Bài giảng thực hành kỹ thuật di truyền

Bi ging Thc hnh K thut di truyn LI M U õy l ti liu hng dn k thut, giỏo trỡnh ny ng nhiờn gii thiu cỏc bc k thut thng c thc hin di truyn v sinh hc phõn t Nhng quan trng hn l thụng qua cỏc bc k thut c th giỳp ngi hc nm c nhng im c bn v nghiờn cu phỏt trin sinh hc phõn t c cỏc nh nghiờn cu nhiu th h sỏng to v thc hin quỏ kh Nh nhng kt qu nghiờn cu ú, chỳng tụi ó v li bc tranh ton cnh v th gii nh ó c khỏi quỏt húa nhiu ti liu sinh hc v cỏc thớ nghim thc hnh Mong mun ca ngi biờn son l ngi hc nm c nhng im ct yu ca k thut di truyn v sinh hc phõn t Trờn c s ú phỏt trin nhng k thut s ci tin nhng bc hoc quy trỡnh cho phự hp vi thc tin nghiờn cu Vi nhng yờu cu cao bao quỏt c lch s phỏt trin ln cp nht húa kin thc, vic biờn son mt giỏo trỡnh thc hnh v lnh vc ny gp rt nhiu khú khn Tuy vy, chỳng tụi c gng a vo ti liu ny nhng liờn quan n thc hnh sinh hc phõn t chn lc t nhng thnh qu m nhiu nh nghiờn cu ó mụ t nhiu bi bỏo chuyờn ngnh liờn quan sinh hc, mt s thuyt trỡnh hng dn ca mt s hng cung cp thit b nghiờn cu sinh hc cng nh t kinh nghim cỏ nhõn Nhiu k thut v "thc n" c th gii thiu ti liu ny rt c nhm giỳp ngi hc trỏnh nhng quan nim n gin húa ng nghiờn cu khoa hc Nhng "thc n" mi liờn quan c gii thiu nhiu di dng khỏi quỏt Ngi hc cn lu ý rng hu nh tt c nhng "thc n" c a u l kt qu ca kinh nghim nghiờn cu v suy lun khoa hc ca cỏ nhõn quỏ trỡnh "ti u húa" Vỡ vy, ngi lm thớ nghim cú th ci tin cú kt qu tt hn phự hp iu kin ca mỡnh Khú khn khỏc m vic biờn son gp phi l yờu cu dung lng giỏo trỡnh 60 tit hn ch s lng trang in cng nh cỏc k thut c chn lc bự li, hc viờn cn tỡm nhiu ni dung b tr cỏc giỏo trỡnh lý thuyt liờn quan b sỏch ny, nh "Nhp mụn sinh hc phõn t", "Cụng ngh sinh hc", "Cụng ngh DNA tỏi t hp", "Cụng ngh chuyn gen ng vt, thc vt" v "Cụng ngh protein" Tuy nhiờn, cỏc k thut c gii thiu cng khụng th trỏnh s bun t ca cỏc th nghim, tuyn chn kt qu th nghim, sng lc sn phm, dựng sn phm ny lm nguyờn liu cho cỏc th nghim tip theo Bờn cnh ú, dự c chun b khỏ k cng, chỳng tụi khụng trỏnh sai sút, rt mong c nhn s gúp ý xõy dng ca cỏc ng nghip v ngi c B MễN CễNG NGH SINH HC - KHOA CNSH & KTMT Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn Bi 1: MT S THIT B THễNG DNG V CC THAO TC C BN I Mễ T V CCH S DNG MT S DNG C TH NGHIM Ngoi cỏc dng c thng dựng cho cỏc thao tỏc vi sinh, sinh hoỏ nh dng c thu tinh (ng nghim, ng hỳt, becher, a petri), que cy, giỏ ng nghim, thao tỏc sinh hc phõn t, ngi ta cũn s dng mt s dng c c trng sau: - ng eppendorf: l loi ng nghim bng nha polythylene hay polypropylene, dựng cha nhng th tớch dung dch nh Cú nhiu c th tớch 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml Cỏc eppendorf cú th c hp kh trựng iu kin thụng thng (1atm, 1200C, 20 phỳt), chu c nhit thp (-200C) v cỏc dung mụi hu c nh chloroformTrong nhng thớ nghim cn an ton cao, trỏnh s tht thoỏt mu cha, ngi ta s dng eppendorf cú ngn an ton - Micropipette (pipetman): l dng c dựng thu nhn nhng th tớch nh, cn chớnh xỏc cao; thng c chia thnh c tu theo th tớch dung dch ti a cho mi ln hỳt: + C nh: th tớch ti a 10l - 20l - 50l (0,5 -10l hoc 50l) + C trung bỡnh: th tớch ti a 100l - 200l (10-100 l hoc 20-200l) + C ln: th tớch ti a 1000l (100-1000l) + C rt ln: th tớch ti a 5000l (ớt s dng) * Lu ý: Cn thn trng hỳt cỏc dung mụi hu c, khụng gn ngun nhit (ốn cn), khụng hp kh trựng (tr cú ch nh cu hóng sn xut), tuyt i khụng iu chnh di ngng ti thiu v trờn ngng ti a cho phộp - Cỏc micropipette luụn luụn c s dng vi cỏc u tip Cỏc tớp ny thng ch c s dng ln v cng gm loi tng ng vi kớch c ó nờu Cỏc tớp c tit trựng bng hp kh trựng iu kin thụng thng II MT S NGUYấN TC PHA HểA CHT Hoỏ cht c pha vi nc ct hai ln v kh trựng iu kin thụng thng i vi mt s hoỏ cht khụng th trựng bng nhit, vic trựng c tin hnh vi nhng phin lc cú ng kớnh l lc l 0,2l hoc 0,45l Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn Cỏc dung dch thng c pha v bo qun di dng m c (dung dch m) Dung dch m c loóng vi nc ct hai ln kh trựng t nng cn mi ln s dng Dung dch ó pha cú th bo qun nhit phũng thớ nghim, nhit C hoc nhit lnh sõu -200C theo khuyn cỏo cho tng loi hoỏ cht Dung dch bo qun -200C thng c phõn thnh nhng phõn on nh Mi ln s dng ch cn gii ụng mt phõn on Lu ý: Cỏc loi hoỏ cht dựng thao tỏc vi acide ribonucleic thng c riờng, khụng ln ln vi loi hoỏ cht dựng cho cỏc mc khỏc Ngi thao tỏc phi mang gng tay tip xỳc vi cỏc bỡnh cha hoỏ cht Trong lỳc thc hin thao tỏc cõn, tuyt i khụng dựng dng c mỳc m trỳt trc tip vo bỡnh cha hoc giy bc Chun b cỏc dung dch gc Dung dch m khỏc ú cú dung dch m s dng cho in di nờn ch thnh dung dch gc cú nng cao cn thỡ pha loóng hay hn hp rt tin li Di õy l mt s dung dch nờn pha sn dng dung dch gc 1) Tris-HCl 2M (pH 7,5): 121,1 g/500 