THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Bài 1.TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH SẢN PHẨM DNA RNA TỪ VI KHUẨN E.COLI NẤM MEN BẰNG PHENOL – CHLOROFORM Bài 2.ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA RNA TỪ VI KHUẨN E.COLI NẤM MEN Bài 3.TÁCH CHIẾT, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA TỪ MÔ THỰC VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP BOOM BÀI 4.XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH SẠCH CỦA DNA PLASMID E.COLI BẰNG KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠNBài 11+12: KĨ THUẬT LAI PHÂN TỬ (DNA HYDRIDIZATION) – TÁCH CHIẾT VÀ BIỂU HIỆN DNA TRÊN PCR BÀI 5.KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO VẬT CHỦ E.COLI KIỂM TRA DNA TẠO DÒNG BẰNG PHẢN ỨNG PCR BÀI 6.KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO VẬT CHỦ E.COLI TÁCH DNA TẠO DÒNG

Bài 1

TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH SẢN PHẨM DNA &

RNA TỪ VI KHUẨN E.COLI & NẤM MEN BẰNG

PHENOL – CHLOROFORM

I NGUYÊN TẮC

Trong các phương pháp chiết xuất và tinh chế DNA thì phương pháp chiết xuất bằng phenol và chloroform là những phương pháp cơ bản Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết xuất DNA với nhiệt độ thường ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 độ C) nhưng khi lẫn với khoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa các phân tử nước vây quanh Khi pha hỗn hợp này vào dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kỵ thuỷ nên có khuynh hướng lien kết vào vùng kỵ thuỷ của protein ở bên trong cấu trúc của các phân

tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) ra ngoài.Các nhóm kị thuỷ này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau

Trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước và có thể hút sangống chứa khác Thao tác loại bỏ protein, lipid và các chất tan trong dungdịch DNA là chiết xuất bằng phenol rồi bằng phenol-chloroform sau đó bằng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Sử dụng cả hai loại dung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao nhưng cũng có thể dùng chỉ một loại Tuy nhiên, nhiều khi cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroform hoặc ether Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức

độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều cũng có thể làm biến tính protein tan trong nước, trong khi đó sử dụng chloroform hay

chloroform-isoamyl alcohol thì phải trộn đảo kỹ vì các chất này không tan trong nước Pha them chloroform vào phenol làm tính kị thuỷ của phenol tăng nên làm tăng hiệu quả biến tính protein

II THAO TÁC TIẾN HÀNH

 Chuẩn bị dung dịch (stock)

 Điều chế phenol

1/ Đun nóng (cách thuỷ) phenol tinh thể đông cứng (loại đặc biệt)

ở 68 – 80 độ C để làm tan chảy Thêm oxine

(8-hydroxyquinoline) ở 0,05 – 0,1% (có tác dụng phòng ngừa oxi hoá phenol

2/ Thêm khoảng ½ - 1/3 dung dịch Tris 1M (pH 8,0), trộn đều rồi

để yên, loại bỏ lớp nước mặt rồi lặp lại thao tác một lần nữa Tris

có tác dụng làm phenol bão hoà trở nên trung tính Khi đó, dưới lớp dung dịch đệm là lớp phenol, mỗi lần cần sử dụng phenol thì cho pipet (bịt đầu trên) xuống lớp phenol và hút lượng phenol cần dùng vào ống Eppendorf 1,5 µl

3/ Cho 1 lượng chloroform tương đương để tạo dung dịch hỗn hợp 500 µl phenol: 500 µl chloroform

4/ Bảo quản ở 4 độ C, có thể để đến vài tháng

 Chiết xuất phenol và chloroform

Phối trộn với phenol vừa điều chế với dung dịch chloroform với tinh thể tương đương bảo quản ở điều kiện 4 độ C

 Tách chiết DNA & RNA

 Tách chiết DNA

1/ Thêm vào 100µl dung dịch đồng nhất của vi khuẩn E.coli một

lượng tương đương hỗn hợp dung dịch phenol : chloroform (1:1).2/ Dùng máy Vortex trộn đều để tạo thành dạng huyền dịch Nếu cần chiết xuất DNA phân tử lượng lớn thì cần tránh trộn mạnh, cần thêm thời gian chiết xuất

3/ Ly tâm ở nhiệt độ phòng (30 độ C) khoảng 2 phút ở 10.000v/p (RPM) với ống Eppendorf ở tốc độ cao

4/ Hút 200µl lấy lớp nước dung dịch nổi ở trên ( lớp trên nếu nồng độ muối NaCl của dung dịch thấp hơn 1,5M) chuyển sang

lọ mới

5/ Chiết xuất lặp lại 3 lần với phenol-chloroform

6/ Lần 3 thì cho máy quay 12.000 v/p , ở nhiệt độ -5 độ C Sau đóhút 100µl dịch nổi, bổ sung 300µl cồn lạnh ở 70 độ C.

