C) (T-144: đầu típ nhỏ, T-155: đầu típ trung bình, T-166: đầu típ lớn) Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Ống eppendorf Là ống nhựa polyethylene polypropylene, tích từ 0.2 – ml, chịu nhiệt độ thấp – 20oC dung môi hữu chloroform Các eppendorf phải khử trùng kiện thông thường (1atm, 120oC, 20 phút) trước sử dụng Đánh số ghi tên lên nhám ống Sau cho dung dịch vào ống, kiểm tra đậy kín Lau chùi vết hóa chất dính bên ống Máy ly tâm Hình 1.2: eppendorf Máy ly tâm phải vệ sinh giữ điều kiện khô Khi ly tâm phải cân ống ly tâm đặt theo kiểu đối xứng cặp Thể tích dịch ly tâm thường chiếm ¾ thể tích ống ly tâm Không ly tâm dung dịch mức cho phép Chỉnh tốc độ quay, thời gian nhiệt độ ly tâm thích hợp Vặn nắp thật chặt trước ly tâm Máy khởi động tình trạng êm nhẹ, máy rung mạnh thể tích ống không đều, cần dừng lại điều chỉnh lại thể tích ống Hình 1.3: Máy ly tâm Vệ sinh máy lý tâm sau sử dụng Lau phát có hoá chất dung dịch vương vãi lên máy Một số nguyên tắc pha hóa chất Nguyên tắc chung Hóa chất pha chế tủ hút Sử dụng găng tay, trang pha chế dung dịch chất độc tiềm acrylamide (độc dược thần kinh), ethidibromua (chất gây ung thư) chất gây bỏng nặng phenol, acid, base đậm đặc Pha loãng dung dịch từ dung dịch mẹ Với hầu hết hóa chất sử dụng sinh học phân tử phải pha với nước khử ion chưng cất (nếu có) phải hấp khử trùng trước sử dụng (đối với hóa chất không bay hơi) Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Các bước pha chế dung dịch Chuẩn bị lọ đựng sạch, dán nhãn rõ ràng Cân hóa chất theo lượng cần dùng Chovào cốc thuỷ tinh với nước cất lần khuấy từ Đợi đến chất rắn tan hoàn toàn pha trộn lẫn vào thành pha Bổ sung nước cất thể tích xác định cuối Chỉnh pH điểm cần thiết (nếu có) Khử trùng dung dịch (nếu có) Kiểm tra độ trong, tạp chất độ nhiễm lần cuối trước cho vào lọ vô trùng để bảo quản hay sử dụng Các dung dịch đệm dung dịch chế phẩm sinh học cần bảo quản điều kiện lạnh thời gian ngắn Bảo quản chế phẩm sinh học Các chế phẩm DNA RNA phải bảo quản chế độ nghiêm ngặt Dung dịch ethanol gây hỏng ADN có mặt ion kim loại nặng Da người có Nuclease nên không tiếp xúc trực tiếp với mẫu da trần Các Rnase thường bền rữa khử trùng chúng bám lại bề mặt chai lọ 5oC nhiệt độ cần thiết để bảo quản sinh phẩm - 20oC làm gẩy DNA - 70 oC nhiệt độ dùng để bảo quản lâu dài chế phẩm với điều kiện môi trường có nồng độ muối 1M, có mặt EDTA (hơn 10mM) pH = 8,5: bảo quản dịch CsCl với EtBr tối oC Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Bài 2: Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Tổng quan lý thuyết: RFLP định nghĩa tính đa hình chiều dài phân đoạn cắt giới hạn RFLP biểu khác kích thước phân đoạn tạo cắt DNA enzyme cắt giới hạn RFLP kỹ thuật sử dụng phổ biến Nguyên tắc kỹ thuật dựa độ đặc hiệu enzyme cắt hạn chế (RE) vị trí nhận biết chúng DNA RFLP cổ điển thưc đoạn DNA quan tâm cần phải chọn