Phần A: Tách chiết DNA và thu nhận DNA tái tổ hợp
Thao tác thực hiện
- Lựa chọn nhóm vi khẩn đặc tưng trên hai đĩa Petri
- Tiến hành tách chiết và thu nhận DNA tái tổ hợp bằng phương pháp Phenol- Chloroform theo bài 1.
Phần B: Kiểm tra kết quả DNA tái tổ hợp bằng phản ứng PCR
Thao tác thực hiện
- Thiết lập phản ứng PCR trong eppendorf 0,5ml với thứ tự bổ sung các thành phần và thể tích:
• Dung dịch đệm Taq polymerase 10X cho phản ứng PCR 5µl
• Dung dịch hỗn hợp dNTPs (8mM cho mỗi loại dNTP) 2µl
• Taq DNA Polymerase (5U/µl) 0.5µl
• Mồi xuôi(10 mM /µl) 2µl
• Mồi ngược (10 mM/µl) 2µl
• DNA khuôn (10 – 100ng/µl) 9,5µl
• Nước cất 2 lần bổ sung (đến thể tích đạt 30µl) - Đặt eppendorf đã bổ sung đầy đủ thành phần phản ứng nêu trên vào máy
PCR và cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với 25 chu kỳ. - Điện di agarose và quan sát kết quả trên bàn chiếu UV soi nổi
- Những đoạn DNA tái tổ hợp sẽ có biểu hiện trên gel chụp.
IV. KẾT QUẢ
V. TRẢ LỜI CÂU HỎI
1. Kể tên một số phương pháp dùng để kiểm tra DNAtái tổ hợp.
2. Dự đoán kết quả chạy điện di DNA tái tổ hợp trên cơ sở lý thuyết. So sánh với thực nghiệm và rút ra nhận xét?
Bài 11+12:
KĨ THUẬT LAI PHÂN TỬ (DNA HYDRIDIZATION) – TÁCH CHIẾT VÀ BIỂU HIỆN DNA TRÊN PCR – TÁCH CHIẾT VÀ BIỂU HIỆN DNA TRÊN PCR
I. NGUYÊN TẮC
Biến tính và hồi tính là khả năng đặc trưng của phân tử DNA. Đồng thời khả năng liên kết giữa các base cũng cho DNA. Đồng thời khả năng liên kết giữa các base cũng cho phép 2 mạch DNA có nguồn gốc khác nhau nhưng trình tự bổ trợ liên kết nhau trong điều kiện phù hợp (nhiệt độ, pH,..) tạo nên một phân tử DNA mới.
Hai mạch đơn của DNA gắn với nhau nhờ các liên kết hydro. Khi đun nóng DNA vượt quá nhiệt độ nóng chảy hydro. Khi đun nóng DNA vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm), các liên kết hydro giữa hai mạch bị phá vỡ, 2 mạch tách rời nhau. Khi nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột thì sự bắt cặp sẽ không xảy ra. Lúc đó, DNA sẽ tồn tại dạng mạch đơn dưới cấu hình mất trật tự. Nhưng khi giảm nhiệt độ từ từ kèm theo điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại.
Hiện tượng liên kết có thể xảy ra giữa hai mạch DNA với nhau hoặc giữa 2 mạch RNA và DNA. Phân tử acid nhau hoặc giữa 2 mạch RNA và DNA. Phân tử acid
nucleic sợi kép mới hình thành được gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các base thuộc 2 mạch đơn acid quá trình kết cặp giữa các base thuộc 2 mạch đơn acid nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ trợ như vậy gọi là quá trình lai phân tử.
• Lai trên pha lỏng• Lai trên pha rắn • Lai trên pha rắn • Lai tại chỗ Lai trên pha lỏng:
Các trình tự lai nằm trong pha lỏng, là một dạng dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm. Phương pháp này được sử dụng để phát hiện các trình tự tương đồng giữa các loài hay trong một cá thể.
Lai trên pha rắn:
Một trong hai trình tự cần được cố định trên giá thể rắn (màng lai). Phát hiện phân tử lai thong qua mẫu dò (màng lai). Phát hiện phân tử lai thong qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ. Ba kĩ thuật phổ biến là: Southern blot, Northern blot, Dot blot.
Lai tại chỗ:
Trình tự acid nucleic cần tìm không được tách ra khỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.