BÁO cáo THỰC HÀNH môn CÔNG NGHỆ ENZYME

Bài 1: Nhân sinh khối Saccharomyces cerevisiae để thu nhận enzyme invertase Enzym hay enzim (tiếng Anh: enzyme) là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein. Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Sở dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzym. Như vậy, enzym là các protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), enzym sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó. Hầu hết phản ứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4 000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym. Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Chất ức chế là các phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng hoạt tính của enzym.

Bộ Công Thương Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp Hồ Chí Minh Khoa Công Nghệ Sinh Học & Kỹ Thuật Môi Trường

Báo cáo CÔNG NGHỆ ENZYME

GVHD: Cô Trần Hoàng Ngâu Sinh viên thực hiện: Nhóm 6

1 Kiều Thị Thu Thảo 2008100148

2 Phu Quỳnh Phương 2008100070

3 Nguyễn Phú Cường 2008100001

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

Bài 1: NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ĐỂ THU NHẬN ENZYMEINVERTASE

1 Nguyên tắc

1.1 Giới thiệu

Saccharomyces cerevisiae à một gi ng n m m n thuộc ộ

Saccharomycetaceae.Saccharomyces cerevisiae thường c c u tạo h nh ip,

ường ính n t – 10 nm à ường ính nh t 1 – 7 nm

T ào gia tăng ích thư c th o ộ tu i, inh ản ng h nh th c nảy chồi

hông th o qui uật, c thể xu t hiện t ng cái một, t ng ôi hoặc một chuỗi

Khuẩn ạc c màu trắng nhạt, r a tròn, ồi ên, ường ính 1 – 2 mm

Phát triển t i ưu ở 33 – 350C trong môi trường ch a 10 – 30% g uco Nhiệt

ộ t i thiểu à 40

C trong 10% glucose và 130C trong 0% g uco , nhiệt ộ t i

a à 38 – 390C (Jermini and Schmidt-Lor nz, 1987, trích t Lê Nguyễn Bảo

Trân, 200 ) C hả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HC ; pH = 1,7 trong

H3PO4 và pH = 1,8 – 2 trong acid hữu cơ, c c chịu ựng n nh t i i

acid nzoic 100 mg/ g ở pH = 2, – 4 à acid or ic 200 mg/ g ở pH = 4

(Ju n t a , 1978, trích t Lê Nguyễn Bảo Trân, 200 )

C hả năng ên m n ường g uco , ga acto , ma to , accharo , rafino

à các d xtrin ơn giản, hông ên m n acto , manito , hông ồng h a

cho chăn nuôi gia úc à nuôi trồng thủy ản nhờ c hả năng chịu ược acid

dạ dày à mu i mật t t, ề háng tự nhiên i háng inh.Ngoài ra

Saccharomyc c r i ia còn ược quan tâm nhiều trong ĩnh ực thu nhận nzym in rta ể thủy phân ường acchro thành ường nghịch

ảo

Sinh t ng n n : Quá tr nh inh trưởng à phát triển của n m m n c ng như của

các i inh ật n i chung ược chia àm 4 pha

Pha lag: giai oạn này n m m n m i ược c y ào môi trường còn chưa inh

ản S ượng n m m n ở giai oạn này hông tăng hoặc tăng hông áng ể,

nhưng ự trao i ch t của chúng ại xảy ra mạnh m T ào c ích thư c

tăng ên áng ể, hàm ượng các ch t prot in, acid nuc ic ều tăng ên, các

nzym thích ng ều ược t ng hợp mạnh m Trong môi trường càng ầy ủ

dinh dư ng gi ng n m m n c y ào càng tr h à pha ag càng ngắn Người

ta c thể c y một ượng gi ng n ào các t ào tr h àm chop ha ag càng

rút ngắn à gi ng c thể phát triển ngay au hi ti p gi ng

Pha log: trong pha này các t ào n m m n phát triển ượng t ào th o

c p nhân i t c ộ inh trưởng à cực ại

X = X0.2n

i X0 à ượng t ào an ầu

N à ần phân chia (th hệ) Kích thư c trung nh của t ào gi ng n m m n trong pha này n i chung à