Chú ý: với DNA phân tử lượng thấp nên dùng phương pháp chiết

xuất phenol-chloroform và choloroform với NaCl lớn hơn 0,1M DNA nhỏ có thể hoà tan trong phenol

 Tách chiết RNA

1/ Mỗi nhóm bổ sung vào eppendorf 1,5 ml thêm 100µl dịch đồng nhất, 1000µl chloroform, quấn parafilm tiến hành vortex trong 10 phút sau đó ly tâm 5.000 v/p trong 10 phút

2/ Hút phần dịch nổi khoảng 500µl Đem đi ly tâm 10.000 v/p trong 10 phút

3/ Thu 400µl dịch nổi vào eppendorf khác, bổ sung 100µl

potassium acetat 5%và 500µl ethanol lạnh Vortex 10 phút (ủ lạnh và vortex gián đoạn) Ly tâm 10000 v/p trong 15 phút

III KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

IV CÂU HỎI THẢO LUẬN

 Cho biết vai trò của phenol, chloroform trong kỹ thuật di truyền và các ngành sinh học khác?

Phenol làm biến tính protein rồi sau đó tủa protein

Chloroform làm tăng tính kỵ nước của phenol và làm tăng hiệu quả biến tính protein

 Tại sao tách chiết DNA & RNA lại nên sử dụng hỗn hợp chloroform

& phenol mà không thể sử dụng riêng lẻ hay các thành phần hỗn hợpkhác?

Vì dung dịch chloroform & phenol làm cho hiệu quả tách chiết DNA

là cao nhất nhưng cần phải loại bỏ phenol ra khỏi dung dịch nên bắt buộc phải dùng ether và chloroform để loại bỏ hoàn toàn phenol

 Các điều lưu ý khi làm việc với phenol-chloroform trong kỹ thuật di truyền là gì?

Phải mang gang tay, khẩu trang y tế khi thực hiện các thao tác với các hợp chất trên cần hết sức cẩn thận Tránh để dây, bắn vào da hayhít phải khí bay ra vì phenol là chất gây bỏng lạnh, chloroform là chất gây mê.

Bài 2 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA & RNA TỪ VI

KHUẨN E.COLI & NẤM MEN

I NGUYÊN TẮC

 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ QUANG HỌC

Ánh sáng khi đi qua môi trường lỏng sẽ bị các phần tử vật chất trong môi trường đó hấp thu một phần Sự hấp thu ánh sáng gia tăng khi nồng độ các phần tử vật chất trong môi trường đó gia tăng Dựa vào nguyên lý trên người ta

có thể đo nồng độ các phần tử vật chất trong môi trường lỏng thong qua mối quan hệ giữa cường độ ánh sang trước và sau khi đi qua môi trường

Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sang mạnh nhất) ở một độ dài song nhất định tuỳ thuộc vào cấu trúc của chúng Ví dụ: đỉnh hấp thụ của các nucleic acid là ở 260nm trong vùng tử ngoại Sự hấp thụ này là do

sự tương tác giữa các photon với các electron và vòng purine và pyrimidine

Sự hấp thụ ở đây được tính bằng đơn vị đo OD (Optical Density) Một đơn vị hệ

số chuyển đổi OD tương ứng với:

 50 µg/ml DNA sợi đôi

 40 µg/ml DNA sợi đơn hay RNA

Từ giá trị OD đo được, người ta có thể suy ra nồng độ nucleic của dung dịch

C (mg/ml) = A260nm.k.nC: nồng độ DNA, RNA

A260nm: trị số OD đo đượck: đơn vị hệ số chuyển đổin: số lần pha loãng

Bên cạnh đó, người ta còn tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm để ước lượng độ tinh sạch củadung dịch nucleic acid Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2 dung dịch nucleic acid được xem là tinh sạch Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều khi đó việc định lượng nucleic acid bằng mật độ quang học sẽ không còn chính xác

Đối với dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ bước song A260nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là hai sợi đơn tách rời nhau Người ta gọi đó là hiệu quả siêu sắc.