ml, hoc 1M: 121,1 g/1.000 ml Trizmabase (ca Sigma ) cn iu chnh pH cn phi thờm lng ln HCl, vỡ vy ú nhit dung dch tng lờn Khi nhit tng pH ca dung dch gim, nhit gim pH dung dch tng Cho nờn cn iu chnh pH n gn mc cn thit (pH 7,5), ngui n nhit phũng ri iu chnh pH cho ỳng Sau ú cn hp cao ỏp tit trựng 2) NaCl 5M: 146,1 g/500 ml nc ct Hp cao ỏp tit trựng 3) EDTA 0,5M (pH 8,0): pha 93,05 g Na2EDTA.2H2O vo khong 400 ml nc ct, va khuy va thờm NaOH tinh th t n pH 8,0 ri thờm nc cho 500 ml Nu pH khụng t n gn 8,0 th nhit ph.ng EDTA khụng tan Hp cao ỏp tit trựng 4) SDS 10% hoc SDS 20%: h.a tan SDS nc ct 65oC sau gi x lý, lc qua lc vi khun tit trựng 5) SSC 20ì (standard saline citrate m 20 ln): NaCl 175,3 g, sodium citrate 88,2 g, pha nc cho lớt, chnh bng NaOH 0,1N hoc HCl 0,1N n pH 7,0 Hp cao ỏp tit trựng (SSC 1ì l dung dch NaCl 0,15M vi sodium citrate 0,015M) 6) MgCl2 1M: h.a tan 20,3 g MgCl2.6H2O vo 100 ml nc Lc kh trựng Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn 7) NaOH 10N: 200 g/500 ml Bo qun l cht 8) DTT (dithiothreitol) 1M: 3,09 g/20 ml hoc DTT 0,5M: 3,09 g/40 ml Lc kh trựng Chia nh ng 0,5 ~ ml bo qun 20 C 9) Nucleotide triphosphate: ch thnh dung dch bo tn 10 ~ 100 mM, pha nc thnh dung dch cú lng nhiu hn lng cn dựng chỳt ớt Dung dch ny cú tớnh acid nờn cn thờm bt Tris-base cho n pH trung tớnh bng cỏch kim tra giy o pH Ly mt phn kim tra OD bc súng cú hp th cc i iu chnh nng chớnh xỏc Cỏc nucleotide cú bc súng hp th cc i nh bng sau: Bo qun 20 C 10) TBE 20ì: Tris 121,1 g, Na3EDTA.3H2O 8,2 g, boric acid 60 g, pha nc cho lớt, pH s khong 8,2 Khụng cn iu chnh pH Lng trờn tng ng vi: M Tris, 20 mM Na3EDTA v 0,97 M boric acid Dung dch ny dựng cho in di gel polyacrylamide 11) Howly 20ì: Tris 96,9 g, trisodium acetate 54,4 g, Na3EDTA.3H2O 3,7 g iu chnh pH bng acetic acid Hp cao ỏp dit trựng (Tng ng: 0,8 M Trisacetate (pH 7,8), 0,4 M sodium acetate, 20 mM EDTA) 12) Sodium acetate 3M (pH 5,2): trisodium acetate 81,62 g, pha vo 200 ml nc Dung dch s cú pH 5,2 III- MT S THIT B THễNG DNG Mỏy lc n nhit: c s dng cho cỏc phn ng cn nhin n nh (phn ng enzyme, lai) Mỏy bao gm mt b nc cú nhit iu chnh c i kốm vi b phn lc T cy vụ trựng: c s dng cn thao tỏc iu kin vụ trựng T cy phi luụn c gi sch, gi cho b mt khu vc thớ nghim bng cỏch kh trựng bng cn 70o Trc v sau s dng, phi trựng bờn t bng cỏch bt ốn t ngoi ớt nht 15 phỳt Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn 3- Mỏy li tõm: dựng phõn tỏch v thu nhn cỏc phn t khỏc mt dung dch v c iu chnh cỏc mc ly tõm khỏc tựy theo mong mun ca ngi s dng Nguyờn tc: S phõn tỏch cỏc phn t khỏc mt dung dch c thc hin da trờn tc lng khỏc ca chỳng di tỏc ng ca mt lc li tõm Tu thuc vo c im dựng phõn tỏch (khi lng hay t trng ca cỏc phn t vt cht) m ngi ta chia lm hai loi: Li tõm phõn on v li tõm ng t trng Li tõm phõn on (li tõm vựng) Phng phỏp ny cho phộp phõn tỏch cỏc phn t vt cht da vokhi lng ca chỳng Cỏc phn t vt cht s di chuyn v phớa ỏy ng li tõm vi tc tu thuc lc li tõm v s ma sỏt gia chỳng vi dung dch li tõm tc tu thuc vo hỡnh dng cỏc phn t) Nh vy li tõm vựng, thu nhn mt loi phn t vt cht nht nh cn s dng mt lc li tõm v thi gian li tõm nht nh phự hp Li tõm ng t trng õy l phng phỏp phõn tỏch cỏc phn t vt cht da vo t trng gia chỳng Phng phỏp ny cho hiu qu phõn tỏch t cao, cỏc phõn on c phõn tỏch rt thun khit ng li tõm cha mt dung dch cúttrng tng dn t ming n ng to nờn mt gradient t trng T trng ca cỏc phn t cn phõn tỏch phi nm vựng gradient t trng ny Trong quỏ trỡnh li tõm, cỏc phn t vt cht s lng xung ỏy ng, n vựng dung dch cú t trng tng ng, phõn t s dng li ó t trng thỏi cõn bng Trng thỏi ny khụng thay i dự tng thi gian hay lc li tõm Cỏc loi phõn t thng c dựng thit lp gradient t trng l Saccharose hay Glycerol cn phõn on cỏc bo qua, Cesium chloride (CsCl) cn phõn tỏch protein v nucleic acide IV- THC HNH Sinh viờn quan sỏt cỏc thit b, cỏch s dng micropipette, cỏc thit b cn thit cho vic thớ nghim v ghi nh cỏc cụng thc pha ch dung dch m V YấU CU Sinh viờn cú kh nng s dng thnh tho, ỳng quy cỏch, yờu cu v mc ớch tng loi hoỏ cht, dng c, thit b cỏc quỏ trỡnh thc hnh sau ny Chp hỡnh cỏc dng c, thit b dựng thc hnh cỏc k thut di truyn v dng thnh tho tng dng c & thit b k thut di truyn Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn BI : TCH CHIT DNA THEO PHNG PHP BOOM I NGUYấN TC: Vic thu nhn DNA t mụ gan c tin hnh thụng qua nhiu bc Phõn on nhõn c cụ lp bc th nht v DNA c tỏch chittrong bc th hai ch yu da trờn k thut li tõm vựng Cỏc giai on c bn ca tỏch chit DNA bao gm: (1) Phỏ mng t bo v mng nhõn (2) Loi protein (3) Ta DNA Phỏ mng t bo v mng nhõn Mụ gan thng c s dng lm vt liu cụ lp nhõn v tỏch chit DNA vỡ t bo gan tng i ng nht v kớch thc, thớch hp cho vic phõn on k thut li tõm Ngi tacú