nh nh t chúng còn phải inh ản t nguồn t ào ch t à t ào Đ i i các

t ào trong pha này chúng c hoạt tính inh – inh h a r t ặc trưng à chúng

r t nhạy cảm i các y u t t ợi

h n nh c n ng : trong pha og t ào phát triển ào ạt, hi các ch t

dinh dư ng trong môi trường ngày càng giảm i, hơn nữa trong môi trường

xu t hiện à tích tụ những ản phẩm trao i ch t hông cần thi t i i gi ng

nuôi c y Như ậy trong quá tr nh chát dinh dư ng cạn dần, các ản phẩm inh

ra àm cho các iều iện m t i ự thuận ợi cho inh trưởng à qua tr nh

chuyển ang pha n ịnh

Trong pha cân ng này các t ào ng n ịnh à mật ộ quần thể à t i a

C ng c nghĩa à ượng t ào inh ra ng ượng t ào ch t i

Pha suy vong: trong pha này các t ào ng giảm dần à các t ào ch t tăng

dần Các t ào ng trở nên già i, ích thư c nh ại, i n dạng à các t ào

ch t xu t hiện dạng hạt, à ị phân giả ởi các nzym prot aza nội ào Các t

ào tự phân trở nên tr ng rỗng à ên trong còn các hạt ch t o nh

êu cầu hi thu inh h i của n m m n à ượng t ào ng phải chi m

ượng n ậy ta nên thu inh h i ào cu i pha ag ể ảm ảo yêu cầu

2 Tiến t ình thí nghiệ :

Môi trường ng Han n hông cho agar trong thành phần môi trường Phân ph i môi

trường ào dụng cụ ch a, dán nhãn, ghi ngày giờ trên người pha ch H p hử trùng môi

pH : 5-6

B ung nư c cho ủ 200m , hu y tan hông un, ào c c 2 0m Sau phân ph i

ào 2 ng nghiệm cho mỗi nh m (10m /1 ng)

2.1.3 T 3 : h ôi t ờng nh n sinh khối H ns n lỏng

Cân pha 1000m môi trường Han n ng,

B ung nư c cho ủ 1000m , hu y tan, hông un, au phân ph i mỗi t 100m

ch a trong nh tam giác 2 0m

2.1.4 T 4: Chuẩn ị 4 nh tam giác 00m c ch a 400m nư c c t, ậy nút

bông, bao gói

2.1.5 T 5 Chuẩn ị 4 nh tam giác 00m c ch a 400m nư c mu i NaC

(0,8 g trong 100m ), ậy nút ông, ao g i

2.1.6 T 6 : m toàn ộ môi trường các nh m trên chuẩn ị i h p hử trùng

ở 1210C, 1 phút H p xong m môi trường của t 3, 4 à ể nguội à ảo

quản ở nhiệt ộ phòng, ử dụng au 48h

2.2 Chi ôi t ờng cho ỗi nhó

Mỗi t tự tráng ng nghiệm à ệ inh chỗ của nh m m nh

Nhận t nh m 1 10m môi trường giữ gi ng n m m n cho mỗi ng nghiệm ( mỗi nh m

Bư c 2 Nhận ng nghiệm ch a gi ng Saccharomyces cerevisiae t giáo iên

Bư c 3 c y zic zac ào 2 ng thạch nghiêng ã chuẩn ị

Lưu Quá tr nh c y r t dễ ị nhiễm nên cần chú c y nhẹ tay tránh cày nát

mặt thạch, phải ể gần ngọn ửa, c y úng quy tr nh, qu c y phải hơ cho n

hi c màu , ử dụng ao tay à hẩu trang, thao tác c y phải nhanh, d t

khoát

2.5 Nh n giống Saccharomyces cerevisiae

Bư c 1 L y 2 òng qu c y Saccharomyces cerevisiae cho ào mỗi ng

nghiệm ch a 10m Han n ng ( môi trường nhân gi ng c p 1)

Bư c 2 hu y nhẹ, nuôi c y trong 48h

Lưu Khi nhân gi ng r t dễ ị nhiễm nên ể gần ngọn ửa, c y úng quy

2.6 Nh n sinh khối

T 7 à t 8 i nhân inh h i L y gi ng c p 1 a toàn ộ inh h i ang

nh tam giác 2 0 ch a 100m môi trường Han n ng Sau nuôi c y ắc

1 0 òng/phút ở 300C trong 72 giờ

2.7 Qu n sát n n vật kính X40

Bư c 1 L y 1 phi n ính ạch nh ên 1 giọt thu c nhuộm (xanh m ty n)