lọc cách , chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai lai với mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với locus đặc biệt Tiếp theo đoạn DNA quan tâm cắt enzyme cắt giới hạn khảo sát độ dài điện di Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể tạo phân đoạn cắt khác Kỹ thuật thực phức tạp, nguy hiểm sức khoẻ người nghiên cứu, DNA yêu cầu có chất lượng cao làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật Cùng với phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản Một cặp mồi oligonucleotide dùng khuếch đại vùng DNA cần khảo sát, sau đoạn DNA khuếch đại cắt RE, điện di phân tích gel nhuộm ethidium bromide bạc RFLP-PCR bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ nguy hiểm phương pháp RFLP cổ điển NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) công cụ để phân nhóm liệu Trong sinh học, NTSYS áp dụng phần mềm thống kê giống khác mặt di truyền cá thể hay quần thể Dựa vào việc so sánh phân tích liệu, NTSYS xếp thành khối số liệu có tình tương quan lẫn Khối số liệu biễu diễn dạng biểu đồ hình (cây tiến hóa) Mục đích: Sử dụng enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) khảo sát đa hình chiều dài đoạn DNA, đồng thời xây dựng đồ cắt giới hạn 3.Vật liệu thiết bị Vật liệu: DNA toàn phần RE: Pst I, EcoRV, Hind III RE Buffer Vật liệu chạy PCR: mồi, dNTP, Tag polymerase, buffer, MgCl2, Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Vật liệu chạy điện di: agarose, ethidium bromide, thang DNA 100bp, loading dye, TAE 1X Hóa chất tinh sản phẩm PCR: Chloroform: isoamyl,Ethanol: 100%, NaOAc 3M Thiết bị: PCR, chạy điện di, Dolphin Doc Thực hành Bước 1: Khuếch đại vùng TrnL-trn F Cho vào eppendorf 0.2ml thành phần tiến hành chạy chương trình PCR bảng sau Sau xem kết chạy PCR điện di Bảng Thành phần chương trình chạy phản ứng PCR Thành phần eppendorf 0,2 ml Chương trình chạy PCR Thành phần Mẫu Đối chứng âm Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu trình DNA mẫu 60 ng L 1st denaturation 94 phút Mồi 5pM 5Pm DNA denaturation 94 45 giây 35 DNTPs 125L 125L Primer annealing 55 45 giây 35 MgCl2 2.5mM 2.5mM Primer extension 72 phút 35 Tag polymerase 0.25L 0.25L Last extension 72 10 phút Mineral oil 25L 25L Nước cất tiệt trùng L 60ng Tổng cộng 25 L 25 L Bước 2: Tinh sản phẩm PCR Hút 50µL sản phẩm PCR với 50µL phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) vào eppendorf 1.5ml, trộn đều, ly tâm lạnh 13000rpm vòng 2phút.Thu dịch nổi, bỏ cặn Cho tiếp 5µL NaOAc 3M 150µL ethanol 99.7% ủ 20oC 15phút Ly tâm thu tủa Kiểm tra sản phẩm tinh phương pháp chạy điện di Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Bước 3: Phản ứng cắt Chuẩn bị eppendorf, lần lược cho thành phần phản ứng vào: 34 L nước khử ion tiệt trùng, 5L buffer (10X), 0.5L (100X)BSA, 10L DNA ( 1g/L) Trộn hỗn hợp cách hút nhả Cho 0.5L enzyme cắt giới hạn (10U/L) spin (với đối