th phỏ mng t bo bng phng phỏp hoỏ hc, c hc hay siờu õm m bo s ton cu trỳc ca cỏc bo quan, t bo c phỏ v nhng iu kin gn vi iu kin sinh lý bỡnh thng (dung dch ng trng, pH sinh lý, s hin din ca mt s Ion) Huyn phự t bo mụi trng va k cú tờn l dch ng nht (homogenate) Dch ng nht c phõn on qua li tõm, cỏc bo qua s c phõn tỏch da vo lng ca chỳng Loi protein thu nhn DNA tinh sch, ngi ta cn loi b nhng thnh phn nhim, m quan trngnht l Protein S tỏch chit da trờn nguyờn tc ho tan khỏc ca cỏc phõn t khỏc (nucleic acide / protein) hai pha khụng ho tan Phenol, chloroform) Mt s tỏc nhõn tỏch chit thụng dng l: (1) Phenol: mt cht bin tớnh protein mnh, khụng ho tan nucleic acid (2) Chloroform: thng i kốm vi phenol, cú tỏc dng b sung v loi b hon ton du vt phenol, chloroform cng lm tan bin tớnh protein nhng yu hnphennol; isoamylaclohol lm gim bt , n nh hai pha nc v chloroform sau li tõm (3) Isobutanol: cú hai cụng dng l tỏch cỏc phõn t hu c nh ethidium bromide v lm m dung dch nucleic acid Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn (4) Cng cú th túm bt Nucleic Acid bng cỏc ht Celite m khụng cn bt cỏc protein bin tớnh Kt ta DNA (DNA precipitation) Sau cụng on tỏch chit, nucleic acid c tinh sch nm mt th tớch dung dch ln S ta kt hp vi li tõm cho phộp thu nhn nucleic acid di dng cn ta d bo qun v cn cú th ho li nc tho ngn mong mun Cú cỏc kiu chớnh: - Ta bng ethanol: c thc hin nng mui cao, nng ethanol cao (2-2,5 th tớch ethanol/th tớch dung dch cn ta) Nhit thp thỳc y s ta - Ta bng isopropanol: khỏc vi kiu ta trờn l khụng cn mui, cú th s dng 0,8 th tớch isopropanol/th tớch dung dch cn ta Nhng on DNA tht ngn dự nng cao cng khụng ta bng cỏch ny nờn cú th d dng loi chỳng II- DNG C V HO CHT Hoỏ cht Dung dch Diatom - Nc ct - HCl Ht celite (diatom) Dung dch m li gii L6 - Guanidine thyocynate Tris HCl EDTA - Triton X-100 (hoac SDS 10%) Dung dch m L2 - Guanidine thyocynate - Tris HCl Triton X -100 SDS 10% Chloroform: isoamylalchohol (24:1) Dung dch TE 10X (Tris 0,1M EDTA 0,001M) Ethanol tuyt i Ethanol 70% Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn Dung dch acộtol Vt liu v dng c Mụ ng vt Eppendorf 1,5ml Eppendorf 2ml Pipetman cỏc loi 20l 100l, 200l - 1000l u tớp tng ng Pipette pasteur Que thu tinh u un cong ng nghim thu tinh Cc ng ỏ Cc ng tớp v cht thi Vi lc, dao ct Mỏy nghin Mỏy li tõm Mi nhúm chun b Eppendorf 1.5ml cha: - Dung dch L6 900l - Dung dch diatom 20 l - Huyt hoc mu mụ 100l III PHNG PHP TIN HNH Tin hnh theo cỏc bc sau Bc Nhúm trc cõn 30g mu mụ ng vt b sung 70ml nc ct, nghin nh v lm lnh ỏ Dựng vi lc lc phn nghin thu dch ng nht v tip tc c gi lnh ỏ Bc Mi nhúm b sung vo eppendorf 1.5 (cha L6 v Diatom) 100l dch ng nht, tin hnh vortex 10 phỳt sau ú ly tõm 13.000vũng/phỳt 20 giõy Bc Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn Hỳt b phn dch ni v cha khong 100l phn dch cn B sung 1ml dd L2, em ly tõm 13.000vũng/phỳt 10 giõy Tip tc lp li bc thờm hai ln na Bc Ra bng 1ml ethanol 70% (thao tỏc tng t bc 3) ln Ra ln bng 1ml acộtone Sau ú hỳt b acộtone v khụ t nhiờn Bc B sung 60l dd TE 1X em Vortex 10 phỳt; sau ú ly tõm tip 13.000vũng/phỳt 20 giõy Hỳt 200l phn dch ni (cha ADN) qua 1eppendorf khỏc v bo qun lnh IV YấU CU Mi nhúm thu nhn DNA vo mt eppendorf sch cú ghi tờn nhúm, lu tr lm nguyờn liu cho bi sau V - TR LI CU HI Nờu cỏc vai trũ v cu to ca cỏc húa cht dựng bi nh dung dch L2, L6 hay Diatom? Gii thớch ti li s dng L2, L6 hay Diatom vic tỏch chit DNA? Cú th thay th mu gan bũ thnh cỏc mu nguyờn liu khỏc khụng nh mu túc, mu da hay mu mỏu ngi? Mc ớch ca vic ly tõm hay vortex nhiu ln l gỡ? Nờu vai trũ v tỏc dng ca ethanol v acetone tỏch chit DNA Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM Bi ging Thc hnh K thut di truyn BI : TCH CHIT RNA TON PHN CA VI KHUN I NGUYấN TC: Vic tỏch chit RNA cng gm nhng bc c bn nh tỏch chit DNA : (1) Phỏ mng t bo (2) Loi protein (3) Ta RNA Nhng RNA l phõn t d b thu gii bi RNase, khú bo qun nguyờn quỏ trỡnh tỏch chit nờn thao tỏc cn tuõn thmt s nguyờn tc chung : - S dng mt s cht cú k nng bin tớnh Rnase, thụng dng nht l guanidinium thiocyanate Nc c s dng thng c x lý vi DEPC (Diethlpyrocarbonate) loi Rnase - S dng phenol pH 4.0 c ch RNase, loi protein v DNA - Thao tỏc iu kin nghiờm ngt ti a: lnh, mang gng tay, thao tỏc t cy vụ trựng Trong bi ny, phenol v guanidinium thiocyanate cú thnh phn dd Trizol l nhng cht bin tớnh protein mnh Khi x lý vi hai hoỏ cht ny, t bo vi khun s phỏ v v gii phúng cỏc thnh phn ni bo: DNA, RNA, proteinSau li tõm, dung dch vi khun x lý vi Trizol s phõn tỏch thnh hai lp: lp di l phenol cha DNA, lp trờn l nc cha RNA Phn protein b bin tớnh s nm mt phõn cỏch hai lp ny v b loi b cựng vi DNA pha phenol Ngoi tỏc dng bin tớnh protein, phenol pH 4.0 cũn