Giọt hông quá to tránh tràn h i am , hông quá nh tránh tạo ọt hí hi

ậy am

Bư c 2 L y 1 òng inh h i n m m n Saccharomyces cerevisiae hoà vào

giọt thu c nhuộm Đặt 1 am át ngoài rồi hạ t t ể mẫy tràn ều N u ra

Bư c 2 Làm hô, c ịnh, nhuộm xanh m thy n

Bư c 3 Quan át ật ính 100 à ghi nhận t quả

2.9 Chụp hình và ghi nhận kết quả củ các ình, ống nghiệ

3 Giải thích thí nghiệ

- Lựa chọn môi trường Han n môi trường này dễ pha, thông dụng cho nhiều

oại i inh ật

- pH trong hoảng 5-6 ây à pH t i ưu của n m m n, c ch các iều iện

gây nhiễm c ng như i huẩn gây th i

- ệ inh ng cồn 700C hông dùng cồn 900

C hay 500C cồn c ộ càng cao

th hả năng diệt huẩn càng t t nhưng hi ộ cồn ượt quá 7 ộ th n ại

phản tác dụng hi , thay cồn thẩm th u ào t ào i huẩn, gi t

ch t i huẩn th cồn 90 ộ àm ông tụ Prot in màng t ào nên i huẩn

chuyển thành dạng ào tử c hả năng chịu ựng cao Do , t ào i huẩn

h ị tiêu diệt Còn cồn 00C th nồng ộ quá th p hông diệt ược i huẩn

- H p hử trùng ở 1210C,1 phút ây à phương pháp hơi nư c ão hoà dư i áp

u t cao tiêu diệt các nội ào tử háng nhiệt c ng như các i inh ật

- Làm tiêu ản ể quan át ở ật ính x40 cho ta i t tuỳ th o m c ộ ắt màu

mà ta xác ịnh ự ng/ ch t của i inh ật

- Làm tiêu ản ở ật ính x100 cho ta i t h nh thái n m m n Saccharomyces

cerevisiae

- C ịnh tiêu ản i mục ích gi t ch t i inh ật ể iệc ử dụng hông gây

nguy hiểm, àm i inh ật gắn chặt ào phi n ính, hi rửa nư c hông ị trôi

i, àm i inh ật ắt màu t t hơn (prot in ch t ắt màu t t hơn prot in ng)

Lưu n u c ịnh ng nhiệt th tránh hơ quá n ng gây ra i n dạng h nh

thái

- Lưu hi ử dụng nồi h p Đ nư c c t ào nồi h p a ngập cây inh Dụng

cụ au hi ao g i ỹ ưa ào nồi tránh ể quá át nhau, ật nặng xu ng dư i,

ật nhẹ ên trên Đậy nắp, hoá chặt các c th o ôi i x ng nhau tránh ị

ênh à hở, hi tháo c ng àm như ậy Khởi ộng mạch iện à iều chỉnh ề

ng cách mở an x hơi quá mạnh dễ gây rạn n t hay dụng cụ C ng

hông nên ể nồi h p nguội ạh rồi m i y dụng cụ ra, úc này nắp nồi ị

mút chặt ào mi ng ệm cao u, r t h mở Các dụng c y ra hông ược ể

ở nền gạch m n, nền á, nền xi măng ( dụng cụ ang n ng gặp ạnh dễ

, n t)