 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI GEL AGAROSE:

Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanhhơn

Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein Bài này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid

Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn là cac gel Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua, phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển càng trong gel càng chậm Tuỳ theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người

ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide

Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di có thể quan sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu qua đối với UV)

Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNAsợi đôi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleic (cặp base –bp) Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau

Gel polyacrylamide có lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn

có kích thước dưới 500 bp Với gel polyacrylamide người ta có thể phân tách hai phân tử DNA chỉ sai khác nhau một nucleotide

Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta

sử dụng một số phương pháp làm hiện hình như sau:

Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel Hoặc có thể hiện hình các NuAgNO3 1% tạo muối bạc trong môi trường kiềm

Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng vịphóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Chúng còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm màu riêng biệt.

Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder) Đó là hỗn hợp của nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của cácphân tử trên gel với thang chuẩn một số thang DNA thông dụng: X174-Hae III,

 Cốc chứa nước thải, giấy thấm

 Máy đo mật độ quangIII PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

 PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG (OPTICAL DENSITY)

Tiến hành tương tự như nhau ở cả hai loại dung dịch DNA và RNA theo các bước sau:

Bước 1: Pha loãng 10 lần bằng cách trộn chung 100 µl dịch acid nucleic với 0,9 mlnước cất, trộn kỹ bằng pipetman và xen lẫn vortex Lưu giữ lạnh và đậy nắp kỹ.Bước 2: Pha loãng tiếp 2 lần bằng cách hút bổ sung 1ml nước cất

Bước 3: Chuẩn OD bằng nước cất và tiến hành đo ở 2 bước sóng 260nm và

280nm

Bước 4: Ghi nhận kết quả và tính toán kết quả.

 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI DEL AGAROSE (GEL

 Đổ agarose lỏng vào khuôn

 Đợi khi gel đông, đặt bản điện di vào bồn điện di và tháo lược ra

Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu:

 Chuẩn bị một miếng parafilm, hút 10 µl dung dịch DNA ở mẫu điện di đặt lên miếng parafilm, (Đối với sản phẩm cắt giới hạn, sử dụng hết lượng mãu có 10 µl)

 Thay đầu típ, hút 10 µl dung dịch nạp mẫu, trộn đều với dung dịch DNA ở trên

 Dùng pipetman hút toàn bộ dịch vừa trộn nạp vào giếng

 Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực

 Điện di với hiệu điện thế 120V, trong 30-45 phút

 Xem kết quả bằng đèn UV Phân tích kết quả

IV KẾT QUẢ

V CÂU HỎI THẢO LUẬN

 Mục đích của việc đo mật độ quang (OD) của sợi DNA hay RNA ở bước sóng 260 và 280? Tại sao phải quan tâm đến tỷ lệ OD260nm/OD280nm?

Vì đây là đỉnh hấp thụ của acid nucleic và protein Ta dùng tỉ lệ 260/280 là để ước lượng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid

 Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm vượt quá tỷ lệ cho phép hoặc chưa đạt đến tỉ lệ cho phép thì chúng ta có thể kết luận như thế nào về mẫu DNA/RNA vừa tinh sạch được?

Chưa đạt tỷ lệ cho phép nghĩa là dung dịch bị nhiễm protein (hay phenol) Còn nếu tỷ lệ vượt quá mức cho phép nghĩa là DNA bị biến tính (hai sợi đơn tách rời nhau)

 Nêu các cách định lượng DNA/RNA theo quan điểm của anh/ chị?

Điện di: Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước Định lượng: làm lượng tương đối so với thang hàm lượng

Mật độ quang: Cho phép định lượng tương đối nồng độ cótrong mẫu nucleic acid

 So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide trong kỹ thuật điện di?

Gel agarose: có lỗ đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleic, thường nhuộm bằng ethidium bromide

Gel polyacrylamide: có lỗ nhỏ, phân tách những đoạn DNA sợi đơn có kích thước dưới 500 bp Các phân tử DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Chúng còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm màu riêng biệt

 Hãy cho biết ứng dụng một số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và polyacrylamide mà em biết trong lĩnh vực thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật

di truyền?

Gel agarose: ứng dụng trong chẩn đoán di truyền phân tử hay in dấu môi trường, lập bản đồ hạn chế DNA được tạo dòng.