cú tỏc dng hp th DNA vo pha phenol Vỡ vy, phn dch ni trờn ch cũn cha RNA RNA s thu nhn bng cỏch ta vi isopropanol lnh Phng phỏp tỏch chit RNA ny cho phộp thu nhn RNA ton phn cú cht lng m bo cho cỏc thao tỏc sinh hc phõn t tip theo II- DNG C V HO CHT Hoỏ cht Dung dch phenol pH Ethanol 70% bo qun lnh Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 10 Bi ging Thc hnh K thut di truyn BI IU CH DNA T BO NG THC VT I NGUYấN TC to dng b gen (genome) v thc hin lai (Southern hybridization) DNA ng vt cn iu ch DNA ng vt cú phõn t lng ln v ớt nhim Nhng DNA di thng d b t bi enzyme phõn gii cng nh cỏc tỏc ng c gii vt lý nờn iu ch phi s dng dng c tit trựng v trỏnh hỳt DNA bng ng hỳt cú u l nh cng nh trỏnh lc trn mnh Cú th iu ch DNA t mu vt ó c bo qun nhng nu iu ch t vt liu t chc ti mi thỡ tt hn Lng DNA thu c thng ph thuc vo loi t chc nhng thụng thng t mi gam t chc cú th thu c khong 10 mg DNA II THAO TC TIN HNH 1) Ct nh t chc nguyờn liu bng kộo n 0,1 g Nu t chc ln mỏu hoc lụng th trc bng dung dch TNM Trong trng hp mụ ung th thng ln nhiu mụ hoi t thỡ lm sch trc l cn thit Chỳ ý: thc hin trờn nc ỏ hoc ph.ng lnh trỏnh DNA b phõn gii (k c cỏc bc tip theo) Dung dch TNM cha Tris-HCl (pH 7,5) 20mM, NaCl 0,1M v MgCl2 1,5mM 2) Cho vo mi gam t chc 20 ml dung dch TNM, nghin nhuyn (bng homogenizer, nh Porter), quay li tõm 2.000 v/ph phỳt C, thu cn 3) Trỏng cn bng dung dch TNE, b nc mt Li cho ml TNE vo trn u thnh huyn dch ri b sung thờm TNE cho 20 ml, trn o u Dung dch TNE cha Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 0,1M v EDTA 1mM 4) Thờm t t SDS 10% va thờm va trn o nh cho t mc 0,3% so tng lng Thờm dung dch proteinase 10 mg/ml cho t n mc 1% so tng lng gi n qua ờm 60 C 5) Thờm lng tng ng phenol, trn o nh khong gi n ờm Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 30 Bi ging Thc hnh K thut di truyn 6) Quay li tõm 3.000 v/ph 10 phỳt, dựng pipet cú l to hỳt phn nc, trỏnh khuy ng phn phenol Li chit xut bng phenol mt ln v bng chloroform mt ln na 7) Thm tớch i lớt TE qua mt ngy ờm cú thay TE mt ln 8) Thờm RNase (DNase-free) mg/ml n mc 1/50 th tớch, 37 C gi 9) Thờm lng tng ng phenol, trn o nh gi 10) Li tõm 3.000 v/ph phỳt, hỳt ly lp nc bng pipet cú l ming ln 11) Thm tớch i TE qua ờm cú thay ngoi dch nh trờn 12) Cho DNA thu c vo ng cht do, bo qun C Vi DNA ng vt cú th bo qun - nm iu kin ny III KT QU TH NGHIM Mi sinh viờn theo dừi kt qu in di ca nhúm, phõn tớch kt qu thu c, np bi bỏo cỏo Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 31 Bi ging Thc hnh K thut di truyn BI 10: K THUT PHN TCH PLADMID BNG PHNG PHP CT GII HN I- MC CH Enzyme ct gii hn thng c s dng sinh hc phõn t v k thut di truyn l cỏc enzyme ct gii hn thuc nhúm II Cỏc enzyme ny cú kh nng nhn bit mt trỡnh t nucleotide xỏc nh v ct DNA ti trỡnh t nhn bit ú Cụng dng ca cỏc enzyme ct gii hn l ct phõn t DNA thnh nhng on DNA ngn hn Do vy, vi s h tr ca mt s k thut sinh hc phõn t khỏc, cỏc nh nghiờn cu ó s dng ct gii hn cho nhiu mc ớch thao tỏc, phõn tớch DNA khỏc nh: ct ni DNA to DNA tỏi t hp, phõn tớch tỏi t hp, t bin, a dng di truyn Trong phm vi bi thc hanh ny, enzyme ct gii hn c s dng nhm phõn tớch plasmid Plasmid c ct bng enzyme ct gii hn kim tra dung dch plasmid thu c l plasmid cn thu nhn hay khụng Phng phỏp phõn tớch DNA v vector tỏi t hp cha DNA bng phn ng ct gii hn cú th c ng dng cho cỏc trng hp sau: - Kim tra dung dch vector, plasmid thu c sau nhõn bn in vivo t bo ch - Kim tra vector tỏi t hp thu c sau c thao tỏc ct ni bng enzyme ct gii hn ú II- NGUYấN TC Trong s phõn tớch plasmid bng phng phỏp ct gii hn, u tiờn, plasmid c ct bng mt hay mt s enzyme ct gii hn thớch hp Sn phm ct c in di gel agarose Vic phõn tớch s lng v di cỏc on DNA thu c sau phn ng ct s cho thụng tin cn thit v plasmid cn kim tra phõn tớch plasmid bng phn ng ct gii hn cn phi cú thụng tin v bn enzyme ct gii hn ca plasmid quan tõm Da vo bn enzyme ct gii hn, s lng v loi enzyme thớch hp c chn la cho phn ng ct kim tra plasmid III- PHNG PHP TIN HNH Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 32 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Sinh viờn thc phõn tớch bn enzyme ct gii hn ca plasmid pBluescript v chn cỏc enzyme ct gii hn thớch hp cho phn ng ct kim tra plasmid pBluescript dung dch DNA thu c sau tỏch chit plasmid t t bo ch E.coli DH5 Thc hanh phn ng ct gii hn vi enzyme ó chn Phõn tớch sn phm ca phn ng ct bng in gi gel agarose Ghi nhn kt qu Vt liu, dng c, thit b Dung dch DNA thu c bi trc 01 eppendorf 1,5ml Pipettman cỏc loi: 0,5-10àl; 2-20 àl, 20-100 àl + u tớp Nc ct vụ trựng Enzyme ct gii hn, dung dch m (buffer) Chu thy tinh Cc thy tinh 100, 250 ml Agarose Dung dch TAE 1X, 50X B in di T m 37oC hay B n nhit (Water Bath) Thc hnh Da vo bn plasmid ca