- Ưu, nhược iểm à iện phá hắc phục của phương pháp c y truyền iên tục

ưu cách àm ơn giản, chi phí th p, hiệu quả cao; nhược t n thời gian, hoá

ch t, hông gian Biện pháp giảm ần c y truyền, c y truyền trong iều iện

tăng trưởng chậm

4 Kết quả

4.2 Hai ng thạch nghiêng c y truyền gi ng Saccharomyces cerevisiae hông ị nhiễm và

một h nh ảnh thu ược ề nhân inh, h i

H nh môi trường nhân gi ng c p 2 au 72h hông ị nhiễm

Sau hi nuôi c y ắc 1 0 òng /phút ở 300C trong 72h, hi ể ắng th th y c một p cặn

màu trắng ục n m ở dư i áy nh tam giác, chính à inh h i n m m n, ồng thời

môi trường ị ục do c nhiều t ài n m m n hông ắng xu ng áy mà n m ơ ửng

trong môi trường nuôi c y K t quả nuôi c y hông ị nhiễm

4.3 Quan át dư i ính hiển i ở ật ính x40

4.4 Quan át dư i nh hiển i ở ật ính x100

Th o như t quả quan át h nh thái n m m n ở ật ính 40 à ật ính 100, ta

th y r ng các t ào n m m n Sacchromyces cerevisiae c dạng h nh ầu dục, t ại i

nhau thành t ng cụm t ào Sau hi nhuộm ng xanh m thy n ta th y c những t

ào ắt màu i thu c nhuộm à những t ào ch t, ồng thời c ng c những t ào

hông ắt màu i thu c nhuộm à những t ào ng

Khi o ánh t quả nhuộm ở ật ính 40 à ật ính 100 i nhau, ta th y tỉ ệ các

t ào ng t ào ch t hác nhau Cụ thể à ở ật ính 40 c tỉ ệ t ào ng t ào

ch t cao hơn t quả nhuộm ở ật ính 100 (c nhiều t ào hông ắt màu i thu c

nhuộm xanh m thy n ) Điều này ược giải thích do trong quá tr nh nhuộm ở ật ính

100, au hi cho dịch n m m n ên am ính th tiêu ản ược ể hô rồi au m i ược

nhuộm ng xanh m thy n Khi ể hô các t ào n m m n ị m t nư c nên ch t

Còn ở ật ính 40, ta hông c ư c àm hô tiêu ản nên t nào hông ị m t nư c

Chính ậy, tỉ ệ t ào ch t ở ật ính 100 nhiều hơn ở ật ính 40 Do hi quan

át ở ật ính 100 ta th y ượng t ào ắt màu i thu c nhuộm xanh m thy n

nhiều hơn hi quan át ở th u ính 40

5 Kết quả - kiến ngh

- Quan át ược h nh thái của n m m n c ng như à ự ng của chúng dư i

ính hiển i Đồng thời c y truyền hông ị nhiễm

6 T ả lời c u hỏi cuối ài

6.2 Quy t ình ử tế ào n n

- Quá tr nh tách à rửa n m m n c thể thực hiện trong các phương pháp au

ây

- Rửa n m m n trong hệ th ng gồm 2 thi t ị ng phương pháp hòa ta gián

oạn ao gồn 3 giai oạn

+ tách n m m n h i dịch

+tách n m m n t nư c rửa 1 à 2

+ y tâm ần ần các phần trên

- tách n m m n ng cách y tâm 3 ần au mỗi ần y tâm mật ộ n m m n

cao hơn trong inh h i thu ược

- N m m n au hi y tâm gọi à n m m n dạng nhão

- Còn ch a nhiều nư c ở dạng tự do

6.3 So sánh khi qu n sát vật kính 40 và 100 có gì khác nh u

- ật ính x40 hay còn gọi à ật ính thô

- ật ính x100 hay còn gọi à ật ính dầu

- ật ính hô à ật ính dầu hác nhau ở ch t mà ánh ang phải i qua tiêu

ản à ật ính Ở ật ính hô ch t i qua à hông hí mà chỉ húc xạ của

hông hí à n=1 r t hác o i chỉ húc xạ của thuỷ tinh n=1, , do các

tia áng hi ra h i tiêu ản ị phản xạ à phần ngoài của chùm ang hông

ọt ược ào ật ính Bên cạnh , ật ính x40 ể quan át coi t ào nào

ng ch t, còn x100 à quan át h nh thái n m m n

6.4 ứng dụng củ nzy inv t s

- In rta à oại nzym ược ử dụng trong qui mô n, dư i dạng nzym c ịnh

===> Sản xu t Sirô àng ng nzym In rta của n m m n

Cách ti n hành

- Các t ào n m m n tự hủy à ản phẩm của ự thự hủy ược àm ạch ng cách

iều chỉnh pH ề 4.7, au ọc qua p Ca cium Su phat à h p thụ trong than xương

- Một p than xương c ch a In rta ược thêm ào trong than xương ang ược ử

dụng ể hử màu của Sirô Ch phẩm này r t n ịnh, các y u t gi i hạn thường à ự

ngoại nhiễm i inh ật hoặc hử màu hông t t, ít hi à m t hoạt tính nzym, ản phẩm

hông c mùi ị tinh t như quá tr nh ử dụng nguyên iệu ược thủy giải ng acid (ð Sử

dụng nzym c ịnh)

Khi ử dụng nzym tránh ược những n ề mà phương pháp Acid thường gặp phải

à màu ậm, nồng ộ mu i à tro cao, hiệu u t chuyển i tương i th p N u

In rta tự do c thể ược ử dụng (thời gian phản ng hoảng 1 ngày) th iệc ử dụng

nzym c ịnh (thời gian phản ng hoảng 1 ngày) àm cho qui tr nh ản xu t trở nên

cạnh tranh hơn c thể ản xu t 16 t n Sirô nghịch ảo ng cách ử dụng 1 ít nzym hạt

-Enzyme này còn dùng ể ản xu t ường nghịch ảo ( oại ường dễ hòa tan hơn o i

fructo tự do à ngọt hơn o i ường acccharo ) Ở Nga, hi sả xuấ các ản phẩm

ánh ẹo người ta ử dụng enzyme invertase

BÀI 2 TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

INVERTASE TÁCH TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1 Nguyên tắc:

In rta tên hoa học à – D – fructofurano id fructohydro a ( C 3.2.1.26)

à một oại nzym thuỷ phân accharo thành g uco fructo ( tỷ ệ mo 1 1 ), còn

ược gọi à ường nghịch ảo

Invertase Saccharomyces gồm hai oại

 In rta nội ào c trọng ượng phân tử hoảng 13 000 Da

 In rta ngoại ào c trọng ượng phân tử hoảng 270000 Da

Phản ng thuỷ phân accharo do nzym in rta xúc tác

Lượng g uco tạo thành phụ thuộc ào hả năng phân cắt của nzym Người

ta ti n hành ịnh ượng g uco inh ra au thuỷ phân th o nhiều phương pháp hác nhau

ể i t ược hoạt ộ của nzym

há v tế ào thu nzy :