chứng âm: không cho RE) Ủ 37oC Bước 4: Xem –xử lý kết -Xem kết kỹ thuật điện di - Xử lý kết chươngtrình NTSYS Thiết lặp bảng kết Excel (bảng 2) Hàng 1: thiết lập thông số bảng số liệu Trong hàng cột số (ma trận hình chữ nhật), (ma trận vuông có số liệu không đối xứng) (ma trận vuông có số liệu đối xứng) Hàng cột 2: ghi số hàng , hàng cột ghi số cột (chỉ tính hàng cột số liệu, không tính hàng cột ký hiệu) Hàng cột số liệu thiếu có số liệu thiếu Hàng 2: đánh ký hiệu mẫu Cột ( hàng 3) ghi ký hiệu mồi Quy định số liệu: dạng nhị phân, có xuất vạch không xuất vạch Bảng 2: Bảng số liệu OPA1-1 OPA1-2 OPA1-3 OPN1-1 OPN1-2 T1 1 T2 1 0 T3 0 1 T4 1 T5 1 0 T6 1 0 Tạo bảng thể hệ số tương quan mẫu: Bật chương trình NTSYS, click chuột vào “similarity”, tiếp tục click vào “Qualitative data” Double click vào “input file” để chọn file số liệu excel, đặt tên cho “output file” Các thông số khác không thay đổi Click chuột vào “compute” Như ta có file “*.NTS” thể bảng hệ dố tương đồng mẫu Xây dựng cây: Chọn “clustering”, tiếp tục chọn” SAHN”, nhập input file “*.NTS” vừa tạo phía Đặt tên cho Out put nhấn “compute” - Dùng PCR mồi đăc hiệu khuếch đại target gene (Chloroplast DNA) Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền - Tinh sản phẩm PCR - Sử dụng enzyme cắt giới hạn: Dung dịch mẫu gồm: 34 L nước khử, 5L buffer (10X), 0.5L (100X)BSA, 10L DNA ( 1g/L) eppendorf (đã tiệt trùng) Trộn Cho 0.5L enzyme cắt giới hạn (10U/L) spin (với đối chứng âm: không cho RE) Ủ 37oC - Xem kết điện di Yêu cầu cho phần viết báo cáo -Nêu ý nghĩa/mục đích thực hành -Trinh bày quy trình thí nghiệm Kết Kết điện di (hình ảnh): Khuếch đại RFLP Bảng thể tỉ lệ tương đồng (SM coefficient) Sơ đồ quan hệ chủng loài Sơ đồ enzyme cắt giới hạn Nhận xét kết quả: nhận xét kết khuếch đại, từ sơ đồ hình có nhận xét mối tương quan mẫu Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Bài 3: Kỹ thuật Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Tổng quan lý thuyết: RAPD: Đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên Kỹ thuật phát William Welsh năm 1990-1991 RAPD kỹ thuật dựa kỹ thuật PCR nhằm khuyếch đại đoạn DNA mồi ngẫu nhiên Mồi ngẫu nhiên đoạn oligonucleotide có chiều dài 5-12nu Mồi ngắn khả bắt cặp cao mồi dài khả bắt cặp xác Trong kỹ thuật này, cặp mồi không sử dụng PCR thông thường mà thay vào mồi đơn (nhiều 5mồi) Tuy nhiên thành phần khác DNA polymerase chịu nhiệt, dNTP, đệm điều kiện nhiệt thiết lập PCR thông thường Chính mồi ngẫu nhiên giúp khuếch đại đoạn DNA khác tồn DNA tổng số So sánh đoạn DNA đa hình cá thể hổ trợ phần mềm tin học giúp vẽ sơ đồ cây, thể mối tương quan di truyền chúng Như kỹ thuật RAPD gồm bước bản: bước 1, tách chiết thu nhân DNA tổng số; bước 2, chạy PCR mồi ngẫu nhiên; bước chạy điện di phân tích kết Mục đích: Sử dụng mồi ngẫu nhiên PCR để xác định tính đa dạng nguồn gốc di truyền Vật liệu thiết bị Vật liệu: mồi