pBlueScript, sinh viờn thc chn enzyme ct gii hn s dng cho phn ng ct kim chng plasmid D on kt qu thu c s dng enzyme ó chn cho phn ng kim chng Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 33 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Sinh viờn tin hnh thc hin cỏc phn ng ct gii hn theo cỏc bc sau: Chun b hai (2) eppendorf sch bng vic cn ethanol 70o sau ú sy khụ nhit 120oC Thit lp phn ng ct vi thnh phn nh sau: DNA plasmid 1àg Dung dch m (10X) 2,0 àl Enzyme ct gii hn 0,5 àl Nc ct b sung cho n th tớch 6,5 àl hn hp ny 2h hoc qua ờm B sung dung dch m chy mu (loading buffer) Chy gel in di agarose, quan sỏt v thu nhn kt qu Tin hnh cỏc nhúm DNA ó c tinh sch v tỏch chit vi cỏc i tng: DNA thc vt, ng vt, nm men, mỏu IV- KT QU TH NGHIM Mi sinh viờn theo dừi kt qu in di ca nhúm, phõn tớch kt qu thu c, np bi bỏo cỏo Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 34 Bi ging Thc hnh K thut di truyn BI 11 CC PHNG PHP THU HI ON DNA T GEL IN DI II NGUYấN TC Nu cú nhu cu s dng cỏc phõn on DNA ó c phõn li v tinh ch nh in di cho cỏc thớ nghim tip theo, ngi ta nhn thy vic thao tỏc thu hi DNA t gel l cn thit Cú mt s phng phỏp thu hi DNA c trỡnh by v chỳng cú nhng u im v nhc im nht nh nh thi gian thao tỏc, phc v t l thu hi, cng nh kh nng ln cỏc polymer hũa tan hoc cỏc cht hn cú gel agarose v gel polyacrylamide lm cn tr n cỏc phn ng s thc hin thớ nghim sau ú Phng phỏp dựng giy DEAE cn thi gian ngn v lng cht hn tng i ớt nhng t gel polyacrylamide t l thu hi cỏc on DNA di hoc DNA mt si thng thp Phng phỏp thu hi nh in di cú th thc hin thu hi DNA t gel agarose cng nh polyacrylamide nhng lng thu hi c di dng dung dch vi lng tng i ln cn phi cụ c, cho nờn cht hn ln nhiu Hn na, t gel agarose vic thu hi thng khú khn Phng phỏp hi thu t agarose tan chy nhit thp cú th thu hi DNA thi gian ngn thao tỏc cng n gin, t l thu hi cao khụng ph thuc vo ln ca cỏc on DNA nhng hn nhiu III CC BC TIN HNH Phng phỏp s dng giy DEAE (DE 81) 1) Trong in di DNA gel agarose (cú ethidium bromide gel hoc pha dch m in di), quan sỏt cỏc bng DNA ớch di UV thy bng ú ó phõn li hon ton thỡ dựng dao ct thnh rónh trc v sau bng DNA ri chốn giy Whatman DE 81 vo ú 2) Tip tc in di cho n bng DNA bỏm ht vo giy DE 81 thỡ ct in 3) Ly giy DE 81 gel, cho vo ng Eppendorf 0,5 ml c chc thng ỏy (hoc ng bm tiờm ml) ri lp vo mt ng li tõm ln hn (nh ng Eppendorf 1,5 ml i vi ng 0,5 ml, hoc ng li tõm 10 ml i vi bm tiờm ml) ri cho vo ú mt lng dung dch m TAE cú 50 mM NaCl, quay li tõm v lp li ln nh vy sch Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 35 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Dung dch m TAE cú 50 mM NaCl cha Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 50mM (khụng hũa tan DNA) 4) Thờm 100 ml TE cha NaCl 1M, quay li tõm nh ri yờn cho ngm u vo giy DE khong phỳt, sau ú li tõm li lm cho dung dch m thoỏt xung ht Lp li ba ln cho DNA thoỏt ht giy DE theo dung dch m 5) Chit xut bng phenol v bng chloroform mi th mt ln loi b cht ri kt ta bng ethanol ba ln mi ln u kt ta nhit 70C ri quay li tõm thu hi Phng phỏp thu hi bng in di 1) Xỏc nhn cỏc bng DNA (bng UV vi gel ó nhum ethidium bromide) ri ct bng DNA ớch hon ton phõn li gel Cho mu gel ú vo tỳi thm tớch ó buc k mt u, cho dung dch m ngm u ri kp u cũn li 2) t tỳi thm tớch vo chu in di nm ngang cho hng in di vuụng gúc vi tỳi thm tớch 3) C vy m in di vi in ỏp 100 - 200 V, soi di UV xỏc nhn bng DNA ó thoỏt ht gel tng thu hi cn in di ngc chiu vi phỳt (cho DNA ó bỏm vo tỳi thoỏt ngc tr li dung dch) ri m tỳi hỳt ht dch (nhng cn trỏnh hỳt gel) cho vo ng nghim, chit xut bng phenol v chloroform ri kt ta bng ethanol thu hi DNA Phng phỏp chit xut DNA t gel nghin (t gel polyacrylamide) 1) Xỏc nhn (bng UV) v trớ DNA ó phõn li cn thu hi, ct thu ly gel 2) Cho mu gel vo ng ml, nghin nỏt, hoc cho vo ng Eppendorf ri dựng a thy tinh nghin nỏt 3) Cho gel nỏt vo ng nghim ri cho vo ú dung dch m dung xut (thng l lng ngp khụng quỏ ln lng gel, nhiu hay ớt tựy nng ca DNA gel), my gi cho n qua ờm 37 oC (nu cn, lng nh DNA khú to kt ta thỡ thờm RNA nm men n nng 10 àg/ml) Dung dch m dung xut cha ammonium acetate nng 500mM, MgCl2 10mM, EDTA 1mM v SDS 1% 4) Li tõm nh ri thu ly nc mt, dựng ct DEAE cellàlose tinh ch, cụ c (xem phn sau) Chit xut bng phenol-chloroform ri chloroform v sau ú kt ta bng ethanol thu hi DNA Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 36 Bi ging Thc hnh K thut di truyn 3.4 Thu hi t gel agarose tan chy nhit thp mt s hóng (nh BioRad, Takara ) sn xut v phỏt mi 1) Ch gel nờu trờn bng cỏch pha vo dung dch m, lm tan chy khong 70 a ethidium bromide khong 37 oC ri bn gel, h nhit cho gel tr nờn cng 2) in di vi in ỏp thp trỏnh tng nhit lm tan chy gel 3) Soi UV vi s tr giỳp ca ethidium bromide, ct