Gel polyacrylaminde: dùng để phân lập các đoạn DNA

Bài 3

TÁCH CHIẾT, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA

TỪ MÔ THỰC VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP BOOM

I NGUYÊN TẮC

Việc thu nhận DNA từ mô tế bào thực vật in vitro được tiến hành thông

qua nhiều bước Các phân đoạn nhân được cô lập trong bước thứ nhất

và DNA được tách chiết trong bước thứ hai chủ yếu dựa trên kỹ thuật lytâm vùng

Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm:

Phá màng tế bào và màng nhân

Mô thực vật thường được sử dụng làm vật liệu để cô lập nhân và tách

chiết DNA vì tế bào thực vật in vitro tương đối đồng nhất về kích thước,

thích hợp cho việc phân đoạn kỹ thuật li tâm Người ta có thể phá màng

tế bào bằng phương pháp hoá học, cơ học hay siêu âm Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, tế bào được phá vỡ trong những điều kiện gần với điều kiện sinh lý bình thường (dung dịch đẳng trương,

pH sinh lý, sự hiện diện của một số ion…) Huyền phù tế bào trong môi trường vừa kể trên có tên là dịch đồng nhất (homogenate) Dịch đồng nhất được phân đoạn qua ly tâm, các bào quan sẽ được phân tách dựa vào khối lượng của chúng

Loại protein

Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần nhiễm, mà quan trọng nhất là protein, tương bào Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hoà tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) trong hai pha không hoà tan (phenol, chloroform) Một số tác nhân tách chiết thông dụng là:

Các hạt Celite: Cũng có thể tóm bát Nucleic Acid bằng các hạt Celite

mà không cần bát các protein biến tính

Kết tủa DNA (DNA precipitation)

Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid được tinh sạch nằm trong một thểtích dung dịch lớn sự tủa kết hợp với li tâm cho phép thu nhận nucleic

acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hoà lại trong nước theo nồng độ mong muốn Có các kiểu chính:

 Tủa bằng ethanol:được thực hiện ở nồng độ muối cao,

nồng độ ethanol cao (2-2,5 thể tích ethanol / thể tích dung dịch cần tủa) Nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa

 Tủa bằng isopropanol: khác với kiểu tủa trên là không

cần muối, có thể sử dụng 0,8 – 1 thể tích isopropanol/ thể tích dung dịch cần tủa Những đoạn DNA thật ngắn

dù ở nồng độ cao cũng không tủa bằng cách này nên có thể dễ dàng loại chúng

 SDS 10%

 Chloroform: isoamylalchohol (24:1)

 Dung dịch TE 10X (Tris 0,1M – EDTA 0,001M)

 Ethanol tuyệt đối

 Que thuỷ tinh đầu uốn cong

 Ống nghiệm thuỷ tinh

Bước 2

Bổ sung vào eppendorf 1,5ml (chứa L6 và Diatom) 100µl dung dịch đồng nhất, tiến hành Vortex trong 3-5 phút sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 3

Hút bỏ phần dịch nổi và chừa khoảng 200µl phần dịch cặn Bổ sung 1ml dung dịch L2 đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút Tiếp tục lặp lại bước 3 thêm hai lần nữa

15oC dung dịch TE có tác dụng bảo quản DNA

V TRẢ LỜI CÂU HỎI

1 Nêu các vai trò và cấu tạo của các hoá chất dùng trong bài như dung dịch L2, L6 hay Diatom?

Diatom thành phần gồm có: nước cất, HCl đậm đặc, hạt celite (diatome), vai trò của hạt celite là tóm bát các DNA, không bắt protein biến tính.

L2 thành phần gồm: Guanidine Thyocynate, tris-HCl, có vai trò là làm bất hoạt enzyme nuclease biến tính protein

L6 thành phần gồm: Guanidine Thyocynate, tris-HCl, EDTA, Triton

X-100, có vai trò là dung dịch ly giải làm biến tính DNA

2 Giải thích tại sao lại sử dụng L2, L6 hay Diatom trong việc tách chiết DNA?

Vì chúng có hạt celite dùng để bắt DNA, còn L2 và L6 dùng để biến tính DNA

3 Có thể thay thế mẫu gan bò thành các mẫu nguyên liệu khác không như mẫu tóc, mẫu da hay mẫu máu người?

Có vì trong các mẫu này đều có chứa DNA và RNA nhưng phải sử dụng thêm một số dung dịch hoặc một số kỹ thuật tách chiết khác nhau cho các mẫu khác nhau

4 Mục đích của việc ly tâm hay vortex nhiều lần là gì?

Vortex: để đồng nhất hoá mẫu hay dung dịch và để phản ứng xảy ra hoàn toàn

Ly tâm: dùng để phân tách các lớp rõ rang để thu dịch đồng nhất dễ

5 Nêu vai trò và tác dụng của ethanol và acetone trong tách chiết DNA

Ethanol: ethanol tuyệt đối: tủa DNA, RNA Ethanol 70%: để loại bỏ các chất tẩy (dung dịch đệm) trong khi không làm ảnh hưởng đến DNA do DNA không làm tan trong ethanol

Acetone: phá vỡ liên kết giữa Diatom và DNA