Các protein enzym nội ào c thể tồn tại ở dạng hòa tan trong t ào ch t à các

ào quan (nhân, micro om , mitochondria ) của t ào T ào ược ao ọc ng

một p màng L p màng này ở i huẩn ôi hi r t ền à dày Người ta còn th y nhiều

protein enzyme liên t r t chặt ch i các ào quan của t ào Các phân tử prot in

nzym hông c hả năng i qua màng của t ào à màng của các ào quan của t ào

Do ể c thể chi t rút các prot in nzym nội ào, ư c ầu tiên à phải phá c u

trúc của các t ào c ch a prot in nzym à chuyển chúng ào dung dịch Để thu nhận

nzym nội ào, người ta phải phá t ào ng nhiều phương pháp như

 Phương pháp cơ học nghiền i, nghiền c ch t trợ nghiền như ột thuỷ

tinh, cát thạch anh, ồng hoá ng thi t ị ồng hoá

 Phương pháp hoá học dùng các oại dung môi, uty ic, ac ton ,

glycerol,ethylacetate

 Phương pháp ật dùng ng iêu âm

C a h hăn hi tách nzym h i t ào cần h t c ưu

 Enzym c trong t ào i inh ật i ượng hông n o i các thành

phần hác Do , iệc tách à thu nhận thành phần nh này à iều r t h hăn

 nzym à ch t hữu cơ hông ền, dễ ị i n tính hi ị tác ộng của các

y u t ên ngoài

 nzym à prot in Prot in nzym uôn i cùng các oại prot in hông

phải nzym nhưng ại c tính ch t hoá r t gi ng prot in nzym Do , iệc tách prot in – nzym hông phải úc nào c ng ạt ược t quả t t à hông phải hông gặp h hăn nh t ịnh

Phương pháp tự phân

Trong quá tr nh tự phân n m m n, hệ nzym c n trong t ào n m m n ược hoạt hoá Chúng xúc tác phản ng phân giải các ch t c trong thành t ào

n m m n à giải ph ng nzym in rta ra ngoài t ào Sau , ng phương

pháp y tâm, oại các thành phần hông phải nzym in rta

Phương pháp phá ng ng iêu âm

S ng iêu âm tạo rung ộng mạnh phá ách t ào, giải ph ng nzym

in rta ra ngoài

h ng pháp cid dinit os licylic NS :

Mẫu thuỷ phân accharo ( ường hông hử ) thành g uco ( ường hử) à

fructo ( ường hử) nhờ ự xúc tác của nzym in rta ược ử dụng ể xác ịnh

hàm ượng g uco ng phương pháp DNS, t xác ịnh ược hoạt ộ của nzym

invertase

Phương pháp DNS dựa trên cơ ở phản ng tạo màu giữa ường hử i thu c thử

acid dinitro a icy ic (DNS) Cường ộ màu của hỗn hợp phản ng tỷ ệ thuận i nồng ộ

ường hử trong một phạm i nh t ịnh So màu ti n hành ở ư c ng 40nm Dựa th o

ồ thị ường chuẩn của g uco tinh hi t i thu c thử DNS tính ược hàm ượng

ường hử của mẫu nghiên c u

Phương tr nh tạo màu giữa ường hử à DNS acid

2 Tiến hành

a Thu sinh khối n n

Dịch n m men nhân sinh kh i em i ly tâm lần 1 (4500 vòng/phút) trong

10 phút, loại dịch trong, thu hồi sinh kh i n m men

Xác ịnh hoạt tính enzyme invertase

Định lượng ường khử

b ng phương pháp acid dinitrosalicyli -c (DNS)

Dựng ường chuẩn và xác ịnh hàm lượng ường

Tính hoạt tính enzyme invertase

Phương pháp tự phân

Phá ng sóng siêu

âm

trong 10 phút ể thu nhận sinh kh i n m men Rửa b ng nư c c t vô trùng theo tỉ ệ 1/3 (w/w) và giữ lại sinh kh i n m men

Bảo quản sinh kh i n m men ở 16-200C (ngăn mát của tủ lạnh)

b há tế ào dung d ch nzy thô

Phương pháp tự phân (Làm trư c 48 giờ theo phân công ở phụ lục)

Trong quá trình tự phân n m men, hệ enzyme tự phân có s n trong t bào

n m men ược hoạt hóa Chúng xúc tác phản ng phân giải các ch t có trong thành

t bào n m men và giải phóng enzyme invertase ra ngoài t bào

Cân 1g sinh kh i n m men cho vào dung dịch ệm acetate pH = 5.5 theo tỷ

ệ 1/6 (w/w) ể thực hiện quá trình tự phân Để trong tủ m 450C trong 50 giờ Sau

quá trình tự phân, mẫu ược ly tâm (5000 vòng/phút) trong 10 phút ể tách b phần

không tan, phần dịch l ng thu ược là ch phẩm invertase thô Sử dụng dịch

enzyme này ể xác ịnh hoạt tính

c Xác nh hoạt tính nzy inv tase

- Hút 4ml dung dịch ệm acetate pH = 4,5; 4,6 ml nư c c t và 0,4ml dịch

ch a enzyme cho vào bình tam giác 100ml

- Thêm vào 1ml dung dịch ường Saccharose nồng ộ 2%

- Lắc ều, ể yên cho phản ng xảy ra ở iều kiện phòng trong 15 phút

- Đun cách thủy trong 2 phút và làm lạnh dư i vòi nư c → mẫu thủy phân

dùng ể xác ịnh hàm lượng ường glucose b ng phương pháp DNS, t ó suy ra s

mol Saccharose ã bị thủy phân

d Dựng ờng chuẩn và xác nh hàm l ợng ờng

- Cho vào 6 ng nghiệm sạch v i các ch t có thể tích như bảng sau:

Hút 1ml t ng 1 n ng 6 vào 6 ng nghiệm tương ng khác,

ng mẫu giữ nguyên Thu c thử DNS

(ml)

3

Đo mật ộ quang ở bư c sóng 540 nm v i ng 1 ể chỉnh OD = 0

V ường chuẩn glucose v i trục tung là mật ộ quang (OD540nm), trục

hoành là nồng ộ glucose

Tìm phương trình biểu diễn ường chuẩn dạng y = ax + b v i y =

OD540nm; x = [glucose] (%) và hệ s tương quan R2 nhờ phần mềm Excel

Chú ý: ti n hành các mẫu dựng ường chuẩn và mẫu thí nghiệm ồng thời

2.3.3 Tính hoạt tính enzyme invertase

• T phương trình ồ thị ường chuẩn tính ược X (mg/ml) ường khử

trong dung dịch ường pha lõang

- Nhân v i hệ s pha lõang n ể ược lượng ường trong 1 ml dung dịch g c

Dùng gi y nhôm bịt kín ầu các ng nghiệm Đặt vào nồi nư c ang sôi trong 5 phút Làm lạnh n nhiệt ộ phòng

V = thể tích dịch ường g c (ml)

m = kh i lượng mẫu cân (g)

Một đơn vị hoạt tính invertase là lượng enzyme cần thiết để thủy

phân 1micromol đường Saccharose trong 1 phút ở điều kiện pH 4,5 và nhiệt độ

30 o C

2 Giải thích thí nghiệ

Xác ịnh hoạt ộ nzym i ng mẫu c ản ch t an ầu à t ào n m m n tự phân,

hỗn hợp au hi tự phân c thành phần các ch t n m trong t ào n m m n ượng

glucose, fructose, investase

Hỗn hợp m i y tâm thu in ta thô Hút 0,4m in ta thô+4,6m nư c+4m

ax tat m i gia nhiệt ể xảy ra phản ng, g uco t accharo ẫn trong in ta thô

mà accharo dư i tác dụng của nzym in ta thuỷ phân g ucose và fructose, làm

ạnh ể d ng phản ng

Ti p tục y 1m trong ng trên cho ào 3m DNS oạ g uco thêm DNS gia nhiệt ể

phản ng xảy ra giữa ường g uco à DNS (ch t thử DNS mang tính tương i à chỉ

nhận diện g uco ) au ngâm ạnh ể ng ng phản ng

Để tính hoạt ộ nzym ta phải xác ịnh hàm ượng ường ta c tỷ ệ phản ng

acchraro tạo ra ường g uco à fructo à 1 1 1, ở ây ta tính ượng nzym c

trong ường, dựa th o phương pháp dùng thu c thử DNS mà trong hi thu c thử phản

ng tương i i g uco

3 Kết quả:

4 Kết quả- kiến ngh

K t quả

- Tách chi t à thu nhận in rta t inh h i Saccharomyces cerevisiae

- Xác ịnh hoạt tính của in rta thô ng phương pháp ường hử DNS

5 T ả lời c u hỏi cuối ài

5.1 Chứng inh công thức tính hà l ợng ờng t ong nguyên liệu = X.V.n/m

-Tính trong 1m nguyên iệu ta c

m e Glu  

=m Glu

-Tính trong m nguyên iệu

n V

 m Glu=[Glu].Vnl.n

- Trong m(g) hàm ượng ường tương ng à

nl nl nl

glu

m

n V glu

y=OD x=[glucose] xy 2

) (xx

* 0322 , 0 3128 , 0

*

0322 , 0 40

) 30

* 564 , 1 (

* 5

1 672 , 10 )

(

)

* (

* 1

y

b

x x

y x

n xy

a

, 0

1196 , 0 491 0

ml mg

 Hàm ượng ường nguyên iệu

) / ( 11534 1000

* 534 11 1000

S mo ường g uco tạo thành au quá tr nh thuỷ phân

mol M

m n

e glu

e glu e

ậy S mo accharo ã ị thuỷ phân à 0.064 mo = 64000 micromo

Mỗi ơn ị hoạt tính in rta à ượng nzym cần thi t ể thuỷ phân 1 micromo

ường Saccharo trong 1 phút ở iều iện pH 4 à nhiệt ộ 300

C

1UI = 1 micromol Saccharose

 64000 micromol Saccharose = 64000 UI

5.4 Các ớc thu nhận dung d ch inv t s : c 2 phương pháp ược tr nh ày ở

dư i nhưng ở ài thực hành tại p chỉ ử dụng phương pháp thu dịch nzym thô ng

phương pháp tự phân

h ng pháp tự ph n

u : ph i trộn inh h i n m m n i dung dịch ệm ac tat th o tỷ ệ 1/6 ( / )

men

Acetate

pH = 5.5

0 –

–

không tan

(invertase thô)

h ng pháp phá ng sóng siêu

u :