bng DNA ớch ó phõn li 4) Thờm vo ln TE, 65oC cho gel tan chy 5) Thờm mt lng tng ng phenol-chloroform, trn u ri quay li tõm thu ly nc mt ri chit xut bng chloroform ln na 6) Kt ta bng ethanol thu hi DNA Chỳ ý: mt s hóng ó sn xut v phỏt mi kit thu hi DNA bng cỏch nghin v lm tan gel agarose thụng thng Chng hn "QIAquick Gel Extraction Kit" ca hóng QIAGEN Co dựng mỏy li tõm c nh cao tc, cú th chit xut v lm sch cỏc on DNA di t 70 bp n 10 kb t gel (thụng thng cng nh núng chy thp) in di dung dch m TAE hoc TBE B kit ny gm dung dch QG (mu vng), dung dch PE, dung dch m EB, ethanol, cỏc ct hp ph (QIAquick spin column) v ng cha ml Cỏc bc thu hi DNA nh sau: 1) Ct bng DNA gel bng mt li dao sc (trong soi di ốn UV nng lng thp) B phn gel d tha n mc ti a 2) Cõn lỏt gel ng Eppendorf 1,5 ml (khụng mu) Thờm vo ú ln th tớch m QG (l mu vng ca kit) 3) 50 C khong 10 phỳt cho n gel tan hon ton Thnh thong trn xoỏy cho gel tan d dng hn 4) Sau gel tan hon ton, kim tra mu ca dung dch, mu vng nh mu dung dch QG nguyờn gc l c Nu mu hn hp da cam hoc tớm thỡ thờm 10 l (cho trng hp 100 mg gel) sodium acetate pH 5,0, mu s chuyn li sang mu vng 5) Thờm th tớch isopropanol bng lng gel ban u vo v trn u hn hp giỳp tng kh nng thu hi DNA nh hn 500 bp hoc ln hn 4kb Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 37 Bi ging Thc hnh K thut di truyn 6) t mt QIAquick spin column (ct) vo mt ng thu hi (u cú sn) 7) Rút hn hp vo ct v quay li tõm phỳt cho DNA hp ph vo ct Chỳ ý: th tớch ti a ca ng cha l 800 l, nu dch tha th ti lờn ct ln na ri li li tõm thờm phỳt 8) B dch qua ct ri t ct li vo ng cha 9) Thờm ethanol (96 - 100%) vo dung dch PE cú sn trc dựng Cho 0,75 ml PE ny vo ct, - phỳt, quay li tõm phỳt 10) B nc thoỏt qua, lp ct li vo ng cha v li tõm thờm phỳt 10.000 ìg loi b hon ton ethanol 11) t ct vo mt ng li tõm 1,5 ml sch 12) trớch li DNA, thờm 50 l dung dch m EB (Tris.HCl, 10mM) hoc nc ct vo gia ct, hoc nu cn tng nng DNA thỡ cho 30 l dch dung xut (elution solution) yờn phỳt, ri quay li tõm phỳt tc ti a (thng 10.000 ìg hay 13.000 v/ph) Chỳ ý: dung dch DNA nc cn pH 7,0 - 8,0 v d b phõn hy hn dung dch m nờn cn bo qun 20 C Dựng TE dung xut cng c nhng EDTA (trong thnh phn ca TE) cú th gõy tr ngi cho cỏc phn ng enzyme Cng cú th s dng Prep-A-Gene DNA Purification System (hóng BioRad) vi nhng ht hp ph Prep-A-Gene matrix tinh ch DNA t bng agarose gel thụng thng III KT QU TH NGHIM Mi sinh viờn theo dừi kt qu in di ca nhúm, phõn tớch kt qu thu c, np bi bỏo cỏo Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 38 Bi ging Thc hnh K thut di truyn BI 12: K THUT PCR TRONG PHN TCH DếNG DNA TI T HP I MC CH PCR l k thut c ng dng rng rói nhm khuch i mt trỡnh t DNA sau quỏ trỡnh tỏch chit, kim tra gen mc tiờu cú plasmid tỏi t hp hay kim tra cu trỳc, trng thỏi ca on DNA Ni dung ca bi thc ny nhm khng nh s hin din ca DNA mc tiờu plasmid tỏi t hp bờn dũng tỏi t hp da theo nguyờn tc phn ng PCR vi cp mi chuyờn bit cho gen mc tiờu hoc cp mi chuyờn bit cho vựng trỡnh t gen mc tiờu Phng phỏp PCR cho phộp kim tran hanh s hin din ca on DNA ú II NGUYấN TC PCR (Polymerase Chain Reaction) l mt k thut ph bin sinh hc phõn t nhm nhõn bn (to nhiu bn sao) mt on DNA ng nghim mụ phng b mỏy sinh tng hp DNA ca t bo sng K thut ny c s dng rng rói cỏc nghiờn cu sinh hc v y hc phc v nhiu mc ớch khỏc nhau, nh phỏt hin cỏc bnh di truyn (genetic diseases), nhn dng võn tay DNA (DNA fingerprinting), chun oỏn nhng bnh nhim trựng (Infectious , tỏch dũng gene, v xỏc nh huyt thng Cỏc thnh phn phn ng PCR Enzyme Cỏc c tớnh enzyme DNA polymerase v nh ngha n v (unit) ca mi loi (hóng) sn xut l khỏc Cn kim tra thụng tin trờn cỏc t hng dn i kốm húa cht Lng enzyme cn thit l ph thuc vo lng DNA template v kớch thc phn ng PCR Tuy nhiờn, thnh phn ny ch nờn hiu chnh 1) sn phm PCR ln hn 5kb; 2) cú kh nng hot tớnh ca enzyme b gim sỳt thiu sút khõu bo qun; 3) ó tin hnh hiu chnh bng nhiu cỏch nhng sn phm PCR thp hoc khụng cú gỡ Khụng nờn tng enzyme quỏ 2U (5àl) trờn 50 àl tng th tớch phn ng Vic thay i loi DNA polymerase cú th lm thay i hiu sut ca phn ng PCR Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 39 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Khi tớnh toỏn chin lc cloning bng h thng TA vector, cn lu ý DNA polymerase cú c tớnh to u treo A u 3' hay khụng Nu khụng thỡ cn phn ng b sung s dng Klenow v ATP Tớnh chớnh xỏc ca enzyme DNA polymerase ph thuc vo hot tớnh 35 exonuclease Tựy thuc mc ớch thớ nghim m cn la chn loi DNA polymerase cú hay khụng cú hot tớnh ny Cỏc dung dch m (Buffers) Hiu sut, tớnh chớnh xỏc ca enzyme DNA polymerase ph thuc nhiu vo h buffer s dng Thụng thng nờn s dng ỳng loi buffer tng ng vi enzyme nh sn xut khuyn cỏo Mt s buffer cha cht hot ng b mt cú th nh hng n