1. Chuẩn bị giống VSV nuơi cấy
Để nuơi cấy thu phage với hiệu giá cao nhất cần biết titre của phage trong dịch dung khuẩn và chuẩn bị giống vi sinh vật thực hiện việc điều chế DNA
1) Trộn 0,1 ml vi khuẩn E. coli được chuẩn bị trước với 0,1 ml dịch dung
khuẩn của phage đ. được pha lỗng trong dung dịch SM để cĩ nồng độ 100 pfu (plaque-forming unit). Ủ ở 37oC trong 10 phút.
Dung dịch SM chứa 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 25 ml Tris-HCl 2M (pH 7,5), 5 ml gelatin 2%, thêm nước cất cho đủ 1 lít rồi hấp cao áp tiệt trùng.
2) Sau đĩ, rĩt 2,5 ml dịch agar phủ (agar nửa lỏng, top agar) để làm nguội đến 50ºC. Đổ ra đĩa petri chứa mơi trường LB.
3) Để ở nhiệt độ phịng 15 phút, khi agar phủ hồn tồn hĩa rắn thì ủ ở 4) Đếm số plaque, tính tốn hiệu giá phage của dịch dung khuẩn.
2. Điều chế lƣợng nhỏ DNA phage
Đối với các thí nghiệm như làm bản đồ enzyme hạn chế các d.ng thuần của phage đã được sàng lọc thư viện cũng như lai phân tử th. lượng DNA phage cần thiết khơng nhiều, thường dùng lượng DNA chế từ 5 ml mơi trường lỏng. Nếu cần điều chế lượng phage lớn hơn thì tăng số lượng ống nuơi cấy.
2.1. Phƣơng pháp điều chế dịch phage dung khuẩn
1) Dùng tăm (hoặc đầu pipet) vơ trùng lấy một plaque duy nhất đ. sàng lọc được genomic liabrary hoặc cDNA liabrary khuấy vào 100 ml mơi trường SM.
Mơi trƣờng SM chứa 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 25 ml Tris-HCl 2M (pH 7,5), 5 ml gelatin 2%, thêm nước cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng. 2) Để một giờ ở nhiệt độ ph.ng.
3) Cho vào 20 ml vi khuẩn đ. bồi dưỡng qua đêm, để 15 phút ở 37 ºC.
4) Thêm 5 ml mơi trường NZYM, bồi dưỡng qua đêm ở 37 ºC. Cuối cùng mơi
trường trở nên trong mặc dù khơng hồn tồn và quan sát thấy các mẫu cặn phân giải của vi khuẩn.
Mơi trƣờng NZYM chứa 10,0 g NZ amine, 5,0 g NaCl, 5,0 g cao nấm men (yeast extract), 2,0 g MgSO4.7H2O, chế thêm nước cất cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng.
5) Thêm 100 ml chloroform, trộn đảo 15 phút.
6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong v.ng 10 phút, hút lấy nước mặt (dịch phage dung khuẩn) chuyển qua ống khác.
7) Với phương pháp này cĩ thể thu được phage với hiệu giá cao đến 1010
pfu/ml.
1. Điều chế lƣợng lớn DNA phage
Sau khi cĩ dịng thuần đoạn DNA được xác nhận nhờ lượng nhỏ DNA phage, việc phân tích dịng thuần tiếp sau đĩ thường cần điều chế lượng lớn DNA phage. Để thu lượng lớn dịch phage dung khuẩn cĩ phương pháp dung giải dịch thể và dung giải trên đĩa (plate lysation). Phương pháp dung giải dịch thể đơn giản và cĩ thể thu được DNA với lượng lớn nhưng nhiều clone khơng thu được dịch phage dung khuẩn với hiệu giá cao. Phương pháp dung giải trên đĩa mất thời gian nhưng là phương pháp khơng bị ảnh hưởng bởi tính cá thể của từng clone của phage.
3.1. Phƣơng pháp chế dịch phage dung khuẩn
1) Cho vào 5 ml E. coli đã bồi dưỡng chuẩn bị trước 5 ml dịch phage dung khuẩn đã pha lỗng bằng SM nồng độ 1 - 5×109
pfu/ml, ủ ở 37 °C trong 10 phút. 2) Thêm 1 lít mơi trường NZYM, ủ 1 đêm ở 37 °C.
3) Khi xác nhận sự dung khuẩn thì thêm 5 ml chloroform, đảo trộn 10 phút. 4) Quay li tâm 5.000 v/ph trong 10 phút, lấy nước mặt.
5) Đo hiệu giá của dịch dung khuẩn. Lượng phage 1013
pfu chứa khoảng 500 μg DNA.
3.1.2. Phương pháp dung giải trên đĩa
1) Thêm 0,1 ml SM chứa 105 - 106 pfu phage vào 0,1 ml E. coli đ. bồi dưỡng qua đêm, ủ 10 phút ở 37 °C. Để cĩ lượng phage lớn cần khoảng 10 - 50 đĩa Petri. 2) Thêm 2,5 ml top agar (agar mềm) ở 50 °C, trộn rồi san ra các đĩa LB (cĩ mặt ẩm thì tốt hơn).