 Ph i trộn inh h i n m m n ào nư c c t ô trùng th o tỷ ệ 1/6 (w/w)

 Dùng ng iêu âm ở tần 3 % của 7 0 MHz trong 10 phút

men

–

(invertase thô)

BÀI 3 TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

BROMELINE

3.1 Nguyên tắc

Khái quát enzyme bromelin:

Brom in à tên gọi chung cho nh m nzym thực ật ch a nh m u fhydry , c

hả năng phân giải prot in thu nhận t họ Brom iac a , ặc iệt à ở cây d a (thân à

trái)

Brom in à nzym thuỷ phân prot in, n phân cắt prot in trong cơ thể inh ật

Một trong những ợi ích của n ược chú n à một ch t giúp cho tiêu hoá n hoạt

ộng ở môi trường acid trong dạ dày à cả trong môi trường iềm ở ruột non Brom in

c thể thay th ược cho cả những nzym tiêu hoá hác như p p in à tryp in Brom in

c tác dụng háng iêm , giảm au

Brom in chi m 0% prot in trong quả d a N c hả năng thuỷ phân há mạnh

à hoạt ộng t t ở pH t 6 – 8 Brom in c hoạt tính xúc tác phân giải prot in tương tự

như papain trong mủ u ủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung nzym rom in c trọng

ượng phân tử hoảng 33.000 Da, n g p 1, ần o i papain

Nguyên tắc chọn t ái dứ cho hiệu quả thu nhận o lin có hoạt tính c o:

Thịt quả d a chỉ c hoạt tính nzym rom in ể t a tháng trư c hi chín, trong

hoạt tính rom in cao nh t à hoảng 20 ngày trư c hi chín Khi trái chín, hoạt tính

brom in giảm xu ng Khi chọn d a àm thí nghiệm th nên chọn quả còn xanh, n úc

àm thí nghiệm m i ti n hành gọt , hông nên dùng quả chín à ã chuẩn ị n như

ậy quả ít nzym à nzym ị m t hoạt tính à ẫn tạp ch t

Nguyên tắc lọc thu nhận enzyme bromelin thô:

Lọc à quá tr nh dung dịch ng chảy qua một màng ọc ể tách các thành phần

trong ch t ng Sự phân tách các thành phần trong dịch ọc phụ thuộc ào ích thư c

ỗ trên màng à trọng ượng phân tử ch t th m qua

Nguyên tắc kết tủ enzyme bromelin:

Điểm ẳng iện của a prot in th p hơn pH 7, do trong iều iện inh ,

các phân tử prot in c tích iện âm th a à chính những iện tích âm th a này ã t hợp

i các ầu mang iện tích dương của phân tử nư c hữu cực (ở trong dung dịch, prot in

iên t i một ượng n nư c ) c ng như các ion dương Sự t hợp i nư c tạo ra

một p nư c ao xung quanh phân tử prot in à cản trở ự t tủa của chúng Đ i i

nzym prot in c ng như các prot in nzym hác, ể c thể t tủa ược nzym , iều

cần thi t à phải phá p nư c iên t xung quanh phân tử này ng cách ung ào

dung dịch prot in nzym các dung môi hoặc các hoá ch t ưa nư c c ái ực i nư c

mạnh hơn prot in ể ôi o nư c ra h i phân tử prot in , giúp cho prot in tủa xu ng

Các dung môi thường ược ử dụng ể t tủa rom in à ac ton à thano , còn

các hoá ch t hác như các mu i trung tính ở nồng ộ cao c ng c thể t tủa ược

enzyme

Nguyên tắc kết tủ o lin ng dung ôi hữu c :

Bromelin trong dung dịch nư c r t nhạy cảm i các dung môi hữu cơ, do , ể

ự t tủa ạt hiệu quả cao thường ti n hành quá tr nh t tủa trong iều iện ạnh Như

ậy, nư c p t trái d a phải ược àm ạnh ở 0 – 4 0C à hỗn hợp rom in – ethanol

c ng phải giữ ở iều iện nhiệt ộ ạnh

Nguyên tắc kết tủ o lin ng uối:

nư c (c thể ạt 720g/ , ở nhiệt ộ 250C), ít àm m t hoạt tính nzym , thậm chí còn c

tác dụng àm ền nzym Một ưu iểm nữa của mu i amoni unfat à c hả năng t

tủa chọn ọc p ot in, do oại ược nhiều prot in hông mong mu n trong dịch

chi t Lưu hi ử dụng amoni unfat à phải ung ào dịch chi t nzym một cách

t t , t hợp hu y ều ể tránh hả năng tăng quá nhanh cục ộ của nồng ộ mu i, àm

m t i tính t tủa chọn ọc của n , thậm chí c thể àm i n tính một nzym m

ền Hạn ch của phương pháp ử dụng amoni unfat chính à m t nhiều thời gian, do

nồng ộ amoni unfat cao nên tỷ trọng của dung môi n, ể t tủa ược các prot in

cần phải y tâm ở t c ộ cao à nhiệt ộ th p, au cần oại mu i h i ch phẩm hi

chuyển ang ư c tinh ạch ti p th o (GS.TSKH P ạ T ị Trâ C âu PGS.TS P

Tuấ Ng ĩ Cô g Ng ệ Si H ập 3 E z và ứ g ụ g NXB Gi Du Việ N

2009)