cỏc phn ng microarray hoc DHPLC Nhiu loi buffer ó cú sn mt lng nht nh ion Mg2+ nờn cn lu ý ti u húa nng Mg2+ Nng Mg2+ v dNTP Vic tng nng ion Mg2+ cú th lm xut hin thờm cỏc sn phm khụng c hiu Tuy nhiờn nu thiu ion Mg2+ thỡ dn n lng sn phm PCR thp Nng ion Mg2+ ti u ph thuc vo loi DNA polymerase, loi DNA template v thnh phn buffer (mt s buffer thng mi ó cú sn lng nht nh ion Mg2+) Dũ tỡm nng Mg2+ ti u thụng thng bng gradien nng t 0.5 n mM vi cỏc khong cỏch mi bc l 0.2 mM dNTPs l loi húa cht kộm bn cn lu ý s dng v bo qun Nờn chia nh lng dNTPs gim s ln lm tan, s dng li Lng dNTP ti u l 200 àM of mi loi dNTP Vic tng dNTP khụng lm tng ỏng k lng sn phm PCR so vi vic hiu chnh cỏc yu t khỏc DNA khuụn (Template) v mi (Primers) Nng ti u DNA template l t 1) i vi cỏc mu DNA tng i ng nht (plasmid, lambda hoc BAC DNA): pg - 10 ng / 50 àl tng th tớch phn ng; 2) i vi mu DNA genome thỡ t 50 - 500 ng/50 àl tng th tớch Nng primer thng ti u 10 mM mi loi Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 40 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Cht khỏc i vi cỏc DNA template ln, giu GC thỡ cú th s dng cỏc cht bin tớnh nh DMSO, formamide, glycerol, and betaine thnh phn PCR Tuy nhiờn, phi kim tra tng thớch i vi enzyme DNA polymerase Tng lng DMSO PCR s cn gim nhit bt mi xung Mt s buffer ó cú cha sn loading buffer cú th in di sau PCR Tuy nhiờn, nhy ca PCR vi nhng buffer ny khụng cao i vi cỏc mỏy luõn nhit (thermocycler) khụng cú gia nhit trờn np thỡ nờn b xung mineral oil trỏnh bay hi mu III NI DUNG THC HNH Vt liu, dng c, thit b - 02 eppendorf 0,5 ml vụ trựng - Giỏ dng eppendorf - 01 eppendorf cha mi xuụi (Forward Primer) - 01 eppendorf cha mi ngc (Reverse Primer) 01 eppendorf cha dung dch m cho phn ng PCR 01 eppendorf cha dung dch dNTPs 8mM 01 eppendorf cha dung dch MgCl2 25mM - 01 eppendorf cha enzyme Taq DNA polymerase (luụn c gi thựng xp cha ỏ quỏ trỡnh thớ nghim) - 01 eppendorf cha nc ct vụ trựng hai ln - Chu thy tinh ng nc ỏ - Pipettman cỏc loi: 0,5-10àl, 2-20 àl, 10-100 àl, 100-1000 àl + cỏc u tớp tng ng Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 41 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Thao tỏc thc hnh Thit lp phn ng PCR eppendorf 0,5ml vi th t b sung cỏc thnh phn v th tớch di õy Dung dch m Taq polymerase 10X cho phn ng PCR àl MgCl2 25mM Dung dch hn hp dNTPs (8mM cho mi loi dNTP) àl àl Taq DNA Polymerase (5U/àl) Mi xuụi (10 um/àl) 0.5àl àl Mi ngc (10 um/àl) DNA khuụn (10-100ng/àl) àl 9,5 àl Nc ct ln b sung (n th tớch t 30 àl) t cỏc eppendorf ó b sung y cỏc thnh phn phn ng nờu trờn vo mỏy PCR v ci chng trỡnh nhit cho phn ng PCR vi 25 chu k in di gel agarose v quan sỏt kt qu trờn bn chiu UV soi ni Nhng on DNA tỏi t hp s cú biu hin trờn gel chp v sinh viờn phi gii thớch kt qu thu c Lu ý: - DNA trc chy PCR phi c gi lnh chu nc ỏ hon - thnh bt k cụng on no Thao tỏc phi c thc hin iu kin hon ton vụ trựng IV KT QU TH NGHIM Mi sinh viờn theo dừi kt qu in di ca nhúm, phõn tớch kt qu thu c v gii thớch, np bi bỏo cỏo Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 42 Bi ging Thc hnh K thut di truyn PH LC Cỏch pha ch cỏc húa cht CTTH Commassie brilliant blue - R250 2%: C45H44N3NaO7S2 (Sodium salt) CCH CHUN B TAE Chun b stock ca EDTA cú 500 ml dung dch m EDTA 0,5M, cõn 93.05g EDTA disodium salt (FW=372.2) Hũa tan 400 ml nc ct v iu chnh pH=8.0 bng NaOH y dung dch t 500ml bng nc ct Chun b dung dch m TAE To dung dch m TAE m c (50X) bng cỏch cõn 242g Tris baz (Tris Base, FW=121.14) v hũa tan khong 750ml nc ct Cn thn thờm 57.1ml acid acetic dng bng (glacial acetic acid) v 100ml EDTA 0.5M (pH 8.0) v nc ct y n t th tớch 1L Dung dch m ny cú th cha nhit phũng pH dung dch ny khụng cn phi iu chnh v pH trung bỡnh khong 8.5 Chun b dung dch hot ng cho TAE iu kin dung dch hot ng TAE 1X c chun b d dng bng dung dch m bng vic pha loóng 50x (ln) vi nc ct Nng cui cựng c o l khong 40 mM Tris acetate v mM EDTA V nng dung dch bõy gi ó sn sng cho vic chy Agarose gel m chy mu (loading buffer): 100% glycerol: 50ml TE 10X 50ml Bromophenol blue hoc commassive blue 0,015g Tris-HCl 20mM Tris-HCl, pH 7.5 Dung dch phỏ v t bo v tỏch ADN: Dung dch L6: 120 gr Guaniginum thiocyanate GuSCN (Fluka, Thy s) pha 100ml 0,1M Tris HCl, pH 6.4 + 22ml EDTA 0,2M v 2,6ml Triton X-100; hp t kh trựng 1200Cx20 phỳt Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 43 Bi ging Thc hnh K thut di truyn Dung dch L2: 10 gr GuSCN /100ml Tris HCl 0,1M, pH 6.4; hp t kh trựng 1200Cx20 phỳt Hn dch Diatom (celite): 10 gr pha 50ml H2O + 500àl HCl 32% (hoc 445àl HCl 36%) Khoa CNSH & KTMT H CNTP TPHCM 44 [...]