ngẫu nhiên (Primer): OPA04 OPA1, OPA17, OPA19, OPA20, OPN 04, OPN 11, OPN 13, OPN 19, OPN 20 Hóa chất chạy PCR: dNTPs, Tag polymerase, Đệm/MgCl2 Nước cất lần tiệt trùng Hóa chất chạy điện di: agarose, loading dye, TAE 1X, ethidium bromide, thang 100bp Thiết bị: máy PCR, thiết bị chạy điện di, Dolphin Doc Thực hành: Chạy PCR với mồi ngẫu nhiên: Chuẩn bị eppendorf 0.2ml, eppendorf làm mẫu đối chứng âm (chỉ cần ống đối chứng âm cho lần chạy PCR), eppendorf chứa mẫu Thêm vào eppendorf thành phần bảng Cho eppendorf vào buồng chạy PCR, đóng nắp thiết lập chương trình chạy PCR bảng Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page 10 of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Sau chạy PCR, kết thể kỹ thuật điện di Bảng 1: Thành phần chương trình chạy PCR cho mồi ngẫu nhiên RAPD Thành phần eppedorg 0.2ml Thành phần Mẫu Chương trình PCR Đối chứng Giai đoạn T (oC) âm Thời Chu gian kỳ DNA mẫu 60 ng ng Biến tính ban đầu 94 mins Mồi 2.5L 2.5L Biến tính 94 45 sec 45 dNTPs 2.5L 2.5L Bắt cặp 37 1min 45 MgCl2 2.5mM 2.5mM Kéo dài 72 2mins 45 Tag polymerase 0.25L 0.25L Kéo dài cuối 72 mins Đệm 25L 25L Trữ H2O tiệt trùng Thêm đủ 25L Tổng thể tích 25 L 25 L b Xử lý kết NTSYS Yêu cầu cho phần viết báo cáo Nêu ý nghĩa/mục đích thực hành Trình bày quy trình thí nghiệm Kết Kết điện di (hình ảnh) Bảng thể tỉ lệ tương đồng (SM coefficient) Sơ đồ hình Nhận xét kết quả: từ sơ đồ hình có nhận xét mối tương quan mẫu Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page 11 of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Das, M, Bhattacharya, S Singh, P, Filgueiras, T, Pal, A 2008, ‘Bamboo Taxonomy and Diversity in the Era of Molecular Markers’, Elsevier Ltd, vol 47, pp 225-268 Das, P, Rout, G, Nayak, S , 2003 ‘Evaluation of the genetic variability in bamboo using RAPD markers’, Plant Soil Environ, vol 49, pp.24–28 Gollan, P & Phillip, R 2010, Applications of Bioinformatics, Swinburne university of technology Karcher, S 1995 Molecular biology: a project approach , Acadamic Press, California Nicholl, D 2008, An introduction to genetic engineering,Cambridge, 3rd edn, New York Nguyễn, N.T 2009, Nghiên cứu tính đa dạng di truyền quần thể thông đỏ Lâm Đồng kỹ thuật sinh học phân tử, Luẫn văn thạc sĩ Ths Trần Hồng Bảo Quyên Page 12 of 12 ...Thực hành Kỹ thuật Di truyền Thực tập Kỹ thuật di truyền Giới thiệu tổng quan kỹ thuật thao tác thí nghiệm sinh học phân tử kỹ thuật di truyền: Giới thiệu nội quy phòng... RFLP Điểm 60% Kỹ thuật RAPD Kiểm tra kết RAPD 40% Page of 12 Thực hành Kỹ thuật Di truyền Bài 1: Giới thiệu tổng quan kỹ thuật thao tác thí nghiệm sinh học phân tử kỹ thuật di truyền Pipette... 03/09/10 1 Kỹ thuật RFLP Kỹ thuật RFLP 200 p 10-16/10 17-23/10 2 Kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD Ths Trần Hồng Bảo Quyên Kỹ thuật Khuyếch đại vùng TrnL-TrnF Kiểm tra mẫu khuyếch đại Tinh mẫu Kỹ thuật