3) Chờ top agar rắn, lật đĩa lại, cho vào túi chất dẻo và ủ ở 37 °C.
4) Sau 6 - 7 giờ bắt đầu xuất hiện dung khuẩn. Khi đã thấy dung khuẩn thì cho vào mặt mơi trường 5 ml SM, rồi nhỏ lên một số giọt chloroform.
5) Khi SM lan hết mặt thạch, đặt đĩa thạch ở 4 °C qua đêm.
6) Dùng pipet Pasteur hút hết SM trên mặt thạch. Từ mỗi đĩa cĩ thể thu 1011
pfu phage. Cĩ thể thu được nhiều hơn nếu lấy cả top agar nhưng DNA này thường lẫn tạp chất khĩ thực hiện một số phản ứng như cắt bằng enzyme hạn chế.
3.2. Điều chế DNA
1) Thêm dung dịch NaCl 1M - PEG 6000 10% vào dịch phage dung khuẩn cho đến lượng 10%, làm cho hịa đều.
2) Để 1 giờ ở 0 °C.
3) Quay li tâm 5.000 v/ph ở 4 °C trong v.ng 20 phút. Bỏ nước mặt.
4) Thêm vào cặn của 1 lít dịch phage dung khuẩn 5 ml dung dịch chứa Tris-HCl 20mM (pH 7,5) và MgSO4 10mM, sau đĩ thêm 50 ml DNase I (10 mg/ml), trộn đều.
5) Thêm 5 ml chloroform, trộn đảo đều.
6) Quay li tâm 8.000 v/ph trong 15 phút ở 15 ºC. Hút lấy nước mặt. Từ đây cĩ thể vận dụng một số phương pháp tinh chế DNA. Dưới đây là biến thể cĩ sử dụng máy li tâm siêu tốc (đương nhiên, cĩ thể thay thế bằng các phương pháp khác điều chế DNA mơ tả ở trên).
7) Cho vào ống li tâm siêu tốc bằng chất dẻo (như Hitachi 13 CN) ba lớp CsCl cĩ nồng độ khác nhau: lớp dưới cùng 1,5 ml chứa 95 g CsCl trong 75 ml SM, lớp tiếp theo 2 ml chứa 67 g CsCl trong 82 ml SM và lớp thứ ba (trên cùng) 2 ml chứa 60 g CsCl trong 85 g SM. Tỷ trọng tương ứng là 1,45, 1,5 và 1,7). Cho 2 ml mẫu DNA phage lên trên lớp thứ ba.
8) Quay li tâm 36.000 v/ph trong 60 phút ở 15 °C (với máy Hitachi RPS 40 T chẳng hạn).
9) Băng DNA hình thành giữa ống được thấy r. khi soi dưới UV. Lấy kim và bơm tiêm hút lớp này.
10) Thẩm tích đối 1 lít dung dịch Tris 10mM (pH 7,5) và MgSO4 10mM trong 3 giờ.
11) Nếu tổng lượng là 1 ml th. cho vào đĩ 10 ml SDS 10%, 100 ml NaCl 5M, 500 ml phenol và 500 ml chloroform, trộn đảo từ từ trong 30 phút.
12) Li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút. Lấy nước mặt. 13) Thêm 1 ml chloroform, trộn đảo nhẹ trong 30 phút. 14) Li tâm 5 phút 3.000 v/ph.
15) Thêm sodium acetate 3 M với lượng 10% so với mẫu và ethanol gấp hai lần mẫu, để lạnh trên nước đá 10 - 30 phút, quay li tâm thu cặn DNA.
16) Rửa cặn DNA bằng ethanol 70%, để khơ.
17) Pha TE hoặc nước cất theo nồng độ mong muốn.
III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo.
BÀI 9
ĐIỀU CHẾ DNA TẾ BÀO ĐỘNG -THỰC VẬT THỰC VẬT
I. NGUYÊN TẮC
Để tạo dựng bộ gen (genome) và thực hiện lai (Southern hybridization) DNA động vật cần điều chế DNA động vật cĩ phân tử lượng lớn và ít tạp nhiễm. Nhưng do DNA dài thường dễ bị đứt bởi enzyme phân giải cũng như các tác động cơ giới - vật lý nên khi điều chế phải sử dụng dụng cụ để tiệt trùng và tránh hút DNA bằng ống hút cĩ đầu lỗ nhỏ cũng như tránh lắc trộn mạnh. Cĩ thể điều chế DNA từ mẫu vật đã được bảo quản nhưng nếu điều chế từ vật liệu tổ chức tươi mới thì tốt hơn. Lượng DNA thu được thường phụ thuộc vào loại tổ chức nhưng thơng thường từ mỗi gam tổ chức cĩ thể thu được khoảng 10 mg DNA.