... kết quả điện di của nhóm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo V CÂU HỎI 1 So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide trong kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 18 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2 Hãy cho biết ứng dụng 1 số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và polyacrylamide mà em biết trong thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật di truyền ? (3... kết quả điện di của nhóm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo X CÂU HỎI 1 So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide trong kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 22 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Hãy cho biết ứng dụng 1 số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và polyacrylamide mà em biết trong thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật di truyền ? (3 ứng... trong 15 phút Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 11 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bƣớc 5 Hút bỏ dịch nổi, bảo quản lạnh âm IV – U CẦU Mỗi nhóm thu nhận RNA vào một eppendorf sạch có ghi tên nhóm, lưu trữ để làm ngun liệu cho bài sau Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 12 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 4 ĐỊNH LƢỢNG NUCLEIC ACID BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG I - NGUN TẮC Ánh sáng khi đi... III KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhóm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 31 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 10: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH PLADMID BẰNG PHƢƠNG PHÁP CẮT GIỚI HẠN I- MỤC ĐÍCH Enzyme cắt giới hạn thường được sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền là các enzyme cắt giới hạn thuộc nhóm II Các enzyme... ĐH CNTP TPHCM 15 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 5 : PHÂN TÍCH DNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS) I NGUN TẮC Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào có di n tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn Kỹ thuật này thường... ĐH CNTP TPHCM 19 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 6: PHÂN TÍCH RNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS) VI NGUN TẮC Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào có di n tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn Kỹ thuật này thường... đệm chạy mẫu (loading buffer) Chạy gel điện di agarose, quan sát và thu nhận kết quả Tiến hành các nhóm DNA đã được tinh sạch và tách chiết với các đối tượng: DNA thực vật, động vật, nấm men, máu… IV- KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhóm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 34 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 11 CÁC PHƢƠNG... chloroform và chloroform với NaCl lớn hơn 0,1M v DNA nhỏ có thể hòa tan trong phenol III KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhóm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 25 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 8 ĐIỀU CHẾ DNA PHAGE BẰNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI I NGUN TẮC Bằng vector cosmid hoặc plasmid có thể sàng lọc và tạo dựng được thư... di nằm ngang Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di có thể quan sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu qua đối với UV) - Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đơi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleotide (cặp base – bp) Các Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 20 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền. .. sử dụng enzyme đã chọn cho phản ứng kiểm chứng Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 33 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Sinh viên tiến hành thực hiện các phản ứng cắt giới hạn theo các bước sau: Chuẩn bị hai (2) eppendorf sạch bằng việc rửa cồn ethanol 70o sau đó sấy khơ ở nhiệt độ 120oC Thiết lập phản ứng cắt với thành phần như sau: DNA plasmid 1µg Dung dịch đệm (10X) 2,0 µl Enzyme cắt giới hạn 0,5 ... polyacrylamide kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 18 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Hãy cho biết ứng dụng số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose polyacrylamide mà em biết thực. .. polyacrylamide kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 22 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Hãy cho biết ứng dụng số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose polyacrylamide mà em biết thực. .. thực tiễn nghiên cứu kỹ thuật di truyền ? (3 ứng dụng) Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 19 Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 6: PHÂN TÍCH RNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)