Sử dụng ammonium u fat i nồng ộ ão hoà à 0.7 ( 70% ão hoà ) ể àm tác

nhân t tủa rom in Sự t tủa i tác nhân ammonium u fat ( ặc iệt ở nhiệt ộ

th p) à một quá tr nh thuận nghịch Mu i ammonium u fat a àm trung hoà iện ( do

các ion tương hỗ i các nh m tích iện trái d u) , a oại p hydrat của phân tử

prot in Lưu Để c mu i (NH4)2SO4 bão hòa 70%, ta ph i trộn i tỷ ệ 47,2g mu i

trong 100m nư c thơm

Nguyên tắc khảo sát o lin qu khả năng thuỷ ph n c ch t p ot in:

Gi ng như các c u trúc xúc tác inh học hác, rom in c ng chịu ảnh hưởng ởi

cơ ch t Trên những oại cơ ch t hác nhau, rom in c hoạt tính hác nhau N u cơ

ch t à h mog o in th hả năng phân giải của rom in mạnh hơn papain 4 ần N u cơ

ch t à ca in th hoạt tính của rom in tương tự như papain

thuyết o ật ộ qu ng O

Ta c ộ truyền qua (T-transmittanc ) à giá trị c ược hi chi u một chùm tia

áng ơn ắc c cường ộ I0 qua một dung dịch c chiều dày (cm) Sau hi ị dung dịch

h p thụ, cường ộ chùm tia còn ại à I ộ Truyền qua tính dư i dạng % th o công th c

(%) 100

0 



I

I T

Độ h p thụ (A-A or anc ) còn ược gọi à mật ộ quang (D) hoặc ộ tắt ( )

ược tính th o công th c

I

I T T

l

lg lg

 (Trần Tử An, H a phân tích tập 2)

2 Tiến t ình thí nghiệ :

Tổ 3: D a gọt , b lõi, cân kh i lượng m (g), xay nh b ng máy xay sinh t ọc

qua vải màn 2 l p 1 lần, qua bông 1 lần, b cặn, thu dịch ly tâm 4500 vòng /10

phú thu V ml dịch lọc thô có ch a bromeline Chia về các t , mỗi ổ 50 ml

thực hiện 3 thí nghiệm: 10ml dành cho thử hoạt tính, 20ml dành cho tủa b ng

Ethanol, 20ml dành cho tủa b ng mu i (NH4)2SO4

Dùng 4ml dd enzyme thô

Lưu ý: Ph i trộn cồn v i dịch d a theo tỉ ệ 4:1 (1 d a : 4 cồn)

Dùng 4ml dd enzyme thô

Ta ư c thẩm tích hông c ủ iều iện àm

Lưu ý: Để có mu i (NH4)2SO4 bão hòa 70%, ta ph i trộn v i tỷ ệ 47,2g

mu i trong 100ml nư c thơm

Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban ầu

Khảo sát hoạt tính enzyme

Thực hiện 3 ng nghiệm theo như bảng sau:

Hình 3 ống khi ch lọc

3 Giải thích thí nghiệ

Dung d ch Ống

Tyrosin (ml)

Ống mẫu (ml)

Ống không (ml)

Dung dịch Hb 2% trong ệm

phosphate

Dung dịch H  cơ ch t Đệm pho phat giúp n ịnh pH

Để yên trong phút ở nhiệt ộ phòng ể phản ng xảy ra Acid Trichlororacetic 5% ể ng ng phản ng, ng mẫu hông cho TCA

ây à ng mẫu phải ể phản ng diễn ra th o quy tr nh nh thường

Dung dịch HCl 0.2N Cho HC ào ể tăng t c ộ phản ng giữa

nzym à cơ ch t ; ng Tyro in hông cho HCl vì HCl tan trong Tyrosin

Dung dịch Tyrosine 1/400N Giúp tăng t c ộ phản ng giữa nzym

à cơ ch t hông cho ào ng mẫu à

ng hông 2 ng trên m i thêm HC vào mà HCl hoà tan tyrosine

Dịch thơm có ch a enzyme

Bromeline

Cung c p nzym ào ng mẫu

Lắc ều ể hỗn hợp trộn ều i nhau

Để yên nhiệt ộ phòng trong 10 phút ể gây tủa